平陸百合脫毒試管苗鱗片的分化研究

殷麗娜，任建宏，趙娟*，王玉國(guó)，席叢林，尹美強(qiáng)，溫銀元，王育選

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院 山西 太谷 030801)

摘要：以平陸食用百合脫毒試管苗的鱗片為外植體，研究了不同接種部位和方式，不同植物激素種類和濃度對(duì)鱗片分化的影響。結(jié)果表明：平陸百合鱗片的分化能力為外層>中層>內(nèi)層，同一鱗片的不同部位分化能力為下段>中段>上段。接種方式以鱗片豎直插入培養(yǎng)基中為好，鱗片分化快，分化率高。試驗(yàn)中設(shè)置的培養(yǎng)基均可誘導(dǎo)鱗片分化，但附加不同種類和濃度的激素對(duì)鱗片分化出的小鱗莖的數(shù)量和生長(zhǎng)狀況影響不同，差異很大。其中以培養(yǎng)基MS+6-BA 0.8 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1上誘導(dǎo)出的小鱗莖數(shù)量多，生長(zhǎng)壯，適宜作為快繁時(shí)獲取大量鱗莖的培養(yǎng)基；在培養(yǎng)基MS+ZT 1.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1和MS+ZT 1.5 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1上誘導(dǎo)出的小鱗莖數(shù)量不多，但生長(zhǎng)健壯，可直接成苗，適宜作為誘導(dǎo)鱗片分化較大鱗莖的培養(yǎng)基；誘導(dǎo)鱗片分化愈傷組織的最適宜培養(yǎng)基為MS+2,4-D 1.0 mg·L-1+6-BA 0.5 mg·L-1，愈傷組織不經(jīng)轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基可直接分化鱗莖。

關(guān)鍵詞：平陸百合；鱗片；分化

收稿日期：2015-08-04修回日期：2015-09-18

作者簡(jiǎn)介：殷麗娜(1990-)，女(漢)，山西朔州人，碩士研究生，研究方向：植物組織培養(yǎng)

通訊作者：*趙娟，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師。Tel：13834836658；E-mail:sxndzhaojuan@163.com

基金項(xiàng)目：山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(20130311014-1) ；山西農(nóng)業(yè)大學(xué)引進(jìn)人才科研啟動(dòng)項(xiàng)目(2012YJ13)

中圖分類號(hào)：S644.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Differentiation of the Virus Free Scale ofLiliumbrowniivar.viridulum

Yin Lina, Ren Jianhong, Zhao Juan*, Wang Yuguo, Xi Conglin, Yin Meiqiang, Wen Yinyuan, Wang Yuxuan

(CollegeofAgriculture,ShanxiAgriculturalUniversity,TaiguShanxi030801,China)

Abstract:Using the test tube flake seedings of Lilium brownii var. viridulum as explants, we studied different inoculation sites and methods, the effect of different plant hormones species and concentrations on the differentiation of scales. The results showed that: The differentiation ability of Scale in Lilium brownii var. viridulum was: Outer > middle > inner layer, the ability to different parts of the same scale was: Upper> middle> section and the vertical scale inserts the culture medium, the differentiation and differentiation rats were the best. The Experiment seted all of the medium that could induce the differentiation of scales. The number and growth status of the small bulbs which were differentiated from the scales were differed greatly, because of the different kinds and concentrations of hormones. MS+6-BA 0.8 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1 was induced the large number of small bulbs, growth and strong, the medium was suitable for the development of a large number of bulbs in the rapid propagation. The number of small bulbs induced by MS+ZT 1.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1 and MS+ZT 1.5 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1 was not much, but strong greatly and directly seeding, suitable as a medium for inducing the differentiation of the larger bulbs. The most suitable medium was MS+2,4-D1.0 mg·L-1+6-BA 0.5 mg·L-1 which induced scale differentiation of callus, the callus without conversion medium direct differentiation of the bulb.

