重金屬鉛鉻對星豹蛛體內(nèi)幾種重要酶活性的影響

李薩麗1,李娜1,張曉陽1,李銳1*,李生才1,洪堅平2

(1.山西農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院，山西 太谷 030801; 2.山西農(nóng)業(yè)大學 資源環(huán)境學院，山西 太谷 030801)

摘要：為了探討重金屬鉛、鉻脅迫對害蟲天敵星豹蛛Pardosa astrigera L.Koch成蛛體內(nèi)幾種重要酶活性的影響，采取人工添毒法用不同濃度的重金屬Pb2+、Cr6+溶液飼喂星豹蛛成蛛5 d，10 d，15 d，20 d，25 d，研究不同濃度，不同時間段鉛、鉻脅迫下的星豹蛛體內(nèi)過氧化氫酶CAT、超氧化物歧化酶SOD和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶GST的酶活性變化及其相關性。結(jié)果顯示，鉛、鉻脅迫下，星豹蛛體內(nèi)的過氧化氫酶CAT活性變化趨勢大致相同，但變化程度不同；超氧化物歧化酶SOD的活力大小均高于對照，且兩種重金屬作用下的變化趨勢不同，鉛(200，400，1 000 mg·L-1)脅迫下SOD活性在10 d和20 d出現(xiàn)兩個高峰值，分別是對照的3.112 7、4.178 5、2.992 4和1.175 8、1.132 2、1.249 3倍，鉻(0.25，0.5，2.5 mg·L-1)脅迫下在20 d達到高峰值，為對照的1.141 6、1.431 4、1.238 5倍；谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶GST的酶活性在鉛脅迫下均小于對照，鉻脅迫下只在低濃度(0.25，0.5 mg·L-1)處理下作用20 d顯著高于對照(P<0.05)?？梢?，重金屬鉛、鉻脅迫下，總體上是抑制了星豹蛛體內(nèi)GST的活力，激活了CAT和SOD的酶活力，從而達到保護自身的作用。而且這三種酶活力的變化與重金屬的種類、劑量和作用時間密切相關。

關鍵詞：星豹蛛；鉛；鉻；酶活性

收稿日期：2015-06-10修回日期：2015-08-07

作者簡介：李薩麗(1990-)，女(漢)，山西運城人，碩士研究生，研究方向：昆蟲生態(tài)與綜合治理

通訊作者：*李銳，副教授，碩士生導師。Tel：13994576619；E-mail：sxaulr@126.com

基金項目：中國博士后基金(112125)；山西省科技攻關項目(20130311011-5,20120311013-)；山西省留學基金項目(2013-重點6)

中圖分類號：S476.2文獻標識碼：A

Effects of Plumbum and Chromium Stressed on Activities of Some Enzymes in Wolf Spider, Pardosa astrigera (Araneae:Lycosidae)

Li Sali1, Li Na1, Zhang Xiaoyang1, Li Rui1*, Li Shengcai1, Hong Jianping2

(1.CollegeofAgronomy,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China； 2.CollegeofResourcesandEnvironment,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China)

Abstract:In order to clarify the enzyme reaction of plumbum and chromium stressed in pest enemy Pardosa astrigera. Feeding Pardosa astrigera 5 d, 10 d, 15 d, 20 d, 25 d on different concentration of plumbum and chromium which were sexual maturity from field collected. The activities of catalase and superoxide dismutase and glutathione-S-transferase in the Pardosa astrigera after treated with plumbum and chromium were evaluated in different concentrations and different times. The results showed that the activities of catalase were roughly the same change trend under two heavy metal stressed, but they have different degree of change.The superoxide dismutase activities were higher than control and the change trend under the action of two kinds of heavy metal was different, superoxide dismutase activity of plumbum stressed on the 10 d and 20 d appeared two peak values, respectively was comparison of 3.112 7, 4.178 5, 2.992 4 and 1.175 8, 1.132 2, 1.249 3 fold. The other appeared one peak value at 20 d, being 1.141 6, 1.431 4, 1.238 5-fold higher than that of the water control, respectively. The activities of glutathione-S-transferase under the stress of plumbum were less than control, only in low chromium stress concentration treatment of 20 d was significantly higher than control (P<0.05). It was obvious that the activities of glutathione-S-transferase were inhibited, and the activities of catalase and superoxide dismutase were enhanced in the adult of Pardosa astrigera being treated with plumbum and chromium, thus the important natural enemy can protect themselves. And enzyme activity changes associated with heavy metal species, dose,and duration.

