苦參黃酮類(lèi)化合物與SGLT2同源蛋白2XQ2的分子對(duì)接研究

崔海東1，馬玉卓1，戴雪娥2，劉鷹翔2

(1.廣東藥學(xué)院 藥科學(xué)院，廣東 廣州 510006； 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

摘要:目的 利用分子對(duì)接技術(shù)，探討苦參黃酮類(lèi)提取物與鈉-葡糖共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(SGLT2)之間的作用關(guān)系。方法 采用Molegro Virtual Docker(MVD)分子對(duì)接軟件，以SGLT2同源蛋白2XQ2為受體模板，對(duì)從苦參中提取的5個(gè)黃酮類(lèi)化合物進(jìn)行分子對(duì)接研究。結(jié)果 5個(gè)化合物與2XQ2發(fā)生分子對(duì)接的MVD分值分別為-115.8、-129.0、-147.6、-104.1、-100.9 kJ·mol`(-1)。結(jié)論 5個(gè)苦參黃酮類(lèi)提取物均可與2XQ2進(jìn)行分子對(duì)接，對(duì)接的結(jié)合位點(diǎn)信息有助于該類(lèi)化合物抑制SGLT2活性機(jī)制的闡釋。

關(guān)鍵詞:鈉-葡糖共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2； 苦參黃酮類(lèi)提取物； 分子對(duì)接； 結(jié)合位點(diǎn)

中圖分類(lèi)號(hào):Q74

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

doi:10.3969/j.issn.1006-8783.2015.01.007

文章編號(hào):1006-8783(2015)01-0031-05

Abstract:Objective To study on the relationships about the flavonoids extracts from sophora with SGLT2 by using the molecular docking technology. Methods Molegro Virtual Docker program was used to study the mechanism of interaction between 2XQ2 and five flavonoids from sophora.Results The five compounds could bind to 2XQ2 by high affinity scores with -115.8,-129.0,-147.6,-104.1,-100.9 kJ·mol`(-1),respectively. Conclusion The molecular docking result provided the mechanism of the reason why this type of compounds inhibited the target protein SGLT2.

收稿日期：2014-10-22

基金項(xiàng)目：廣東省科學(xué)計(jì)劃項(xiàng)目(2011B031800232)

作者簡(jiǎn)介：崔海東(1989—)，男，2012級(jí)碩士研究生，Email:cuihaidongwww@126.com；通信作者：馬玉卓，女，副教授，主要從事藥物化學(xué)和藥物設(shè)計(jì)的研究，Email:mayuzhuo66@163.com。

Study on the molecular docking of SGLT2 homologous protein 2XQ2 and flavonoids from sophora

CUI Haidong1,MA Yuzhuo1,DAI Xue′e2,LIU Yingxiang2

(1.SchoolofPharmacy,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China; 2.SchoolofChineseMeteriaMedica,GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510006,China)

Key words:SGLT2; the flavonoids from sophora; molecular docking; binding site

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015-01-13 15:38網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20150113.1538.009.html

糖尿病(diabetes mellitus)是一種糖、蛋白質(zhì)和脂肪代謝障礙性疾病，主要表現(xiàn)為高血糖和尿糖[1]。腎臟的葡萄糖再吸收增加是引起糖尿病患者高血糖的重要原因之一。鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(sodium-glucose co-transporter，SGLT)是一類(lèi)存在于小腸黏膜(SGLT1)和腎臟近端小管(SGLT1和SGLT2)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族。SGLT2是一種親和力低的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在腎臟特異性表達(dá)和近曲小管的葡萄糖再吸收中起重要作用[2]。

SGLT2抑制劑可阻遏腎近曲小管SGLT2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，防止已濾過(guò)的葡萄糖在腎臟內(nèi)再吸收，繼而清除尿液中過(guò)量的葡萄糖，由此達(dá)到控制糖尿病患者體內(nèi)高血糖的目的。目前，SGLT2已成為新型抗糖尿病藥物設(shè)計(jì)的靶標(biāo)蛋白。