Key words:Liliumbrowniivar.viridulum; Scales; Differentiation

平陸百合是百合科百合屬多年生草本球根植物，含豐富蛋白質(zhì)、脂肪、淀粉、維生素，及少量鈣、磷、鐵等，食用價(jià)值高，具有補(bǔ)中益氣，溫肺止咳，安神、清心之功效。近年來(lái)隨著國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)需求擴(kuò)大，平陸百合的生產(chǎn)和消費(fèi)逐年增加。傳統(tǒng)繁殖方法繁殖系數(shù)低，經(jīng)過多代繁殖以后，常常會(huì)造成種性退化和病毒積累，從而影響百合的產(chǎn)量和質(zhì)量。

利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)繁殖百合可以有效去除病毒，在短期內(nèi)提供大量?jī)?yōu)質(zhì)百合種球，彌補(bǔ)種球繁殖的不足，是百合進(jìn)行商品化以及產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的必然趨勢(shì)[1]。目前關(guān)于食用百合的多數(shù)研究集中在宜興百合[2，3]、蘭州百合等[4，5]，尚未見到平陸百合組織培養(yǎng)的相關(guān)報(bào)道。本試驗(yàn)以平陸百合脫毒試管苗鱗片作為外植體，研究不同激素濃度、配比對(duì)外植體分化和增殖的影響，為平陸食用百合快速繁殖規(guī)?；a(chǎn)提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

平陸食用百合(Liliumbrowniivar.viridulum)脫毒試管苗由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1接種部位和接種方式選擇

以平陸百合脫毒試管苗的鱗片為外植體，由外向內(nèi)剝離鱗片，分別將每塊鱗片切割成上、中、下3段，以豎直插入和平鋪放置2種方式接種，共18個(gè)處理(表1)，每個(gè)處理接種24個(gè)鱗片，重復(fù)3次。接種于附加6-BA 0.5 mg·L-1、NAA 0.1 mg·L-1的MS培養(yǎng)基上，7 d后開始觀察其分化情況，30 d后統(tǒng)計(jì)鱗片的分化率和發(fā)生分化的鱗片上小鱗莖的分化數(shù)。

1.2.2培養(yǎng)基與激素種類水平設(shè)置

本試驗(yàn)所用培養(yǎng)基均以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加蔗糖100 g·L-1，瓊脂6 g·L-1，調(diào)節(jié)pH值至5.6～5.8，121 ℃高壓滅菌20 min。培養(yǎng)溫度(25±2) ℃，光照14 h·d-1，光照強(qiáng)度1 000～2 000 lx。

以平陸百合脫毒試管苗的鱗片為外植體，切割后接種于附加不同植物激素的MS培養(yǎng)基中,具體激素種類水平設(shè)置詳見表2～表5。7 d后每天觀察其分化生長(zhǎng)及污染情況，30 d后統(tǒng)計(jì)鱗片分化率及分化情況。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析方法

鱗片分化率=發(fā)生分化的鱗片數(shù)/接種鱗片數(shù)×100%；增殖倍率=分化出的小鱗莖數(shù)/發(fā)生分化的鱗片數(shù)；愈傷組織誘導(dǎo)率=分化愈傷組織的鱗片數(shù)/接種鱗片數(shù)×100%

試驗(yàn)采集的數(shù)據(jù)均由DPS 7.05軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2結(jié)果與分析

2.1不同接種部位及接種方式對(duì)鱗片分化的影響

由表1可見，不同鱗片片層，不同接種部位及不同接種方式對(duì)鱗片的分化有較大影響。外層鱗片和中層鱗片的分化能力明顯大于內(nèi)層鱗片。同一鱗片的上段分化能力最差，中段較好，下段最強(qiáng)，且鱗片下段的分化率明顯高于中上段。方差分析結(jié)果顯示，表1中的18組處理之間差異顯著(p<0.05)；以A3的分化率最高，即外層鱗片，其下部在豎直放置接種時(shí)，比平鋪放置的鱗片分化快，且分化率達(dá)100%(圖1、圖2)。故對(duì)平陸百合的鱗片進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，選用外層下段作為外植體最佳，且以豎直放置接種分化快，分化率高。