Key words:Pardosaastrigera; Plumbum; Chromium; Enzyme activity

星豹蛛(PardosaastrigeraL.Koch)屬蛛形綱(Arachnida)狼蛛科(Lycosidae)豹蛛屬(Pardosa)，是農(nóng)林害蟲的主要捕食性天敵，具有數(shù)量大、生態(tài)多樣、分布廣泛等特點，在害蟲生物防治中具有極其重要的作用，是一種比較有利用價值的天敵[1～3]。

近年來重金屬源農(nóng)藥污染嚴重，不僅污染生態(tài)環(huán)境，還可以通過食物鏈轉(zhuǎn)移和積累[4]，對害蟲天敵產(chǎn)生毒害作用。研究發(fā)現(xiàn)，星豹蛛種群數(shù)量逐漸下降，造成農(nóng)田環(huán)境嚴重惡化，作為生防資源，應該受到保護。到目前為止，鉛(Pb2+)、鉻(Cr6+)已被列為主要的農(nóng)業(yè)源重金屬環(huán)境污染物[5]，在生物體內(nèi)具有蓄積性，并在國內(nèi)多種水生和陸生的動植物體內(nèi)檢測到[6]。

國內(nèi)外學者就重金屬對包括無脊椎動物在內(nèi)的動物機體結(jié)構及生理生化效應等方面的影響做了較多的研究工作[7]。有關重金屬污染對昆蟲影響的文獻逐漸增多，涉及對雙翅目、鱗翅目、鞘翅目和直翅目昆蟲等抗氧化酶的影響[8～12]。研究結(jié)果顯示，重金屬脅迫與其能夠誘導生物體產(chǎn)生氧化損傷密切相關，在長期的進化過程中，生物體內(nèi)也形成了一整套高效的抗御自由基損傷作用的抗氧化防御系統(tǒng)，包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD) 、過氧化氫酶(catalase, CAT) 和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase，GST)等[13]。但有關重金屬對害蟲天敵影響的研究報道較少。

本研究采用人工添毒法，測定鉛、鉻脅迫對害蟲天敵星豹蛛體內(nèi) SOD，CAT和 GST酶活性的影響，為進一步保護與利用星豹蛛進行有害生物綜合防治以及環(huán)境中重金屬污染監(jiān)測提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1實驗材料

星豹蛛采自山西農(nóng)業(yè)大學小麥試驗田(東經(jīng)111°32′，北緯37°26′，海拔781.9 m)，未施過任何藥劑。帶回實驗室單頭置于試管內(nèi)(內(nèi)徑1.5 cm，長8 cm)，放入人工氣候箱內(nèi)飼養(yǎng)(L∶D=16∶8，RH=70%)，濕棉球保濕，每次喂果蠅6頭，每2 d喂一次，試驗前饑餓處理24 h待用。

1.2重金屬脅迫和樣品制備

以硝酸鉛Pb(NO3)2、鉻酸鉀K2CrO4作為Pb2+，Cr6+源，用蒸餾水將Pb2+濃度配置為1 000 mg·L-1、400 mg·L-1、200 mg·L-1三個濃度；Cr6+的濃度為2.50 mg·L-1、0.50 mg·L-1、0.25 mg·L-1三個濃度，清水作對照。采用人工添毒法，每個濃度處理30頭性成熟的星豹蛛，每2 d注射一次配好的藥液0.5 mL于試管內(nèi)的棉球上供星豹蛛飲用。處理5 d、10 d、15 d、20 d、25 d后各取五頭稱重凍于-70 ℃冰箱備用。

1.3酶活性的測定

各處理組的星豹蛛按重量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例加入9倍體積的生理鹽水于高速冷凍離心機下2 500 r·min-1，離心10 min，取上清液作為酶源。根據(jù)試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明加入相應試劑，用Spectra Max M5酶標儀(美國Molecular Devices公司)測吸光度值，計算酶活性。

