豬源性成分檢測中3種DNA提取方法比較

王萍,喬勇升,韓芷玲

(江蘇省泰州市食品藥品檢驗所，江蘇泰州225300)

摘要：為了達到對動物源性成分快速、準確的檢定，對提取動物源性基因組DNA的方法進行了比較分析?？疾旆?三氯甲烷法、聚乙烯吡咯烷酮法(PVP法)和試劑盒法這3種方法對DNA提取的濃度、純度及實時熒光PCR擴增效果的影響。結(jié)果表明：酚-三氯甲烷法提取DNA濃度最高，試劑盒法純度最高且實時熒光PCR擴增效果最好，但PVP法操作簡單、安全、經(jīng)濟，提取的DNA用于實時熒光PCR擴增檢出限可達1.98 pg/μL。使用PVP法對市場上10份不同類型的動物性產(chǎn)品進行了檢測，檢出兩份產(chǎn)品中含有豬源性成分。PVP法應是3種方法中的首選方法，本文為實驗室選擇合適的DNA提取方法提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞：豬源性；DNA提?。环?三氯甲烷法；PVP法；試劑盒法；實時熒光PCR

doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2015.06.011

收稿日期：2015-03-24

作者簡介：王萍(1983—)，女，江蘇泰州人，工程師，碩士，研究方向：食品檢測，E-mail:wingping02091111@126.com

中圖分類號：TS207.3

文獻標志碼：A

文章編號：1672-3678(2015)06-0061-04

Abstract：In order to detect animal-derived material rapidly and accurately,we compared and analyzed the DNA extraction methods from the animal-derived material. We investigated the effect of three methods (phenol-chloroform method,polyvinylpyrrolidone method(PVP method) and reagent kit method) on the concentration of the extracted DNA,the purity of the extracted DNA and the result of the real-time fluorescent PCR amplification. The DNA concentration of the phenol-chloroform DNA extraction method was the highest,the purity of reagent kit was the highest and the effect of the real-time fluorescent PCR amplification was the best,but the PVP method was convenient,safe and economical,the detection limit of the real-time fluorescent PCR amplification was 1.98 pg/μL. Ten different types of animal products in the market were tested with PVP method,two products were detected to contain the porcine-derived material. The PVP method should be the preferred of the three methods. The assay provided a basis for the laboratory to choose a suitable DNA extraction method.

Keywords：porcine-derived; DNA extraction; phenol-chloroform method; PVP method; reagent kit method; real-time fluorescent PCR

Comparison of three DNA extraction methods in detection of porcine-derived material

WANG Ping,QIAO Yongsheng,HAN Zhiling

(Jiangsu Taizhou Institute for Food and Drug Control,Taizhou 225300,China)

食品安全關(guān)系著人類身體健康，是全社會關(guān)注的熱點問題。近年來肉制品摻假屢禁不止，肉制品以次充好，引起人們對食品安全的恐慌，這就要求食品監(jiān)管部門能夠?qū)游镌葱猿煞诌M行快速、準確的檢驗和鑒定。

用于動物源性成分的鑒定主要有物理、化學、免疫學和分子生物學等方法。其中，以檢測DNA為基礎(chǔ)的實時熒光定量PCR技術(shù)具有特異性強、靈敏度高、定量準確、自動化程度高等優(yōu)點，被廣泛用于分子生物學和醫(yī)學研究等領(lǐng)域。DNA模板質(zhì)量對熒光定量PCR很關(guān)鍵，在提取過程中若是處理不當，殘留的一些有機物以及其他一些雜物就會抑制PCR的進行，從而造成假陰性，影響后續(xù)操作的進行；此外不同實驗材料的組分差異，不同方法所提取的DNA質(zhì)量也不盡相同，對后續(xù)的實驗結(jié)果也存在差異[3-4]。提取基因組DNA的方法有很多：酚-三氯甲烷法是實驗室常用的經(jīng)典DNA提取方法，商業(yè)化的基因組DNA提取試劑盒目前也被實驗室廣泛使用，而聚乙烯吡咯烷酮(PVP)在提取植物基因組DNA方面報道的較多[5-8]，在提取動物基因組DNA方面報道的較少。

本文以豬肉為實驗材料，考察這3種提取動物源性基因組DNA方法，以期從中篩選出一種簡單、快速、更適合于實時熒光PCR擴增檢測動物源性基因組DNA的提取方法，從而為實驗室提供方法依據(jù)。

