HPLC法同時(shí)測(cè)定養(yǎng)心寧神丸中丹參酮ⅡA和丹酚酸B的含量

謝琳，莊滿賢，王亞琦，何風(fēng)雷，郭鐘慧

(廣州白云山陳李濟(jì)藥廠有限公司，廣東 廣州 510288)

摘要:目的 建立高效液相色譜法測(cè)定養(yǎng)心寧神丸中丹參酮ⅡA和丹酚酸B的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。方法 采用Agilent ZORBAX XDB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱，以乙腈為流動(dòng)相A， 0.1%(體積分?jǐn)?shù))H3PO4溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫，流速：1.0 mL/min，柱溫：30 ℃。結(jié)果 丹參酮ⅡA和丹酚酸B分別在1.444～14.44 μg/mL(R=0.999 9)、38.84～388.4 μg /mL范圍內(nèi)(R=0.999 5)呈良好的線性關(guān)系，平均回收率分別為101.42%(RSD=3.06%)、101.97%(RSD=2.23%)。結(jié)論 本方法簡(jiǎn)便、快捷、重復(fù)性好，可以用于養(yǎng)心寧神丸的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞:養(yǎng)心寧神丸； 丹參酮ⅡA； 丹酚酸B； 高效液相色譜法(HPLC法)； 含量測(cè)定

中圖分類號(hào):R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

doi:10.3969/j.issn.1006-8783.2015.01.013

文章編號(hào):1006-8783(2015)01-0058-04

Abstract:Objective To establish the HPLC method for determination of tanshinone ⅡA and salvianolic acid B in Yangxin Ningshen pills. Methods HPLC analysis was carried out on a Agilent ZORBAX XDB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)column with acetonitrile-water with 0.1% phosphoric acid as mobile phase in gradient elution. The flow rate was 1.0 mL/min,and the column temperature was 30 ℃. Results The linearity range of tanshinone ⅡA and salvianolic acid B were 1.444-14.44 μg/mL and 38.84-388.4 μg/mL,and the correlation coefficients(R) of them were 0.999 9 and 0.999 5,respectively. The average recoveries were 101.42% for tanshinone ⅡA (RSD=3.06%),101.97% for salvianolic acid B (RSD=2.23%). Conclusion The method was simple,rapid and repeatable,and could be used for the quality control of Yangxin Ningshen pills.

收稿日期：2014-08-01

作者簡(jiǎn)介：謝琳(1982—)，女，工程師，從事中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，Email：xielinky@163.com；通信作者：郭鐘慧(1959—)，女，高級(jí)工程師，從事中藥新藥開(kāi)發(fā)研究，Email：guozh369@aliyun.com。

Determination of tanshinone ⅡA and salvianolic acid B in Yangxin Ningshen pills by HPLC

XIE Lin,ZHUANG Manxian,WANG Yaqi,HE Fenglei,GUO Zhonghui

(GuangzhouBaiyunshanChenlijiPharmaceuticalFactotyCompanyLimited,Guangzhou510288,China)

Key words:Yangxin Ningshen pill; tanshinone ⅡA; salvianolic acid B; HPLC; content determination

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015-01-13 8:40網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20150113.0840.001.html

養(yǎng)心寧神丸是廣州白云山陳李濟(jì)藥廠有限公司獨(dú)家品種，由黨參、丹參、大棗、山藥、蓮子等12味藥材制成，具有養(yǎng)心益脾、鎮(zhèn)靜安神的功效，主要用于治療神經(jīng)衰弱、心悸失眠、耳鳴目眩等?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)僅有性狀和鑒別項(xiàng)來(lái)判定藥品質(zhì)量，無(wú)質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定[1]；其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究是2015版《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)增訂內(nèi)容之一。黨參為方中君藥，在研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)黨參炔苷分離度不好、專屬性不強(qiáng)(陰性對(duì)照有干擾)，故未能作為質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定的指標(biāo)。而丹參具有祛瘀止痛、活血通絡(luò)、清心除煩之功效，作為臣藥，與黨參配伍，補(bǔ)氣活血、養(yǎng)心安神。它主要含有脂溶性的丹參酮類化合物和水溶性的酚酸類化合物，便于測(cè)定。