1.3.1過氧化氫酶(CAT)活力測定

主要原理：過氧化氫酶分解H2O2的反應可通過加入鉬酸銨迅速中止，剩余的H2O2與鉬酸銨作用產(chǎn)生一種淡黃色的絡合物，用酶標儀405 nm處測定其生成量，以每毫克蛋白每秒分解1 μmol H2O2的量為一個活力單位(U)，可計算出CAT的活力。

1.3.2超氧化物歧化酶(SOD)活力測定

1.3.3谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)活力測定

主要原理：以谷胱甘肽作底物，經(jīng)GST作用，與還原型谷胱甘肽(GSH)反應可生成黃色硫醇尿酸衍生物，其活力以催化GSH氧化的反應速度及單位時間內(nèi)GSH減少的量來表示，37 ℃水浴中反應10 min，用酶標儀340 nm處測定OD值。

1.3.4蛋白含量測定

參考Bradford(1976)法，采用考馬斯亮藍G250測定酶液中可溶性蛋白含量。以牛血清蛋白制作標準曲線y = 0.003 1x+0.545 3 (R2= 0.996 0，p<0.01)，其中x為蛋白含量(μg)，y為OD值。

具體操作步驟：按CAT、SOD和GST試劑盒說明進行。(CAT、SOD和GST試劑盒購自南京建成生物工程研究所)

1.4數(shù)據(jù)處理方法

實驗結(jié)果以平均值±標準誤表示，采用SPSS 16.0軟件進行方差分析與多重比較。

2結(jié)果與分析

2.1鉛和鉻對星豹蛛CAT活性的影響

2.1.1鉛脅迫星豹蛛CAT活性的影響

鉛脅迫星豹蛛成蛛后其體內(nèi)CAT活性變化如表1所示，酶活性變化趨勢為先上升后下降(見圖1)。清水對照組的CAT活性變化較大，在不同的處理時間內(nèi)差異顯著(P<0.05)，處理15 d CAT活性最高，20～25 d降到最低。用鉛處理后，酶活性最高點出現(xiàn)在200 mg·L-1作用下15 d，其活力為(2 361.98±80.89) U·mg-1prot，為對照的1.467 4倍；最低點出現(xiàn)在1 000 mg·L-1作用下25 d，其活力為(560.76±4.77) U·mg-1prot，為對照的0.847 1倍。在鉛脅迫5 d內(nèi)，各處理組的CAT活性均小于對照，分別為對照的0.975 1、0.964 6、0.893 9倍，說明鉛處理后CAT活性被抑制。10～15 d，各處理組的CAT活性都明顯上升，在15 d達到最大，分別為對照的1.467 4、1.315 7、1.201 2倍。20 d后隨著鉛脅迫時間的延長，各處理組的CAT活性又開始下降，25 d后降到最低。在鉛脅迫的25 d內(nèi)，低濃度處理的星豹蛛體內(nèi)CAT酶活性較高，而高濃度處理下活性有所下降，原因可能是低濃度的鉛溶劑可刺激星豹蛛體內(nèi)保護酶系，而高劑量作用下抑制保護酶系，造成氧自由基在體內(nèi)的聚集，從而導致蟲體死亡。

表1　鉛處理對星豹蛛體內(nèi)過氧化氫酶活性/U·mg -1 prot的影響

注:表中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤；同行不同大寫字母表示差異顯著，同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05,新復極差法)；下同。

Notes: The data in the table are mean±SE. Significant difference was found in capital letters in the same row, lowercase letters in the same column are different significantly by Duncan′s multiple range test(P<0.05.The same below.