1材料與方法

1.1　材料

豬肉以及10份不同類型的其他動物性材料(蜜汁牛肉、牛肉丸 、牛肉切片、牛肉卷、牛柳、羊肉卷、羊肚、羊肉切片、羊排、羊腿)購自農(nóng)貿(mào)市場或超市。所有材料買回后剪碎，裝入樣品袋，置于-20 ℃冰箱中備用。

1.2　主要試劑與儀器

TaKaRa DNA 提取試劑盒及實時熒光PCR豬源性DNA檢測試劑盒，寶生物工程(大連)有限公司；抽提緩沖液(pH8.0)，Tris 0.05 mol/L，Na2EDTA 0.05 mol/L，SDS 30 g/L，使用HCl或KOH調(diào)節(jié)pH；提取緩沖液(pH 8.0)，Tris 0.2 mol/L，NaCl 0.25 mol/L，Na2EDTA 0.025 mol/L，SDS 50 g/L，使用HCl或KOH調(diào)節(jié)pH。

7500型熒光定量PCR儀，美國ABI公司；Lambda 35型紫外-可見光分光光度計，美國PE公司；SORVall D-37520型高速冷凍離心機，美國Thermo fisher公司。

1.3　3種DNA提取方法

采用酚-三氯甲烷法、PVP法、試劑盒法[10]3種方法對試驗材料進行DNA提取。不同方法所用樣品量均為0.25 g，放入經(jīng)-20℃冰箱預冷24 h的研缽中，快速用力研磨粉碎后分裝于編號的2 mL離心管中，每種方法重復3次。

1.3.1酚-三氯甲烷法

分別稱取0.25 g粉碎的豬肉置于編號為F1、F2、F3的離心管中，具體操作參照文獻，其中RNA酶消化這一步省略。

1.3.2PVP法

分別稱取0.25 g粉碎的豬肉置于編號為P1、P2、P3的離心管中,加入1 mL提取緩沖液，65 ℃攪拌1 h，室溫下冷卻后將60 mg PVP粉末和0.5×體積的乙酸氨(7.5 mol/L)溶液與上清液混合，冰浴30 min；10 000g離心10 min，取上清液至另一離心管中，加入等體積的三氯甲烷和異戊醇(24∶1)混勻，12 000g離心5 min，抽提1次；將上清與等體積的異丙醇混合，-20 ℃放置30 min。4 ℃條件下10 000g離心10 min，棄上清液，70%乙醇溶液洗滌沉淀2次，干燥后溶于100 μL滅菌雙蒸水中，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3試劑盒法

分別稱取0.25 g粉碎的豬肉置于編號為SH1、SH2、SH3的離心管中，具體操作見試劑盒說明書。

1.4　DNA質(zhì)量檢測

取20 μL DNA樣品，加1 980 μL雙蒸水稀釋，充分混勻后，以雙蒸水做空白對照[11]，用紫外-分光光度計分別測定核酸在260、280和230 nm處OD值，OD260/OD280代表DNA的純度，OD260/OD280比值在1.8左右，表明DNA純度高，低表明有雜蛋白質(zhì)及苯酚[12]，高則表明有RNA；OD260/OD230比值通常大于2，低則可能有核苷酸、氨基酸、鹽等小分子物質(zhì)殘留。DNA濃度計算按照式ρ=OD260×稀釋倍數(shù)×50計算。

1.5　實時熒光PCR擴增檢測

3種方法所提DNA稀釋至10 μg/mL作為擴增模板，使用ABI 7500熒光定量PCR儀擴增，PCR反應體系為25 μL，各成分組成：ddH2O 9.5 μL，2×Premix for Porcine 12.5 μL，Primer Mix for Porcine 1 μL，Probe Mix for Porcine 1 μL，DNA模板1 μL；PCR反應程序：95 ℃，10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個循環(huán)，60 ℃延伸時收集熒光信號。檢測試劑盒是采用雙標記熒光(FAM、HEX)在同一反應管內(nèi)對豬COX I基因及內(nèi)參照反應同時進行擴增，若FAM熒光檢出，且Ct值(每個反應管內(nèi)的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))≤35則視為檢出豬源性成分，若Ct值>35，則視為未檢出豬源性成分。

