氨基化細(xì)菌纖維素載體的制備及其固定β-半乳糖苷酶

程浩， 陳勇， 應(yīng)漢杰

(南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院， 江蘇南京211800)

摘要：利用二氯亞砜和乙二胺對(duì)細(xì)菌纖維素薄膜進(jìn)行氯化和氨基化制備氨基化細(xì)菌纖維素薄膜，并以該薄膜作為載體固定β-半乳糖苷酶，研究載體的結(jié)構(gòu)性質(zhì)和固定化酶的制備條件及相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)。通過元素分析、紅外光譜和X線光電子能譜等分析方法來表征載體性質(zhì)。結(jié)果顯示，有大量氨基接入細(xì)菌纖維素表面。最佳的固定化酶的條件：戊二醛添加量4 g/L，固定化時(shí)間3 h，酶添加量3 mg/mL，pH7.0和交聯(lián)時(shí)間90 min，此條件下，最高酶活回收率為78.4%，吸附酶量為63.1 mg/g。與游離酶相比，固定化酶的最適溫度為40 ℃，比游離酶高10 ℃，最適pH提高0.5，有向堿性方向移動(dòng)的趨勢(shì)，重復(fù)使用7次后剩余77.8%的相對(duì)酶活力。

關(guān)鍵詞：氨基化; 細(xì)菌纖維素; 固定化;β-半乳糖苷酶

doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2015.06.007

收稿日期：2014-11-06

基金項(xiàng)目：國家杰出青年基金(21025625);國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)(2013CB733602);國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)(2012AA021203);國家科技支撐計(jì)劃(2012BAI44G01);國家自然科學(xué)基金面上基金(21376118);國家自然科學(xué)基金青年基金(21106070)；長江學(xué)者和創(chuàng)新發(fā)展計(jì)劃(PCSIRT)；江蘇省自然科學(xué)基金(SBK20150207)

作者簡介：程浩(1988—)，男，河南南陽人，碩士研究生，研究方向：生物化工;應(yīng)漢杰(聯(lián)系人)，教授，E-mail:yinghanjie@njtech.edu.cn

中圖分類號(hào)：Q814

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1672-3678(2015)06-0036-07

Abstract：Sulfoxide chloride and ethylenediamine were used to conduct the chlorination and amination of bacterial cellulose for the immobilization of β-galactosidase. Immobilization conditions, the enzymatic properties and microstructure of immobilized β-galactosidase were studied. Elemental analysis,infrared spectrum and X-ray photoelectron spectroscopy confirmed the presence of abundant amino groups on the surface of bacterial cellulose. Results showed that the maximum recovery of enzyme activity and the amount of immobilized β-galactosidase were 78.4% and 63.1 mg/g,respectively,under the optimal immobilization conditions: glutaraldehyde concentration 4 g/L, immobilization time 4 h and enzyme concentration 3 mg/mL,pH 7.0 and crosslinking time 90 min. Compared with the free β-galactosidase,the optimal reaction temperature was increased from 30 to 40 ℃,and the optimal pH increased by 0.5. In addition,the immobilized β-galactosidase remained 77.8% of its original activity after its 7`(th) repeated use.

Keywords：amination;bacterial cellulose;immobilization;β-galactosidase

Preparation of bacterial cellulose membrane with amino group as carrier and its immobilization of β-galactosidase

CHENG Hao,CHEN Yong,YING Hanjie

(College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Nanjing Tech University,Nanjing 211800,China)

細(xì)菌纖維素(BC)和植物纖維素有相似的基本結(jié)構(gòu)，都是由D-葡萄糖以β-1,4糖苷鍵組成的無分支結(jié)構(gòu)的高分子，具有很多優(yōu)良性能，其持水性、結(jié)晶度、機(jī)械性能和純度均非常高，獨(dú)特的納米纖維網(wǎng)絡(luò)使其有良好的生物親和性[1-2]，但其難溶解、難加工且官能團(tuán)單一導(dǎo)致的其他功能不足等弱點(diǎn)，限制了其進(jìn)一步應(yīng)用。