圖1　鉛處理對星豹蛛CAT活性的影響 Fig.1　Effect of plumbum on CAT activity in Pardosa astrigera

2.1.2鉻脅迫星豹蛛CAT活性的影響

鉻脅迫星豹蛛成蛛后體內(nèi)CAT活性變化見表2，處理組與對照組在不同時間段的變化趨勢相似，都是在15 d上升到峰值，隨后顯著下降(P<0.05)，25 d降到最低(見圖2)。鉻處理組內(nèi)CAT活性最高點出現(xiàn)在0.5 mg·L-1作用15 d，值為(2 112.54±76.98) U·mg-1prot，是對照的1.312 5倍；最低點出現(xiàn)在2.5 mg·L-1作用25 d，值為(544.52±6.06) U·mg-1prot，是對照的0.822 6倍。鉻處理5 dCAT活性較低，5～20 dCAT活性均大于對照，說明鉻處理后短時間內(nèi)激活了星豹蛛體內(nèi)的CAT酶活性，20～25 dCAT活性顯著下降(p<0.05)，結(jié)果表明星豹蛛體內(nèi)CAT活性與重金屬鉻飼喂存在顯著的時間效應關系。

2.2鉛和鉻對星豹蛛SOD活性的影響

2.2.1鉛脅迫對星豹蛛SOD活性的影響

鉛處理星豹蛛成蛛后其體內(nèi)SOD活性的測定

表2　鉻處理對星豹蛛體內(nèi)過氧化氫酶活性/U·mg -1 prot-的影響

圖2　鉻處理對星豹蛛CAT活性的影響 Fig.2　Effect of chromium on CAT activity in Pardosa astrigera

結(jié)果如表3所示，對照組SOD活性變化較大，在不同處理時間內(nèi)差異顯著(P<0.05)，其中在5～

表3　鉛處理對星豹蛛體內(nèi)超氧化物歧化酶活性/U·mg -1 prot的影響

2.2.2鉻脅迫對星豹蛛SOD活性的影響

鉻處理星豹蛛成蛛后SOD活性測定結(jié)果見表4，各處理組酶活力均高于對照，最大值出現(xiàn)在0.5 mg·L-1作用20 d，值為(336.31±41.85) U·mg-1prot，最小值出現(xiàn)在2.50 mg·L-1作用10 d，值為(105.31±0.66) U·mg-1prot。鉻處理組酶活性隨著時間的變化呈波浪式變化(見圖4)，在處理10 d時，SOD活性降到一個低峰，各處理組酶活性分別是對照的2.067 1、1.915 5、1.888 6倍；處理20 d，SOD活性又上升到一個峰值，各處理組酶活性分別是對照的1.141 6、1.431 4、1.238 5倍。鉻處理25 d，不同濃度處理間差異顯著(p<0.05)分別為對照的6.322 7、10.698 0、8.279 8倍。結(jié)果顯示，鉻處理星豹蛛成蛛后激活了其體內(nèi)的SOD活性。

表4　鉻處理對星豹蛛體內(nèi)超氧化物歧化酶活性/U·mg -1 prot的影響

圖3　鉛處理對星豹蛛SOD活性的影響 Fig.3　Effect of plumbum on SOD activity in Pardosa astrigera

圖4　鉻處理對星豹蛛SOD活性的影響 Fig.4　Effect of chromium on SOD activity in Pardosa astrigera

2.3鉛和鉻對星豹蛛GST活性的影響

2.3.1鉛脅迫對星豹蛛GST的影響

鉛處理星豹蛛成蛛，其體內(nèi)GST活性變化如表5，對照組星豹蛛的GST酶活力在不同處理時間內(nèi)差異顯著(P<0.05)，其中20 d活性最高，10 d活性最低。鉛處理后，最大值出現(xiàn)在200 mg·L-1作用5 d，值為(3 450.67±7.90) U·mg-1prot；最小值出現(xiàn)在200 mg·L-1作用10 d，值為(748.92±4.75) U·mg-1prot。各處理組的酶活變化趨勢不同，低濃度處理下，星豹蛛體內(nèi)GST活性變化與對照相似，即先顯著下降后又顯著上升，最后再顯著下降(p<0.05)；400 mg·L-1處理下，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的活性在10 d，20 d出現(xiàn)兩個低峰值，其值為(1 057.71±9.02) U·mg-1prot和(1 060.71±5.22) U·mg-1prot；1 000 mg·L-1處理下，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的活性在10 d，20 d出現(xiàn)兩個高峰值，其值為(1 687.77±54.67) U·mg-1prot和(2 293.78±21.00) U·mg-1prot(見圖5)。雖然各處理組都出現(xiàn)峰值但是各處理組的GST活性均小于對照，說明鉛脅迫對星豹蛛體內(nèi)GST的激活作用較弱。