苦參是一種傳統(tǒng)中藥，具有廣泛的生物活性和藥理作用[3]。據(jù)楊新洲等[4]報(bào)道，苦參黃酮類(lèi)化合物對(duì)SGLT2顯示不同程度的抑制活性；但是，這些化合物如何與SGLT2發(fā)生相互作用并抑制其活性的作用機(jī)制尚不清晰。本文采用分子對(duì)接技術(shù)，選取三葉豆紫檀苷(1)、(-)-高麗槐素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷(2)、乙酰三葉豆紫檀苷(3)、羅思菌素(4)、芒柄花苷(5)等5個(gè)活性較好的苦參黃酮類(lèi)化合物(結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1)與SGLT2同源蛋白進(jìn)行對(duì)接，參比分子選取上市藥物SGLT2抑制劑達(dá)格列凈(dapagliflozin，6)，希望為苦參黃酮類(lèi)化合物抑制鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用機(jī)制提供初步的試驗(yàn)依據(jù)。

1.三葉豆紫檀苷; 2.(-)-高麗槐素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷; 3.乙酰三葉豆紫檀苷; 4.羅思菌素; 5.芒柄花苷; 6.達(dá)格列凈。

圖1苦參黃酮類(lèi)提取物及達(dá)格列凈的結(jié)構(gòu)

Figure 1Structure of the flavonoids and dapagliflozin

1方法

1.1　受體的準(zhǔn)備

弧菌半乳糖共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(vSGLT)是SGLT2的同源蛋白[5]，二者的保守性結(jié)合口袋在序列和結(jié)構(gòu)上具有一致性，因此，vSGLT的受體模板(PDB code：2XQ2)可選作用于SGLT2蛋白-配體相互作用的研究[6-7]。

由PDB蛋白質(zhì)庫(kù)(http://www.rcsb.org)中下載所需的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)2XQ2，在進(jìn)行分子的對(duì)接之前，利用SYBYL軟件對(duì)分子進(jìn)行除去蛋白質(zhì)中的配體分子，并進(jìn)行加氫、加電荷、氨基酸殘基修復(fù)等預(yù)處理，保存為mol2/pdb格式，備用。

1.2　配體的構(gòu)建

使用SYBYL軟件對(duì)包括參比分子達(dá)格列凈[7](6)在內(nèi)的6個(gè)小分子進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)的繪制，并對(duì)三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行能量?jī)?yōu)化、加氫、加電荷等預(yù)處理，然后以mol2格式導(dǎo)出，備用。

1.3　 Molegro Virtual Docker(MVD)軟件

MVD是一款由CLC Bio生物信息學(xué)軟件公司開(kāi)發(fā)的基于MolDock的演算預(yù)測(cè)小分子和大分子相互作用的分子對(duì)接軟件，能夠根據(jù)配體準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)大分子蛋白的活性位點(diǎn)，是一款精確的半柔性分子對(duì)接程序，通過(guò)增加限定因素，可提高受體-配體相互識(shí)別的準(zhǔn)確度，與其他對(duì)接軟件相比，具有準(zhǔn)確度高的優(yōu)勢(shì)(MVD:87%，Glide:82%，AutoDock:42%，F(xiàn)lexx:58%)。

1.4　對(duì)接程序

采用標(biāo)準(zhǔn)MVD對(duì)接程序進(jìn)行分子的對(duì)接，對(duì)接時(shí)應(yīng)保證對(duì)接范圍為球形，半徑設(shè)置為1.5 nm，其他參數(shù)默認(rèn)。將得到的配體構(gòu)象進(jìn)行成簇分析，參數(shù)設(shè)置為0.05 nm，氫鍵供體-受體之間的最大距離設(shè)置為0.03 nm，然后基于對(duì)接的分子能量對(duì)結(jié)合模式進(jìn)行打分，運(yùn)行100次，最后根據(jù)成簇情況和最低Mol Dock Score合理選取對(duì)接結(jié)果。重復(fù)操作，最后得到所有分子的最優(yōu)結(jié)合模式和最低結(jié)合能量值[8-9]。