2.2不同激素對(duì)鱗片不定芽分化及增殖的影響

2.2.16-BA與NAA配比對(duì)鱗片分化及增殖的影響

由表2可見，6-BA和NAA 濃度由低到高的變化過程中，鱗片分化率以及增殖倍率呈現(xiàn)階段變化的趨勢(shì)。方差分析結(jié)果可得，在不同濃度的6-BA和NAA處理下，分化率與增殖倍率這兩個(gè)生長(zhǎng)指標(biāo)變化一致。表2的9組處理在分化率及增殖率上差異顯著(p<0.05)，其中B5培養(yǎng)基的差異顯著高于其他8組，即附加6-BA 0.8 mg·L-1和NAA 0.1 mg·L-1時(shí)，鱗片誘導(dǎo)分化最快，增值率最高，分別為96%和7.5倍，分化出的小鱗莖增殖快，長(zhǎng)勢(shì)健壯。故在MS培養(yǎng)基中附加6-BA 0.8 mg·L-1和NAA 0.1 mg·L-1適宜作為平陸百合快繁時(shí)鱗莖大量增殖的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

2.2.2ZT與NAA配比對(duì)鱗片分化及增殖的影響

由表3可見，附加不同濃度ZT和NAA，對(duì)百合鱗片分化與增殖的影響不同，差異明顯。對(duì)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，在不同濃度的6-BA和NAA處理下，分化率與增殖倍率這兩個(gè)生長(zhǎng)指標(biāo)變化幾乎一致，結(jié)果可得，表3中9組處理在分化率及增殖率上都差異顯著(p<0.05)。其中C6培養(yǎng)基的差異顯著高于其他8組，即附加ZT 1.0 mg·L-1和NAA 0.2 mg·L-1時(shí)，鱗片分化率達(dá)100%，增值率為1.91倍，分化出的小鱗莖長(zhǎng)勢(shì)特別健壯，可直接成苗。故在MS培養(yǎng)基附加ZT1.0 mg·L-1和NAA0.2 mg·L-1，適宜作為誘導(dǎo)鱗片分化較大鱗莖的培養(yǎng)基。

表1　不同接種部位及接種方式對(duì)鱗片分化的影響

注：同列不是小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。下同(表2～表5)。

Note：Different lowercase letters show significant difference at the 0.05 level in the same column,respectively(Table 2～5).

圖版?、瘛?.鱗片豎直插入接種；2.鱗片平鋪放置接種；3.愈傷組織的誘導(dǎo):培養(yǎng)基MS+2,4-D1.0mg·L -1+6-BA0.5mg·L -1；4. 鱗片分化小鱗莖:培養(yǎng)基MS+6-BA0.8mg·L -1+NAA0.1mg·L -1；5. 鱗片分化小鱗莖:培養(yǎng)基MS+ZT1.0mg·L -1+NAA0.2mg·L -1；6.鱗片分化小鱗莖:培養(yǎng)基MS+ZT1.5mg·L -1+IBA0.1mg·L -1。 Plate?、瘛ig.1. Scale vertical insertion；Fig.2. Scale tile placement； Fig.3. The most suitable induce callus culture medium of the scale；Fig.4. Proliferation of the most suitable medium of the scale MS+6-BA0.8mg·L-1+NAA0.1mg·L-1；Fig.5. Proliferation of the medium of the scale MS+ZT1.0mg·L-1+NAA0.2mg·L-1；Fig.6. Proliferation of the medium of the scale MS+ZT1.5mg·L-1+IBA0.1mg·L-1.