筆者嘗試?yán)肂C表面含有的豐富羥基，通過化學(xué)修飾在BC薄膜表面引入氨基，以期獲得性能更加優(yōu)良的纖維素，為拓寬細(xì)菌纖維素的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。β-半乳糖苷酶能催化乳糖水解生成葡萄糖和半乳糖，主要用于生產(chǎn)低乳糖以解決普遍存在的乳糖不耐癥問題[3-5]。

筆者用修飾后的載體用戊二醛作交聯(lián)劑,采用化學(xué)交聯(lián)法固定β-半乳糖苷酶以利于酶的回收利用，降低使用成本。

1材料與方法

1.1　材料、試劑與儀器

β- 半乳糖苷酶(3 015 U/g，生化試劑)，諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司；鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(oNPG)、戊二醛(50%)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；NaOH、無水乙醇、氨水，西隴化工股份有限公司；無水Na2CO3、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、二甲基甲酰胺(DMF)、氯化亞砜、乙二胺、丙酮，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司。所用試劑均為分析純。

往復(fù)式水浴恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；UNICO7200型可見分光光度計(jì)，尤尼柯(上海)儀器有限公司；Avatar 380型傅里葉變換紅外光譜儀，美國Thermo Nicolet公司；Vario MICRO cube元素分析儀，德國Elementar公司； XPSSCALABMKH型X線光電子能譜儀(XPS)，美國VG公司。

1.2　氨基化細(xì)菌纖維素的制備和表征

1.2.1細(xì)菌纖維素的培養(yǎng)與處理

在無菌條件下用接種環(huán)從平板中刮取一環(huán)保藏的木醋桿菌，接種于50 mL種子培養(yǎng)基中，在30 ℃、靜置條件下培養(yǎng)3 d后，將上層細(xì)菌纖維素膜破碎后，按照體積分?jǐn)?shù)為7% 的比例于無菌條件下將種子液接入到裝液量為200 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中。30 ℃下靜置培養(yǎng)14 d后，收集得到凝膠片層狀細(xì)菌纖維素膜。純水浸泡2 d后再用0.1 mol/L NaOH溶液將膜片多次煮沸以除去膜片中的菌體和殘留培養(yǎng)基，最后用純水重復(fù)沖洗至中性。經(jīng)121 ℃、15 min高壓滅菌后于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2氨基化細(xì)菌纖維素的制備

將膜在-80 ℃預(yù)冷過夜后于-56 ℃真空環(huán)境下冷凍干燥。取小片薄膜，作為樣品。將5 g凍干后的細(xì)菌纖維素薄膜在300 mL DMF中于78.9 ℃、磁力攪拌過夜后，慢速逐滴加入8 mL氯化亞砜。待氯化亞砜加完后于同樣溫度下繼續(xù)反應(yīng)4 h，得到氯化纖維素(BC-Cl)。用稀釋的氨水和純水反復(fù)沖洗氯化纖維素，再用大量純水沖洗至中性。將過濾得到的氯化纖維素在-80 ℃下預(yù)冷，并于-56 ℃真空環(huán)境下冷凍干燥，得到氯化纖維素膜片。取1 g氯化纖維素薄片置于10 mL DMF內(nèi)，于磁力攪拌下加入8 mL乙二胺，持續(xù)回流3 h。反應(yīng)結(jié)束后用大量無水丙酮沖洗膜片，得到氨基化纖維素(BC-en)。室溫條件下真空干燥24 h后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3氨基化細(xì)菌纖維素的表征