為更好地評(píng)價(jià)養(yǎng)心寧神丸的質(zhì)量，本文建立了高效液相色譜法(HPLC法)同時(shí)測(cè)定丹參酮ⅡA和丹酚酸B的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。方法分離效果與重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高，可以用于養(yǎng)心寧神丸的質(zhì)量控制。

1儀器與試藥

Agilent 1200 型高效液相色譜儀(帶DAD檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫公司)；Agilent ZORBAX XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；SB-5200 DTD超聲波處理器(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

養(yǎng)心寧神丸[廣州白云山陳李濟(jì)藥廠有限公司，批號(hào)分別為FP1051、ED1002、FW1171、FW1161、FP1052、FT1071、FT1151、FK1031，規(guī)格：6 g/袋，10 袋/盒]；養(yǎng)心寧神丸陰性制劑(由廣州白云山陳李濟(jì)藥廠有限公司提供)；丹參酮ⅡA對(duì)照品(批號(hào)：110766-200417)、丹酚酸B對(duì)照品(批號(hào)：111562-201212)由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；甲醇、乙腈為色譜純；乙醇為分析純；水為屈臣氏純凈水。

2方法與結(jié)果

2.1　溶液的制備

2.1.1混合對(duì)照品溶液的制備分別取丹參酮ⅡA、丹酚酸B對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含丹參酮ⅡA、丹酚酸B分別為6、160 μg的混合對(duì)照品溶液，即得。

2.1.2供試品溶液的制備取本品適量，研細(xì)，取約2 g，精密稱定。置具塞錐形瓶中，精密加入1%(體積分?jǐn)?shù)，下同)H3PO4甲醇溶液25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率300 W，頻率40 kHz)15 min，放冷，再稱定質(zhì)量。用1%H3PO4甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻、濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3陰性對(duì)照溶液的制備取處方組成中除丹參的其余藥材，按處方比例制備陰性制劑，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.2　色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

以Ag-ilent ZORBAX XDB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)柱為色譜柱；以乙腈為流動(dòng)相A，以0.1%H3PO4溶液為流動(dòng)相B，按表1程序進(jìn)行梯度洗脫；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：286 nm(丹酚酸B)、270 nm(丹參酮ⅡA)，進(jìn)樣量：10 μL。分別精密吸取對(duì)照品、供試品、陰性對(duì)照溶液10 μL，分別注入液相色譜儀，依法測(cè)定。陰性對(duì)照無(wú)干擾，見(jiàn)圖1。理論塔板數(shù)按丹參酮ⅡA 和丹酚酸B計(jì)算分別應(yīng)不低于4 000、2 000，丹參酮ⅡA 分離度為8.98，丹酚酸B分離度為3.85。

表1養(yǎng)心寧神丸中丹參酮ⅡA、丹酚酸B測(cè)定的梯度洗脫程序

Table 1The program of gradient elution of tanshinone ⅡA and salvianolic acid B in Yangxin Ningshen pills

t/minφ(A)/%φ(B)/%010903030703580204595550955

1.丹參酮ⅡA；2.丹酚酸B。

圖1混合對(duì)照品(A)、供試品(B)及陰性對(duì)照(C)溶液的HPLC圖

Figure 1The HPLC chromatogram of reference substances(A),sample(B) and negative control(C)

2.3　方法學(xué)考察

2.3.1線性關(guān)系的考察分別精密吸取丹參酮ⅡA、丹酚酸B混合對(duì)照品溶液(丹參酮ⅡA、丹酚酸B質(zhì)量濃度分別為14.44、388.4 μg/mL)1、2、4、6、8、10 mL，分別置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別進(jìn)樣10 μL，按“2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定，每一質(zhì)量濃度平行測(cè)定2次。以峰面積平均值為縱坐標(biāo)、對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得丹參酮ⅡA回歸方程：A=5.576 7×104ρ+2.491 8(R=0.999 9)，丹參酮ⅡA在1.444～14.44 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系；得丹酚酸B回歸方程：A=6.803 4×104ρ-40.779(R=0.999 5)，丹酚酸B在38.84～388.4 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.3.2精密度試驗(yàn)精密吸取同一混合對(duì)照品溶液(丹參酮ⅡA、丹酚酸B質(zhì)量濃度分別為14.44、388.4 μg/mL)，重復(fù)進(jìn)樣6次，按“2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果丹參酮ⅡA、丹酚酸B峰面積的RSD值分別為0.11%、0.20%，表明儀器精密度良好。

