基于滲透壓調(diào)控的紐莫康定B0發(fā)酵動力學

章人川，鄭嘉琪，肖瀟，馮昆達，秦婷婷，宋萍，黃和

(南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院，江蘇南京，211800)

摘要：以海洋絲狀真菌Glarea lozoyensis Q45為研究對象，研究不同滲透壓條件下Glarea lozoyensis Q45的生長、底物甘露醇消耗以及紐莫康定B0的生產(chǎn)特性?；贚ogistics方程、Luedeking-Piret方程和Luedeking-Piret-Like 方程，得到了描述紐莫康定B0發(fā)酵模型的動力學參數(shù)?；诎l(fā)酵動力學模型，提出了在菌體生長穩(wěn)定期添加1.61 g/L NaCl的調(diào)控策略。在該策略下，紐莫康定B0的產(chǎn)量達到1.75 g/L，比初始條件的結(jié)果提高24.6%。

關(guān)鍵詞：紐莫康定B0；滲透壓； 發(fā)酵動力學；Glarea lozoyensis

doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2015.06.012

收稿日期：2015-03-11

基金項目：國家自然科學基金(21306084)

作者簡介：章人川(1990—)，男，福建福州人，碩士研究生，研究方向：微生物次級代謝產(chǎn)物；黃 和(聯(lián)系人)，教授，E-mail：biotech@njtech.edu.cn

中圖分類號：Q93

文獻標志碼：A

文章編號：1672-3678(2015)06-0065-05

Abstract：The fermentation kinetic models for Glarea lozoyensis Q45 were established to describe the effect of different osmotic pressure conditions for cell growth,consumption of mannitol and production of pneumocandin B0.Based on Logistics equation,Luedeking-Piret equation and Luedeking-Piret Like equation,the kinetic parameters of different osmotic pressure were analyzed.An osmotic pressure stage-controlled strategy,with 1.61 g/L NaCl added during the stationary phase,was suggested and experimentally verified.Following this strategy,the final production of pneumocandin B0 was 1.75 g/L,increased by 24.6%.

Keywords：pneumocandin B0;osmotic pressure;fermentation kinetic;Glarea lozoyensis

Fermentation kinetic model of pneumocandin B 0 based onosmotic pressure stage-controlled

ZHANG Renchuan,ZHENG Jiaqi,XIAO Xiao,FENG Kunda,QIN Tingting,SONG Ping,HUANG He

(College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Nanjing Tech University,Nanjing 211800,China)

海洋絲狀真菌Glarealozoyensis的次級代謝產(chǎn)物紐莫康定B0是抗真菌藥物卡泊芬凈的前體，由一個環(huán)狀的六肽母核以及一個脂肪酸鏈組成。卡泊芬凈作為一種新型的廣譜抗真菌藥物——棘白菌素類抗真菌藥物，能選擇性地抑制真菌細胞壁β-1,3葡聚糖的合成，在抗真菌藥物領(lǐng)域受到人們廣泛的關(guān)注[1-3]。

滲透壓對大部分微生物的生長具有顯著影響，細胞會通過合成用于調(diào)節(jié)胞內(nèi)滲透壓的物質(zhì)來適應(yīng)環(huán)境的變化。王玉磊等在研究產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵的鹽脅迫時發(fā)現(xiàn)，添加適當?shù)腘a+和K+能提高谷胱甘肽和S-腺苷蛋氨酸的聯(lián)產(chǎn)產(chǎn)量。曾艷等研究裂殖壺菌時發(fā)現(xiàn)，一定濃度的滲透壓脅迫使二十二碳六烯酸(DHA)產(chǎn)量提升46.84%。姜瑋等在研究游動放線菌合成阿卡波糖的過程中發(fā)現(xiàn)，在前期維持較低的滲透壓772.5 kPa，在中后期維持1 030～1 288 kPa，最終50 L發(fā)酵罐的效價提升50%。