2結(jié)果

2.1　參比對(duì)照達(dá)格列凈與2XQ2的分子對(duì)接

達(dá)格列凈是C-苷類(lèi)SGLT2抑制劑，結(jié)構(gòu)上含有1個(gè)氯代的苯環(huán)中心和1個(gè)乙氧基取代的苯環(huán)，可以選擇性地作用于SGLT2蛋白。本文選擇達(dá)格列凈作為苦參黃酮提取物與2XQ2對(duì)接的參比分子。

達(dá)格列凈與靶標(biāo)蛋白2XQ2的對(duì)接結(jié)果(表1)顯示：達(dá)格列凈與2XQ2對(duì)接的結(jié)合位點(diǎn)處于二聚體蛋白A鏈和B鏈共同作用所形成的結(jié)合腔內(nèi)，其中氯代苯環(huán)以及乙氧基取代的苯環(huán)處在由Ile253A、Trp257A、Ile97A、Phe496B、Phe489B、Trp257A等殘基共同形成的疏水口袋中，糖基部分則延伸至極性相對(duì)較大的區(qū)域，并與周?chē)鶪ly255A、Leu484A、Gly254A、Leu488B、Val258A等殘基發(fā)生相互作用；另外，達(dá)格列凈糖基上的6位和2位羥基分別與Gly254A和Leu488B形成氫鍵作用，這與Akira等[6]報(bào)道的SGLT2與抑制劑相互作用的結(jié)合方式一致(見(jiàn)圖2A～圖C)。

A. Akira等[6]報(bào)道的SGLT2抑制劑與vSGLT的結(jié)合位點(diǎn)圖(彩色為小分子抑制劑；灰色為蛋白骨架A鏈和B鏈飄帶圖);

B. 參比分子達(dá)格列凈與2XQ2對(duì)接結(jié)合位點(diǎn)的飄帶圖(綠色為陽(yáng)性分子達(dá)格列凈；藍(lán)色為2XQ2的A鏈飄帶；紅色為2XQ2的B鏈飄帶；球棍模型為與抑制劑有相互作用的小分子); C.達(dá)格列凈與2XQ2的氨基酸殘基相互作用關(guān)系圖(綠色為達(dá)格列凈;藍(lán)色為氫鍵;球棍模型為與達(dá)格列凈相互作用的氨基酸殘基)。

圖2達(dá)格列凈與2XQ2的分子對(duì)接結(jié)果

Figure 2The results of dapagliflozin binding with 2XQ2

2.2　苦參黃酮類(lèi)提取物與2XQ2的分子對(duì)接

如圖3A、B所示，盡管相互作用的氨基酸殘基有所變化，黃酮類(lèi)化合物1與2XQ2的結(jié)合模式仍與達(dá)格列凈保持一致，化合物1的苷元部分處在由Thr540A、Ala536A、Tyr539A、Phe469B、Ile249A等殘基形成的疏水結(jié)合腔中，羰基則對(duì)應(yīng)的延伸至相對(duì)極性區(qū)域并與Leu488B、Phe489B、Val482B、Ile253A、Trp257A等氨基酸殘基形成非共價(jià)鍵作用，其中糖基上的1位氧與6位羥基分別與Trp257A、Leu488B、Tyr485B形成氫鍵。

A.化合物1與2XQ2對(duì)接結(jié)合位點(diǎn)的飄帶圖; B.化合物1與2XQ2的氨基酸殘基相互作用關(guān)系圖; C.化合物2、3與2XQ2對(duì)接結(jié)合位點(diǎn)的飄帶圖(綠色為化合物2，黃色為化合物3); D.化合物2、3與2XQ2的氨基酸殘基相互作用關(guān)系圖; E.化合物4、5與2XQ2對(duì)接結(jié)合位點(diǎn)的飄帶圖(綠色為化合物4，黃色為化合物5); F.化合物4、5與2XQ2的氨基酸殘基相互作用關(guān)系圖。