1)元素分析將修飾前后的細(xì)菌纖維素薄膜研磨成粉，于120 ℃烘干過夜后，進(jìn)行元素分析測定。

2)傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)分析將修飾前后的細(xì)菌纖維素膜片凍干后研成粉末，與KBr以1∶100比例混合后充分研細(xì)，用壓片機(jī)壓片，再放入紅外光譜儀中進(jìn)行測定，儀器分辨率為0.4 cm-1，掃描速度為0.2 cm-1/s，波數(shù)掃描范圍400～4 000 cm-1。

3)X線光電子能譜(XPS)分析用于測定樣品表面元素電子的結(jié)合能以確定元素價(jià)態(tài)。將少量的粉末樣黏附在導(dǎo)電膠上進(jìn)行測試。采集全譜時(shí)通能140，步長0.8，掃描1次；采集窄譜時(shí)通能55，步長0.5，掃描4次。

1.3　酶的固定化及固定化酶基本性能測定

1.3.1氨基化纖維素載體固定β-D-半乳糖苷酶

將一定量的氨基化纖維素置于錐形瓶中，加入pH 7.0磷酸緩沖液浸泡2 h后，抽濾得到溶脹后的氨基化纖維素。向溶脹后的氨基化纖維素加入5 mL一定濃度的β-D-半乳糖苷酶溶液(先取0.1 mL經(jīng)過稀釋若干倍后測定原酶溶液活力),再加入2 mL一定濃度的戊二醛溶液后室溫振蕩3 h，制得固定化酶。吸取上清液0.1 mL，并稀釋后測定殘余酶活力。用與原酶液相應(yīng)pH的磷酸緩沖液重復(fù)洗滌固定化酶，測定固定化酶活力。

1.3.2酶活力的測定

1)游離β-D-半乳糖苷酶活力的測定向10 mL離心管內(nèi)加入3 mL質(zhì)量濃度為4 g/L用磷酸緩沖液配置的oNPG溶液，30 ℃水浴7 min后，再加入稀釋的酶液1 mL，搖勻后于同樣溫度下水浴反應(yīng)10 min，然后再加入1 mol/L的Na2CO3溶液2 mL終止反應(yīng)，搖勻后測定420 nm處的A420。

酶活力定義：在測定條件下(30 ℃、pH 7.0、反應(yīng)時(shí)間10 min)，每分鐘催化生成1 μmoloNP所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。乳糖酶活力計(jì)算見式(1)。

(1)

式中：A420為吸光度；0.783 3為換算系數(shù)，亦即oNP濃度為1 μmol/L時(shí)的A420值；t為反應(yīng)時(shí)間，min;m為反應(yīng)液中酶的質(zhì)量，g。

2)固定化β-D-半乳糖苷酶活力的測定向10 mL離心管內(nèi)加入3 mL質(zhì)量濃度為4 g/L用磷酸緩沖液配置的oNPG溶液，30 ℃水浴7 min后，再放入大約0.01 g的氨基化纖維素薄膜固定化酶，搖勻后于同樣溫度下水浴反應(yīng)10 min后，再加入1 mol/L的Na2CO3溶液2 mL終止反應(yīng)，搖勻后測定420 nm處的A420。乳糖酶活力單位的計(jì)算同上。

2結(jié)果與討論

2.1　氨基化細(xì)菌纖維素膜載體的表征

2.1.1元素分析結(jié)果

氨基化細(xì)菌纖維素的實(shí)際測定結(jié)果：C、H和N含量分別為41.62%、5.69%和7.12%。而以單個(gè)葡萄糖環(huán)為參與反應(yīng)單元和化學(xué)修飾反應(yīng)完全，則計(jì)算得到理論值為C 47.95%、H 7.84%、N 13.72%。氮元素的實(shí)測量小于完全取代值，氨基化程度大約為52%。