2.3.3重復(fù)性試驗(yàn)取同一批 (批號(hào)：FK1031) 養(yǎng)心寧神丸6份，每份約2 g，精密稱定，分別按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測(cè)定。結(jié)果丹參酮ⅡA的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.054 4 mg/g，RSD值為0.67%；丹酚酸B的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.809 3 mg/g，RSD值為0.82%。表明方法重復(fù)性良好。

2.3.4穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取同一供試品溶液(批號(hào)：FP1052) 10 μL，分別于制備后0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，按“2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果丹參酮ⅡA、丹酚酸B峰面積的RSD值分別為0.72%、0.32%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5加樣回收率試驗(yàn)取同一批(批號(hào)：ED1002)養(yǎng)心寧神丸9份，每份約1 g，精密稱定，分別置具塞錐形瓶中。分成3組、每組3份，分別加入混合對(duì)照品溶液(丹參酮ⅡA、丹酚酸B的質(zhì)量濃度分別為0.039 5、0.696 8 mg/mL)1、2、3 mL，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定，記錄峰面積、計(jì)算回收率。見(jiàn)表2。

表2　養(yǎng)心寧神丸中丹參酮ⅡA、丹酚酸B的加樣回收率結(jié)果

2.4　樣品測(cè)定

取8批養(yǎng)心寧神丸，每批平行2份，每份約2 g，精密稱定，分別按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測(cè)定。結(jié)果批號(hào)FP1051、ED1002、FW1171、FW1161、FP1052、FT1071、FT1151、FK1031的養(yǎng)心寧神丸中丹參酮ⅡA質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.050 1、0.065 8、0.059 2、0.083 9、0.051 0、0.079 3、0.075 9、0.054 5 mg/g，丹酚酸B質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.817 4、1.404 5、1.458 8、1.845 3、1.821 1、1.408 8、1.569 2、1.821 1 mg/g。

3討論

3.1　提取溶劑的選擇

丹參酮ⅡA、丹酚酸B分別為脂溶性和水溶性成分，為使2種成分能在同一溶劑中充分提取，分別考察了甲醇、75%(體積分?jǐn)?shù))甲醇、50%(體積分?jǐn)?shù))甲醇、乙醇、稀乙醇、1%(體積分?jǐn)?shù))H3PO4甲醇溶液、5%(體積分?jǐn)?shù))H3PO4甲醇溶液作為溶劑的提取效果[2-4]，結(jié)果采用1%(體積分?jǐn)?shù))H3PO4甲醇溶液為溶劑時(shí)丹參酮ⅡA、丹酚酸B的提取率，與《中國(guó)藥典》收載的“丹參”項(xiàng)下丹參酮ⅡA和丹酚酸B的提取率相當(dāng)[5]，因此選作本試驗(yàn)提取溶劑。

3.2　提取方法及時(shí)間的確定

取同一批(批號(hào)：FP1052)樣品，分別對(duì)超聲、加熱回流提取1 h的效果進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示超聲提取1 h樣品中丹參酮ⅡA、丹酚酸B的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，高于加熱回流1 h時(shí)的相應(yīng)值，故選取超聲提取作為樣品的提取方法。還分別考察了超聲處理15、30、45、60 min對(duì)樣品中丹參酮ⅡA、丹酚酸B質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定值的影響，結(jié)果表明結(jié)果較為接近，為提高效率，選擇15 min作為提取時(shí)間。

本試驗(yàn)所建立方法可同時(shí)測(cè)定養(yǎng)心寧神丸中脂溶性成分丹參酮ⅡA、水溶性成分丹酚酸B，相比藥典方法以及文獻(xiàn)報(bào)道方法[6-8]效率更高，并且方法穩(wěn)定、可靠，可用于養(yǎng)心寧神丸的質(zhì)量控制。

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(責(zé)任編輯：劉曉涵)