目前，相關(guān)學者已就滲透壓對G.lozoyensis發(fā)酵的影響以及G.lozoyensis發(fā)酵產(chǎn)紐莫康定B0的工業(yè)放大[9-11]進行過研究，但對G.lozoyensis發(fā)酵動力學進行研究的很少。發(fā)酵動力學能通過數(shù)學模型描繪微生物代謝來減少傳統(tǒng)經(jīng)驗型發(fā)酵調(diào)控的盲目性。因此，本研究中，筆者構(gòu)建基于滲透壓調(diào)控的G.lozoyensis產(chǎn)紐莫康定B0的分批發(fā)酵動力學模型，研究在最優(yōu)初始滲透壓發(fā)酵條件下G.lozoyensis發(fā)酵過程中的菌體生長，底物消耗以及產(chǎn)物合成的潛在規(guī)律，并初步探討滲透壓對菌體生理代謝的影響方式。

1材料與方法

1.1　實驗材料

1.1.1菌種

菌株GlarealozoyensisQ45，中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏日期2014年9月14日，保藏編號為CCTCC M 2014416。

1.1.2培養(yǎng)基

PDA固體培養(yǎng)基(g/L):去皮馬鈴薯200.0，蔗糖20.0，瓊脂20.0。

種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 40.0，黃豆粉 20.0，玉米漿 10.0，KH2PO410.0，微量元素 10.0。

微量元素(g/L):FeSO4·7H2O 1.0，MnSO4·H2O 1.0，ZnSO4·7H2O 0.2，CaCl2·2H2O 0.1，HBO30.056，CuCl2·2H2O 0.025，(NH4)5MO7O24·4H2O 0.003。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：甘露醇 80，玉米蛋白粉 10，K2HPO42.5。

1.1.3實驗材料

甘露醇標準品購自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司，其余試劑均購自國藥集團試劑公司的分析純試劑。

LC-20AB型高效液相色譜購自島津(中國)有限公司，U3000型高效液相色譜購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.2　實驗方法

1.2.1培養(yǎng)方法

發(fā)酵培養(yǎng)：自斜面取2 cm2菌苔至50 mL種子培養(yǎng)基中，26 ℃、220 r/min培養(yǎng)5 d。以10%的接種量接入裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，26 ℃、220 r/min培養(yǎng)15 d。

1.2.2檢測方法

甘露醇檢測采用島津高效液相色譜LC Solution工作站測定。色譜柱Aminex HPX-87P柱(300 mm×7.8 mm)，流動相為超純水，流速1 mL/min，檢測器為示差折光檢測器(RID-10A)，柱溫80 ℃，進樣量20 μL。

生物量檢測采用菌體干質(zhì)量濃度法，80 ℃烘干至恒質(zhì)量。

紐莫康定B0檢測采用戴安高效液相色譜U3000測定。色譜柱Venusil MP C18柱(250 mm×4.6 mm)，流動相A為乙腈，流動相B為0.1 %的H3PO4。洗脫程序 ：0～20 min，V(A)∶V(B)=40∶60；20～40 min，V(A)∶V(B)=50∶50，流速1 mL/min。檢測器為紫外檢測器，檢測波長210 nm，柱溫35 ℃，進樣量20 μL。

1.2.3滲透壓計算方法

培養(yǎng)基中總滲透壓為電解質(zhì)和非電解質(zhì)之和，計算方法參照文獻[12]。

目前，用于模擬菌體生長的非結(jié)構(gòu)模型主要為Monod方程和Logistic方程[13]。G.lozoyensisQ45發(fā)酵生產(chǎn)紐莫康定B0的過程中，菌體生長符合Logistic方程，Logistic菌體生長動力學模型見式(1)。

(1)

式中：X為菌體質(zhì)量濃度(g/L)；Xm為最大菌體質(zhì)量濃度(g/L)；μm為最大比生長速率(d-1)；t為發(fā)酵時間(d)。

產(chǎn)物生成動力學模型：紐莫康定B0的合成與菌體的生長應(yīng)歸于部分生長偶聯(lián)型。因此，選用Luedekin-Piret方程來描述G.lozoyensisQ45菌合成紐莫康定B0的速率[14]，見式(2)。

(2)