2.1.2FT-IR分析結(jié)果

圖1為細(xì)菌纖維素及其衍生物的紅外圖譜。由圖1可知：3 200～3 500 cm-1處為纖維素分子上—OH伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的寬而且強(qiáng)的峰；2 900 cm-1處為亞甲基、次甲基的 C—H伸縮振動(dòng)吸收峰；1 640 cm-1左右處為羥基 O—H 的彎曲振動(dòng)吸收峰；1 431 cm-1處為亞甲基、次甲基的 C—H彎曲振動(dòng)吸收峰；1 000～1 200 cm-1處為 C—O伸縮振動(dòng)吸收峰；1 114 cm-1處為 C—C骨架振動(dòng)吸收峰。這些特征峰都說明實(shí)驗(yàn)所得細(xì)菌纖維素成分為純纖維素。與二氯亞砜反應(yīng)后的細(xì)菌纖維素膜，在709和752 cm-1處出現(xiàn)了C—Cl鍵的伸縮振動(dòng)峰，且O—H的變形振動(dòng)峰消失，而其他峰值基本沒有變化，這說明了在纖維素C-6上的伯羥基被Cl原子所取代而發(fā)生了氯代反應(yīng)。細(xì)菌纖維素的氯化產(chǎn)物接著氨基化之后，在 3 300 cm-1附近又出現(xiàn)寬的強(qiáng)峰，但是峰位明顯向低波數(shù)移動(dòng)，表明有胺基的形成[10-11]。由于纖維素及其取代產(chǎn)物中大量氫鍵的存在，此外由于氨基化產(chǎn)物中既有伯胺基也有仲胺基，使得高波數(shù)的振動(dòng)峰較寬，不容易給出更多結(jié)構(gòu)信息。

圖1　 細(xì)菌纖維素、氯化細(xì)菌纖維素和氨基化 細(xì)菌纖維素的紅外圖譜 Fig.1　 Infrared spectra of the BC,BC-Cl,and BC-en

2.1.3XPS分析結(jié)果

圖2為細(xì)菌纖維素氯化物的光電子能譜和數(shù)據(jù)。從圖2中可知：細(xì)菌纖維素的氯化結(jié)果除了碳原子的1s軌道電子結(jié)合能在281 eV和282 eV[12]及氧原子的ls軌道電子結(jié)合能在532 eV處應(yīng)該有相應(yīng)的峰外，氯原子的2p軌道電子結(jié)合能在大約194 eV處有較強(qiáng)的峰，證明了修飾后細(xì)菌纖維素上氯原子的存在。

圖2　 細(xì)菌纖維素氯化產(chǎn)物的光電子能譜 Fig.2　 X-ray photoelectron spectroscopy of chlorinated product of bacterial cellulose

乙二胺修飾的細(xì)菌纖維素的光電子能譜如圖3所示。由圖3可知：比較弱的Cl(2p)能級(jí)峰可見，在胺化修飾后的產(chǎn)物中仍然有少量的氯沒有反應(yīng)，這表明氨基化不完全。由于出現(xiàn)較強(qiáng)的N(1s)能級(jí)峰，表明大部分的氯代物都發(fā)生了氨基化反應(yīng)[13]，得到了預(yù)期結(jié)構(gòu)的纖維素修飾產(chǎn)物。

圖3　 氨基化細(xì)菌纖維素的光電子能譜 Fig.3　 X-ray photoelectron spectroscopy of amination of bacterial cellulose

2.2　氨基化細(xì)菌纖維素載體固定 β-D-半乳糖苷酶的條件優(yōu)化

2.2.1固定化時(shí)間的確定

在其他條件(酶添加量、pH、戊二醛含量和交聯(lián)時(shí)間)保持一致時(shí)，0.01 g 氨基化細(xì)菌纖維素薄膜，室溫振蕩下分別固定 1、2、3、4、5、6和7 h 后，測定固定化酶活力回收率，考察不同固定化時(shí)間對(duì)固定化酶活力的影響，結(jié)果見圖4。

圖4　 固定化時(shí)間對(duì)固定化酶活力和吸附酶量的影響 Fig.4　 Effects of immobilization time on the activity and amount of immobilized enzyme