處理編號(hào)Code6-BA/mg·L-1NAA/mg·L-1接種數(shù)Inoculationnumber分化數(shù)Differentiationnumber分化率/%Differentiationrate芽增殖總數(shù)Totalbudproliferation增殖倍率ProliferationrateB10.50.05251872.0d1065.89dB20.80.05251352.0h614.69hB31.00.0525936.0i283.11iB40.50.10251456.0g735.21gB50.80.10252496.0a1807.5aB61.00.10251768.0e995.82eB70.50.15251560.0f795.27fB80.80.15252288.0b1516.86bB91.00.15251976.0c1166.10c

表3　ZT與NAA配比對(duì)鱗片分化及增殖的影響

2.2.3ZT與IBA配比對(duì)鱗片分化及增殖的影響

以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的ZT與IBA, 其對(duì)百合鱗莖分化與增殖的影響如表4所示。在ZT和IBA 濃度由低到高的變化過程中，鱗片分化率以及增殖倍率沒有較明顯規(guī)律。方差分析可得，分化率與增殖倍率這兩個(gè)生長(zhǎng)指標(biāo)變化一致，表4中9組處理在分化率及增殖率上都差異顯著(p<0.05)，其中D8培養(yǎng)基的差異顯著高于其他8組，既在MS培養(yǎng)基附加ZT 1.5 mg·L-1和IBA 0.1 mg·L-1，也適宜作為誘導(dǎo)鱗片分化較大鱗莖的培養(yǎng)基。

2.2.42,4-D與6-BA配比對(duì)鱗片分化及增殖的影響

如表5所示，在MS基本培養(yǎng)基中添加不同濃度的2,4-D和6-BA，可誘導(dǎo)百合鱗莖分化愈傷組織。在培養(yǎng)基中附加2,4-D 1.0 mg·L-1、6-BA 0.5 mg·L-1時(shí)，百合鱗片愈傷誘導(dǎo)率最高達(dá)40%，形成愈傷組織黃白色、顆粒狀，不經(jīng)轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基可直接分化百合苗。方差分析可得，表5中9組處理在愈傷誘導(dǎo)率上均差異顯著(p<0.05)，其中E2培養(yǎng)基的差異顯著高于其他8組，可見MS培養(yǎng)基中附加2,4-D 1.0 mg·L-1、6-BA 0.5 mg·L-1時(shí)，為誘導(dǎo)鱗片分化愈傷組織的最適宜培養(yǎng)基。

3討論

一般認(rèn)為MS基本培養(yǎng)基較適合百合組織培養(yǎng)，效果較好。較其他培養(yǎng)基如N6、B5等效果好。盧其能[6]以龍牙百合鱗片為外植體研究了MS、White和B5三種培養(yǎng)基對(duì)分化效果的對(duì)比試驗(yàn)，結(jié)果顯示MS培養(yǎng)基效果最佳，White培養(yǎng)基效果

表4　ZT與IBA配比對(duì)鱗片分化及增殖的影響

表52,4-D與6-BA配比對(duì)鱗片分化及增殖的影響

Table 5Effects of 2,4-D and 6-BA on the differentiation and proliferation of scale

處理編號(hào)Code2,4-D/mg·L-16-BA/mg·L-1接種數(shù)Inoculationnumber出愈數(shù)Callusnumber愈傷組織誘導(dǎo)率Callusinductionrate/%E11.00.225728bE21.00.5251040aE31.50.22500gE41.50.52500gE51.51.025520dE62.00.225312fE72.00.525416eE82.01.02500gE92.01.525624b

最差。楊柏云等[7]研究了MS、改良MS和B5液體培養(yǎng)基對(duì)切花百合小鱗莖的增殖影響，結(jié)果顯示MS和改良MS的增殖效果高于B5，兩者之間差異不明顯。本試驗(yàn)選取MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基。