1.6　靈敏度檢測

提取的DNA模板用無菌雙蒸水10倍梯度稀釋，進行實時熒光PCR反應，檢測所提DNA的擴增檢測限。

2結(jié)果與討論

2.1　3種方法提取的DNA質(zhì)量比較

PCR擴增對模板DNA的質(zhì)量要求較高，3種DNA提取方法在原方法上稍加改進：首先用-20 ℃預冷的研缽研磨代替了-196 ℃的液氮研磨，操作上更加安全；酚-三氯甲烷法省去了RNA酶進行RNA消化的過程，PVP法通過反復試驗發(fā)現(xiàn)需要增加1次三氯甲烷：異戊醇抽提才能去除蛋白質(zhì)，可能跟所選材料動物性制品中脂肪和蛋白質(zhì)較多有關(guān)系。從表1中可以看出酚-三氯甲烷法提取的DNA濃度最高，PVP法提取的次之，試劑盒法提取的最低；但試劑盒法提取的DNA純度最高，酚-三氯甲烷法提取的DNA中含有一些RNA，PVP法提取的DNA中則有一些殘留的蛋白質(zhì)，3種方法提取的DNA中都有一些鹽等小分子物質(zhì)殘留。

2.2　3種方法提取的DNA實時熒光PCR擴增效果

3種方法提取的豬源性基因組DNA在相同質(zhì)量濃度(10 μg/mL)和條件下進行實時熒光PCR擴增反應，Ct值見表2。HEX和FAM熒光信號均被檢出，且FAM的Ct值在19.018～20.648之間，說明3種方法提取的DNA在同濃度及同條件下擴增效果相差不大，并且都可直接用于實時熒光PCR擴增檢測，都能滿足后續(xù)分子生物學的需要。其中試劑盒法的FAM熒光信號的Ct值最小，擴增效果最好；酚-三氯甲烷法次之；PVP法的Ct值最高。由此，也進一步說明了DNA模板的質(zhì)量影響著熒光定量PCR反應的進行。

表1　3種方法提取豬源性基因組DNA質(zhì)量比較

表2　3種方法提取豬源性基因組DNA用于實時熒光PCR擴增的 C t值

2.3　以PVP法提取的DNA為模板的檢出限試驗

將PVP法提取的質(zhì)量濃度為198 μg/mL的DNA作為模板，10倍梯度稀釋后實時熒光PCR擴增檢測，各梯度反應體系中的模板量分別為19.8、1.98、0.198、0.019 8和0.001 98 ng/μL，擴增曲線見圖1。由圖1可知，實時熒光PCR可檢出1.98 pg/μL的DNA樣品。這說明PVP法提取的DNA用于實時熒光PCR檢測靈敏度可達到皮克級。

圖1　 PVP法提取的DNA為模板的檢出限試驗 Fig.1　 Detection limit test using DNA extracted with PVP method as template

2.4　市售動物性產(chǎn)品的豬源性成分檢測

隨機選取市場上10份不同類型的動物性制品作為樣品，用PVP法提取DNA進行實時熒光PCR擴增檢測豬源性成分，其中蜜汁牛肉和牛肉卷2份樣品檢出為陽性，Ct值分別為17.222和20.401(均<35)，擴增曲線見圖2。由圖2可見，這2份樣品都摻入了豬肉欺騙消費者，2份陽性樣品的檢出也說明了PVP方法也適合于其他動物性樣品的基因組DNA提取。

圖2　 PVP法檢測市售動物性產(chǎn)品的豬源性成分 Fig.2　 Detection of porcine-derived material in animal products from the market with PVP method

3結(jié)論

3種方法所提DNA都可直接用于實時熒光PCR擴增，其中酚-三氯甲烷法所提DNA濃度較高，但是該方法在操作上比較繁瑣，提取時間長，有機溶劑抽提次數(shù)多，對人體有一定的傷害；試劑盒法所提DNA純度較高，提取時間最短，但是所得DNA量較少，且

試劑盒本身價格也較昂貴；PVP法操作過程相對簡單，有機溶劑用得少，雖然實時熒光PCR擴增檢測Ct值是最高的，但是其DNA模板經(jīng)過稀釋，靈敏度可達到皮克級，完全滿足分子生物學的需求。

綜上所述，PVP方法操作簡單、安全、經(jīng)濟、實時，熒光PCR擴增效果好，可以檢出市售動物性肉制品中的豬源性成分，是3種方法中的首選方法。

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(責任編輯荀志金)