由圖4可知：氨基化細(xì)菌纖維素固定化 3 h時(shí)，固定化酶活力回收率達(dá)到最大，為 67.8%,隨固定化時(shí)間的延長，固定化酶活力呈下降趨勢(shì)。主要是由于隨固定化時(shí)間的延長，酶與載體共價(jià)耦聯(lián)的作用位點(diǎn)增多，破壞了酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)，而且當(dāng)載體偶聯(lián)的酶量逐漸增大時(shí)，載體網(wǎng)絡(luò)上的酶分子之間較為擁擠，在酶促反應(yīng)過程中，底物不易與酶充分接觸，故使固定化酶整體的活力呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)[14]。

2.2.2戊二醛用量的確定

在其他條件(酶添加量、pH和交聯(lián)時(shí)間)保持一致時(shí)，向 0.01 g 氨基化細(xì)菌纖維素薄膜中分別加入0、2、4、6、8、10 和12 g/L(以反應(yīng)總體積計(jì))的戊二醛，室溫振蕩條件下，分別固定3 h后測定固定化酶活力回收率，考察不同戊二醛含量對(duì)固定化酶活力和吸附酶量的影響，結(jié)果見圖5。

圖5　 戊二醛用量對(duì)固定化酶活力和吸附酶量的影響 Fig.5　 Effects of glutaraldehyde concentration on the activity and amount of immobilized enzyme

由圖5可以發(fā)現(xiàn)：固定化酶活力隨戊二醛濃度增加而增大,在戊二醛質(zhì)量濃度為4 g/L 時(shí)，酶活力回收率最大。低濃度的戊二醛有助于酶通過Schiff反應(yīng)與載體上的氨基交聯(lián)在一起，但交聯(lián)又不充分；在濃度較高時(shí)，戊二醛的毒性會(huì)使半乳糖苷酶部分失活，并且戊二醛會(huì)造成空間位阻而妨礙固定化酶與底物相結(jié)合,致使固定化酶活力回收率降低。

2.2.3酶添加量的確定

保持其他條件(戊二醛4 g/L 、pH和交聯(lián)時(shí)間)一致，向0.01 g氨基化細(xì)菌纖維素薄膜內(nèi)加入5 mL酶液(質(zhì)量濃度分別為1、2、3、4、5、6、7和8 mg/mL)，室溫振蕩條件下固定3 h后測定固定化酶活力，考察不同濃度酶添加量對(duì)固定化酶活力的影響，結(jié)果見圖6。

圖6　酶添加量對(duì)固定化酶活力和吸附酶量的影響 Fig.6　 Effects of enzyme concentration on the activity and amount of immobilized enzyme

由圖6可知：當(dāng)酶的濃度較低(不足)時(shí)，固定化酶活力回收率與酶濃度的增加呈正相關(guān)。酶添加量高于3 mg/mL時(shí)，固定化酶活力回收率與酶濃度的增加呈負(fù)相關(guān)。這是由于氨基化載體的活性基團(tuán)有限，酶液超過一定濃度后，載體上的結(jié)合位點(diǎn)已被飽和，因而酶添加量增加，而酶活回收率反而下降[15]。

2.2.4pH的確定

保持其他條件一致，向0.01 g氨基化細(xì)菌纖維素薄膜內(nèi)加入3 mg/mL的酶液5 mL，室溫振蕩下固定3 h后加入pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0的4 g/mL戊二醛各2 mL,室溫交聯(lián)60 min后測定固定化酶活力和吸附酶量，結(jié)果見圖7。

圖7　pH對(duì)固定化酶活力和吸附酶量的影響 Fig.7　 Effects of pH on the activity and amount of immobilized enzyme