通過不同接種部位對(duì)誘導(dǎo)不定芽的影響，得出結(jié)論：不同鱗片片層的分化能力外層>中層>內(nèi)層，同一鱗片片層的不同部位的分化能力為下段>中段>上段，說(shuō)明外層肥厚的鱗片及其與鱗莖盤連的基部發(fā)芽最強(qiáng)，這與丁蘭[8]，王剛[9]等的研究結(jié)果基本一致。陳麗靜等[10]研究表明百合的鱗莖是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的儲(chǔ)藏器官和進(jìn)行無(wú)性繁殖的器官，在鱗片的基部，無(wú)性繁殖的能力反應(yīng)最強(qiáng)，即分化小鱗莖的能力最強(qiáng)。試驗(yàn)比較鱗片的不同接種方式對(duì)誘導(dǎo)不定芽的影響，得出豎直接種的鱗片比平放接種鱗片有利于分化。原因可能是由于鱗片豎直接種符合植株在形態(tài)學(xué)上的生長(zhǎng)規(guī)律。陳麗靜等[10]認(rèn)為植物的極性幾乎不會(huì)影響到小鱗莖的分化。王剛等[9]認(rèn)為蘭州百合鱗片在培養(yǎng)基上的不同放置方式對(duì)百合的誘導(dǎo)也有影響，其誘導(dǎo)分化芽的能力：內(nèi)側(cè)向上放置>豎直放置>內(nèi)側(cè)向下平放。這與本試驗(yàn)所得結(jié)論豎直接種鱗片比平放接種鱗片更容易分化不定芽一致。

植物激素的種類和比值決定著器官的分化。不同百合品種類型、不同外植體類型和所獲取的產(chǎn)物不同，在培養(yǎng)基中附加的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的類型和配比也不同。在百合組織培養(yǎng)中較多選用6-BA和NAA配比，誘導(dǎo)鱗片分化增殖，不同品種對(duì)激素之間配比的差異較大。本實(shí)驗(yàn)選用6-BA與NAA、ZT與NAA、ZT與IBA的配比，研究百合鱗片的分化及增殖。6-BA和NAA配比時(shí)，以附加6-BA 0.8 mg·L-1、NAA 0.1 mg·L-1，分化率達(dá)100%，增殖倍數(shù)7.5倍，效果最好。這與劉靜[11]、張彥妮[12]等的研究結(jié)果相近，與宋建英等[13～15]的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果不同，這可能與品種之間存在差異，試驗(yàn)條件不同有關(guān)。ZT和NAA、ZT和IBA的配比適宜濃度時(shí)，分化率可達(dá)100%，但增殖倍數(shù)較6-BA和NAA配比時(shí)低，但分化出的鱗莖生長(zhǎng)健壯，可直接成苗。可見，在培養(yǎng)基中附加不同植物激素種類和濃度對(duì)鱗片的分化情況有明顯影響，誘導(dǎo)分化的鱗莖數(shù)量和生長(zhǎng)情況差異明顯，可根據(jù)試驗(yàn)和生產(chǎn)中的具體需求選擇不同的培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得不同的材料。

2,4-D為誘導(dǎo)愈傷組織最常用的植物生長(zhǎng)物質(zhì)，本試驗(yàn)中不同濃度的2,4-D與6-BA配比時(shí)，有多組培養(yǎng)基沒有成功誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，篩選出較好的誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基為MS+2,4-D 1.0 mg·L-1+6-BA 0.5 mg·L-1，誘導(dǎo)率僅達(dá)40%，這與邵春昕等[16]西藏卷丹百合愈傷組織誘導(dǎo)率為93%；麝香百合的鱗莖愈傷組織誘導(dǎo)達(dá)100%[17]相比，可能是由于品種之間的差異，平陸百合愈傷組織的誘導(dǎo)比其它品種困難，也可能是本試驗(yàn)所設(shè)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件問題，還需要進(jìn)一步試驗(yàn)篩選能夠獲得較高愈傷組織誘導(dǎo)率的適宜培養(yǎng)基。

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(編輯：馬榮博)