式中：P表示紐莫康定B0質(zhì)量濃度(g/L)，α表示生長偶聯(lián)的產(chǎn)物合成系數(shù)，β表示非生長偶聯(lián)的產(chǎn)物合成系數(shù)。當α≠0、β=0時，為產(chǎn)物形成與細胞生長偶聯(lián)型；α≠0、β≠0時，為產(chǎn)物形成與細胞生長部分偶聯(lián)型；α=0、β≠0時，為產(chǎn)物形成與細胞生長非偶聯(lián)型。

底物消耗動力學模型：紐莫康定B0分批發(fā)酵過程中，甘露醇作為碳源和能源用于菌體生長，維持菌體新陳代謝以及次級代謝產(chǎn)物的合成。底物消耗動力學可采用Luedekin-Piret-Like方程來表示[15]，見式(3)。

(3)

發(fā)酵動力學參數(shù)計算：用Matlab7軟件工具包中l(wèi)sqcurvefit參數(shù)對上述公式進行非線性最小二乘法擬合。

2結(jié)果與討論

2.1　滲透壓對 G. lozoyensis Q45產(chǎn)紐莫康定B 0的影響

考察滲透壓對菌體底物消耗與產(chǎn)物合成的相互影響，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知：高濃度甘露醇80 g/L(1 132.31 kPa)條件下紐莫康定B0的產(chǎn)量是低濃度40 g/L(566.16 kPa)的4.96倍。在低濃度甘露醇條件下，添加終質(zhì)量濃度為6.44 g/L(566.16 kPa)的NaCl使?jié)B透壓回到高濃度甘露醇的滲透壓，紐莫康定B0產(chǎn)量較低濃度時提高191.4%。底物消耗方面，NaCl的添加使底物甘露醇的消耗速度減緩。因此，滲透壓對G.lozoyensisQ45的發(fā)酵產(chǎn)紐莫康定過程和菌體代謝有著重要影響。但是紐莫康定B0產(chǎn)量并沒有回復(fù)到高濃度的水平，可能是初始甘露醇濃度不夠，沒有足夠的底物維持細胞和產(chǎn)量的合成。因此，在下階段實驗中，采用80 g/L甘露醇作為底物質(zhì)量濃度。

圖1　 滲透壓對紐莫康定B 0發(fā)酵的影響 Fig.1　 Effects of the osmotic pressure on pneumocandin B 0 fermentation

2.2　NaCl濃度對 G. lozoyensis Q45產(chǎn)紐莫康定B 0的影響

考慮到6.42 g/L NaCl所提供的滲透壓(相當于40 g/L甘露醇)已經(jīng)較大，所以在80 g/L甘露醇基礎(chǔ)上添加NaCl的時候，以添加6.42 g/L NaCl為最高值，以倍數(shù)關(guān)系做遞減，考察不同初始NaCl溶液條件下紐莫康定B0的發(fā)酵情況，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知：G.lozoyensisQ45生長過程可分為3個階段。在遲滯期(Ⅰ階段，0～2 d)，碳源消耗速度緩慢，菌體生長緩慢，同時產(chǎn)物少量合成；在對數(shù)期(Ⅱ 階段，2～6 d)，菌體快速生長，產(chǎn)物合成以及碳源消耗速度略微加快；在穩(wěn)定期(Ⅲ 階段，6～15 d)，菌體生長趨于穩(wěn)定，此時，在碳源大量消耗的基礎(chǔ)上，產(chǎn)物開始大量合成。同時，隨著NaCl濃度的增加，甘露醇消耗速度減緩，生物量的積累減少，紐莫康定B0的合成速度和最大產(chǎn)量先增加后減少。 在遲滯期添加1.61 g/L NaCl，紐莫康定B0產(chǎn)量相比添加3.22 g/L和6.24 g/L NaCl的實驗組分別提高15.4%和21.5%，因此，確定1.61 g/L NaCl為最優(yōu)添加量。

圖2　 NaCl質(zhì)量濃度對紐莫康定B 0發(fā)酵過程的影響 Fig.2　 Effects of NaCl concentration on pneumocand in B 0 fermentation