由圖7可以看出:環(huán)境的pH對(duì)氨基化細(xì)菌纖維素薄膜固定化β-D-半乳糖苷酶的效率有顯著影響。固定化酶載量和固定化酶活力回收率隨著環(huán)境pH的升高而增大； 當(dāng)pH達(dá)到7.0時(shí)，氨基化細(xì)菌纖維素薄膜具有最大的酶活力回收率(75.3%)和吸附酶量(58.4 mg/g)；隨著pH繼續(xù)增加，固定化酶活力和酶載量呈下降的趨勢(shì)。引起此種現(xiàn)象的原因可能是在制備固定化酶的過程中，不同pH環(huán)境與酶分子直接接觸，極端pH使酶分子變形的可能性大大增加。另外，戊二醛在作為交聯(lián)劑的同時(shí)又是酶分子的變性劑，在一定程度上使酶分子發(fā)生構(gòu)象變化而引起失活。

2.2.5交聯(lián)時(shí)間的確定

保持其他條件一致，向0.01 g氨基化細(xì)菌纖維素薄膜內(nèi)加入3 mg/mL的酶液5 mL，室溫振蕩下固定3 h后加入4 g/mL 戊二醛各2 mL,室溫交聯(lián)不同時(shí)間(30、60、90、120、150和180 min)，測定固定化酶活力和吸附酶量，結(jié)果見圖8。

圖8　交聯(lián)時(shí)間對(duì)固定化酶活力和吸附酶量的影響 Fig.8　 Effects of crosslinking time on the activity and amount of immobilized enzyme

由圖8可知：用氨基化細(xì)菌纖維素薄膜固定β-D-半乳糖苷酶，當(dāng)交聯(lián)時(shí)間由30 min增加到90 min時(shí)，酶活力回收率(73.1%)和吸附酶量(60.3 mg/g)都達(dá)到最大值；其后，再延長交聯(lián)時(shí)間至180 min，固定化酶活力回收率下降至31.6%，而吸附酶量也有一定幅度的下降?？赡茉蚴牵瑢?duì)于氨基化細(xì)菌纖維素固定酶，適當(dāng)延長交聯(lián)時(shí)間有助于酶分子與戊二醛充分接觸從而增加吸附酶量和固定化酶活力回收率。然而，繼續(xù)延長交聯(lián)時(shí)間，戊二醛對(duì)酶分子的變性作用更加明顯。

2.2.6最佳組合的活力回收率和吸附酶量

在以上得出的各個(gè)最優(yōu)條件(即固定化時(shí)間為3 h，戊二醛質(zhì)量濃度 4 g/mL,酶液用量為3 mg/mL，pH 7.0 和 交聯(lián)時(shí)間為90 min)下，用氨基化細(xì)菌纖維素薄膜固定β-D-半乳糖苷酶，所得固定化酶活力回收率和吸附酶量分別為78.4% 和63.1 mg/g。韓平治等[16]用陽離子修飾的Sephadex G-100將部分純化的赤豆β- 半乳糖苷酶通過吸附和共價(jià)交聯(lián)法固定化，得到的固定化酶活力回收率為65%；潘曉亞等[17]選擇明膠為載體，用戊二醛作為交聯(lián)劑固定化乳糖酶，其酶活力回收率達(dá)到78.12%,可以重復(fù)回收使用。Tanriseven等[18]使用藻酸鹽和明膠形成的纖維作為固定化材料，利用戊二醛作交聯(lián)劑固定β-半乳糖苷酶，獲得的固定化酶的相對(duì)酶活力為56%，且酶活力可以保持35 d，該固定化酶具有潛在的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。Neri等[19]使用聚硅氧烷-聚乙烯醇磁性復(fù)合材料(mPOS-PVA)作為固定化載體，得到的固定化β-半乳糖苷酶在25 ℃下重復(fù)使用20次或在35 ℃存放24 h后只保留其50%原始酶活力，固定化效果欠佳。Toshiba等[20]利用免疫親和性載體(免疫球蛋白G-纖維素)固定β-半乳糖苷酶時(shí)發(fā)現(xiàn)，固定化酶在60 ℃下保存4 h后只保留其72%的原始酶活力，重復(fù)使用10次后固定化酶活力剩余了46%。由此可以看出，用氨基化細(xì)菌纖維素固定β-半乳糖苷酶，在提高酶活力回收率上有了一定程度的提高。