圖3苦參黃酮類(lèi)提取物與2XQ2的分子對(duì)接結(jié)果

如圖3C、D所示，化合物2、3與2XQ2的結(jié)合方式與化合物1類(lèi)似，苷元填充在結(jié)合位點(diǎn)的疏水中心，糖基處于極性區(qū)域。與化合物1相比，少量與底物能形成相互作用的氨基酸殘基發(fā)生了變化，化合物2、3中糖基部分的2位羥基可與Tyr485B形成氫鍵結(jié)合，糖基的6位可與A鏈的Gly254A上的殘基形成氫鍵結(jié)合。值得說(shuō)明的是，化合物2的4位羥基同時(shí)與A鏈的Gly254A上的殘基形成氫鍵結(jié)合，與6位羥基形成了橋接，推測(cè)與化合物2的4、6位羥基取象一致有關(guān)。

如圖3E、F所示，化合物4、5的結(jié)合方式相同，并與達(dá)格列凈(6)的結(jié)合位點(diǎn)保持一致，其中，6位羥基與氨基酸殘基Leu252A形成氫鍵結(jié)合。

分子對(duì)接的親和力、能量值和與其相互作用氨基酸殘基如表1所示，黃酮類(lèi)化合物與2XQ2的對(duì)接MVD分值分別為-115.8、 -129.0、-147.6、 -104.1、

-100.9 kJ·mol-1，其中化合物2、3的對(duì)接分值高于參比對(duì)照達(dá)格列凈(6)。

3討論

分子對(duì)接思想源自1894年德國(guó)化學(xué)家Fisher提出的“鎖-鑰”學(xué)說(shuō)，其原理是從已知結(jié)構(gòu)的受體和配體出發(fā)，通過(guò)化學(xué)計(jì)量的方法模擬識(shí)別藥物分子與生物大分子之間的相互作用，并最終獲得可能產(chǎn)生的各種類(lèi)型的藥理作用，該方法現(xiàn)已廣泛用于藥物的虛擬篩選、定量構(gòu)效關(guān)系研究。但是，采用分子模擬進(jìn)行中藥活性成分與藥物靶標(biāo)對(duì)接從而探討藥理作用機(jī)制的研究才剛剛起步。

本文選擇具有抑制SGLT2活性的5個(gè)苦參黃酮提取物作為研究對(duì)象，開(kāi)展與SGLT2同源蛋白2XQ2的分子對(duì)接研究，分別將陽(yáng)性對(duì)照達(dá)格列凈和5個(gè)苦參黃酮提取物與2XQ2進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果顯示，所有對(duì)接小分子的最優(yōu)構(gòu)象均處在二聚體蛋白A鏈和B鏈共同作用形成的結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域，其中苷元均處在A、B鏈共同作用形成的疏水腔內(nèi)，而糖基則延伸至A、B鏈的相對(duì)極性區(qū)域，這與文獻(xiàn)[6]所報(bào)道的SGLT2小分子抑制劑作用于SGLT2蛋白A、B鏈之間的結(jié)果相一致。

Figure 3　The binding results of flavonoids with 2XQ2

另外，黃酮類(lèi)化合物作為配體與2XQ2對(duì)接的結(jié)果顯示，化合物3較其他小分子的對(duì)接分值高。進(jìn)一步的對(duì)接構(gòu)象分析顯示：化合物3糖基的6位乙?；蛇M(jìn)一步延伸并與相應(yīng)的氨基酸殘基結(jié)合，而其他小分子均無(wú)乙?；?，提示糖基上6位羥基的衍生化可能利于抑制劑與靶點(diǎn)蛋白的結(jié)合。

SGLT2與糖尿病有著密切的關(guān)系。目前的研究顯示，苦參中提取的5個(gè)黃酮類(lèi)化合物均能夠和SGLT2同源蛋白2XQ2對(duì)接成功，其對(duì)接位點(diǎn)的信息為分析該類(lèi)化合物抑制SGLT2活性的機(jī)制提供了一定的試驗(yàn)依據(jù)。

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(責(zé)任編輯:陳翔)