2.3　發(fā)酵動力學模型的建立與分析

2.3.1發(fā)酵動力學模型的建立

為了驗證模型的適用范圍，分別以8%～12%初始菌體濃度(即接種量)以及60～100 g/L初始底物質(zhì)量濃度作為考察范圍，研究不同接種量計算值與實驗值的相對誤差，結(jié)果如表1所示。由表1可知：當接種量在±20%之內(nèi)時，菌體生長、底物消耗的實驗值與計算值的平均相對誤差均在5%之內(nèi)，產(chǎn)物合成的平均相對誤差在10%以內(nèi)。當初始底物質(zhì)量濃度在70～90 g/L范圍內(nèi)時，菌體生長、底物消耗和產(chǎn)物合成模型的相對誤差均控制在5%以內(nèi)，當初始底物質(zhì)量濃度在60和100 g/L時，菌體生長和產(chǎn)物合成的平均相對誤差均超過10%，說明底物濃度相比發(fā)酵接種量對發(fā)酵階段菌體生長的影響更大(表2)。

表1　接種量計算值與實驗值的相對誤差

表2　底物濃度計算值與實驗值的相對誤差

該模型在初始菌體質(zhì)量濃度(2.76±0.552) g/L、初始底物質(zhì)量濃度(80±10) g/L范圍內(nèi)能得到很好的應(yīng)用。

2.3.2滲透壓對發(fā)酵動力學參數(shù)影響

2.4　基于發(fā)酵動力學研究的滲透壓調(diào)控策略

基于以上的動力學參數(shù)分析，NaCl對紐莫康定B0發(fā)酵的影響如下：①降低菌體的生長速度；②促使底物的消耗流向紐莫康定B0合成方向?？紤]到紐莫康定B0是次級代謝產(chǎn)物，產(chǎn)物合成需要生物量的積累[16]，因此，研究不同階段NaCl的添加對產(chǎn)物合成的影響，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知：穩(wěn)定期(12 d)添加1.61 g/L NaCl使紐莫康定B0的產(chǎn)量提升24.6%，與在遲滯期(0天)和對數(shù)期(4 d)添加1.61 g/L NaCl相比，分別提高21.28%和15.47%。因此，此結(jié)果驗證了基于發(fā)酵動力學參數(shù)分析提出的滲透壓調(diào)控策略是可行的。

圖3　 不同生長階段NaCl添加對產(chǎn)量的影響 Fig.3　 Effects of NaCl added in different growth phase for production

可以從以下兩個方面嘗試解釋NaCl對紐莫康定B0合成存在的雙面影響：①由于紐莫康定B0合成菌株G.lozoyensisQ45屬于海洋絲狀真菌，其天然的生長環(huán)境本身就存在一定程度的滲透壓，因此NaCl的添加一定程度上模擬了菌體的最適生長環(huán)境，導(dǎo)致產(chǎn)物合成的增加；②Na+的添加會改變微生物細胞膜上Ca2+通道的流量，使得細胞膜上的磷脂酶信號被激活，從而影響鈣調(diào)磷激酶響應(yīng)的鋅指蛋白，最終提高胞內(nèi)次級代謝產(chǎn)物的合成[17]， 因此，推測在紐莫康定B0的合成中，Na+也起到同樣效果。

3結(jié)論

根據(jù)不同滲透壓條件下動力學參數(shù)的分析，提出在生長穩(wěn)定期添加NaCl的調(diào)控策略。在前期維持較高的菌體比生長速率，使得菌體達到更高的生物量，在后期添加NaCl溶液，降低菌體用于維持自身代謝的相關(guān)系數(shù)，提高產(chǎn)物合成相關(guān)系數(shù)，使菌體積累足夠生物量的同時實現(xiàn)產(chǎn)物的高濃度積累。對所提出的發(fā)酵控制策略進行驗證，通過在穩(wěn)定期中期流加NaCl的策略，產(chǎn)量與80 g/L條件相比，提高24.6%，達到1.75 g/L。

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(責任編輯管珺)