2.3　固定化酶和游離酶酶學(xué)性質(zhì)研究

2.3.1溫度對(duì)酶促反應(yīng)的影響

分別將游離酶和固定化酶置于不同溫度(20、25、30、35、40、45、50、55和60 ℃)下測定酶活力，以最高酶活為100%,計(jì)算相對(duì)酶活，結(jié)果如圖9所示。

圖9　反應(yīng)溫度對(duì)游離酶和固定化酶活力的影響 Fig.9　 Effects of reaction temperature on the activity of free and immobilized enzyme

由圖9可知：酶經(jīng)過固定化，其最適反應(yīng)溫度由30 ℃提高到40 ℃左右。說明可以通過適當(dāng)提高溫度增大酶促反應(yīng)速率以縮短反應(yīng)時(shí)間。細(xì)菌纖維素膜經(jīng)過溶脹能夠使酶分子進(jìn)入纖維束之間，這些纖維束能夠有效保護(hù)酶分子免受過高溫度而引起的變性失活。另外戊二醛的固定可能使酶分子的結(jié)構(gòu)剛性增強(qiáng)，增加了其抗熱性能。

2.3.2pH對(duì)酶促反應(yīng)的影響

按照測定游離酶和固定化酶的方法，分別在不同pH(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0)條件下測定游離酶和固定化酶活力，以最高酶活為100%,計(jì)算相對(duì)酶活，結(jié)果如圖10所示。

圖10　pH對(duì)游離酶和固定化酶活力的影響 Fig.10　 Effects of pH on the activity of free and immobilized enzyme

由圖10可知：游離酶的最適pH為6.5，固定化酶的最適pH為7.0,而且在偏堿性環(huán)境下固定化酶活力更高。與氨基相比，薄膜表面還有更多數(shù)量帶負(fù)電的羥基，能夠吸引溶液中的氫離子到周圍，致使固定化酶內(nèi)部微環(huán)境的 pH 比周圍反應(yīng)液的 pH 稍低一些，形成了適合酶催化反應(yīng)的酸性環(huán)境，因此固定化半乳糖苷酶的最適反應(yīng)pH向堿性方向移動(dòng)。

2.3.3固定化β-半乳糖苷酶的操作穩(wěn)定性

按照測定固定化酶的方法，利用同一份固定化酶進(jìn)行重復(fù)批次酶促反應(yīng)，結(jié)果如圖11所示。由圖11可以看出，在使用7次之后相對(duì)酶活力剩余為77.8%,重復(fù)使用性較好。

圖11　 固定化酶的重復(fù)使用性 Fig.11　 Reusability evaluation of immobilized enzyme

3結(jié)論

經(jīng)過DMF活化、二氯亞砜和乙二胺修飾制備出氨基化細(xì)菌纖維素薄膜，并以該薄膜為載體固定β-半乳糖苷酶，通過對(duì)固定化條件進(jìn)行探討，得到戊二醛添加量4 g/L，固定化時(shí)間3 h，酶添加量3 mg/mL，pH為7.0和交聯(lián)時(shí)間為90 min時(shí)，有最高酶活力回收率(78.4%)和吸附酶量(63.1 mg/g)。該固定化酶的最適溫度為40 ℃，比游離酶高10 ℃，相比游離酶，固定化情況下的最適pH提高了0.5，有向堿性方向移動(dòng)的趨勢(shì)，重復(fù)使用7次后還有77.8% 的相對(duì)酶活力。氨基化細(xì)菌纖維素膜可以作為固定化β-半乳糖苷酶的良好載體，但在工業(yè)應(yīng)用方面有待進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯荀志金)