圖5　鉛處理對星豹蛛GST活性的影響 Fig.5　Effect of plumbum on GST activity in Pardosa astrigera

表5　鉛處理對星豹蛛體內(nèi)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性/U·mg -1 prot的影響

2.3.2鉻脅迫對星豹蛛GST的影響

鉻處理星豹蛛成蛛后其體內(nèi)GST活性見表6，各處理組GST活性最大值出現(xiàn)在0.25 mg·L-1作用20 d，值為(7 884.67±62.08) U·mg-1prot，為對照的1.386 9倍；最小值出現(xiàn)在0.50 mg·L-1作用25 d，值為(478.75±4.14) U·mg-1prot，僅為對照的0.225 0倍。處理組的活性變化趨勢與對照相似，5～10 d酶活性受到抑制，10 d降到低峰，分別為對照的1.245 6、0.844 5、1.075 3倍；10～20 d酶活性顯著上升(P<0.05)20 d升到高峰，分別為對照的1.386 9、1.331 6、0.824 1倍。同一時間處理，不同濃度下差異顯著(P<0.05)。低濃度的鉻處理，酶活力在20 d顯著高于對照，說明在鉻脅迫星豹蛛過程中，其體內(nèi)的GST酶起到了解毒作用，保護機體免受外來毒物的影響。

表6　鉻處理對星豹蛛體內(nèi)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性/U·mg -1 prot的影響

圖6　鉻處理對星豹蛛GST活性的影響 Fig.6　Effect of chromium on GST activity in Pardosa astrigera

3討論

外源毒物進入星豹蛛體內(nèi)需要經(jīng)過氧化、還原、水解等多種方式降解，然后將代謝物排出體外，這些過程都需要由一系列酶系催化完成，抗氧化防御即是其中之一，如果其抗氧化防御機制被打破，自由基的產(chǎn)生就會增多，從而引起氧化應激損傷。超氧化物歧化酶SOD、過氧化氫酶CAT和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶GST是重要的抗氧化酶系。本文分析了鉛和鉻處理后對上述三種酶的影響。

研究結(jié)果顯示，重金屬鉛、鉻處理激活了星豹蛛體內(nèi)CAT活性，但是隨時間的延長CAT活性下降，且在高濃度的重金屬脅迫下可能抑制保護酶，造成氧自由基在體內(nèi)的聚集，從而導致蟲體死亡。而且鉛與鉻脅迫下，CAT活性變化趨勢雖相同但變化的程度不同。這些結(jié)果表明星豹蛛體內(nèi)CAT活性與重金屬的種類密切相關。該結(jié)論與吳啟仙等對重金屬對昆蟲抗氧化酶影響研究進展[14]中所述的結(jié)果相同。

GST 能夠催化還原性谷胱甘肽(GSH)的硫醇基與親電化合物結(jié)合，增加后者的可溶性，有

利于將其從細胞內(nèi)排出，同時其也參與清除由重金屬引起的對機體有害的氧自由基，保護機體免遭氧化壓力的脅迫[15]。本文結(jié)果顯示，在短時間內(nèi)可以抑制星豹蛛的GST 活性，原因可能是星豹蛛初次接觸鉛、鉻溶液，尚處于敏感階段。隨著時間延長又激活星豹蛛的GST 活性，GST 活性的升高，可能是昆蟲的一種應激防御反應，增強對重金屬的解毒代謝，以抵御由重金屬引起的氧化損傷。這些結(jié)果表明，GST 活性的變化與作用時間密切相關，與劉耀明等研究鎘和鉻急性染毒對中華稻蝗解毒酶及多酚氧化酶的影響的結(jié)果相似[16]。

綜上所述，鉛、鉻脅迫星豹蛛，在作用不同時間后其體內(nèi)的CAT、SOD、GST的活性受到了不同程度的影響，三者交互作用，在某種程度上可以激活相關抗氧化酶的活性，從而增強機體的解毒能力，降低或避免外源物對機體的損傷，但重金屬染毒后在星豹蛛體內(nèi)是否還有更有效的解毒途徑，有待于進一步研究和探索。

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(編輯：張貴森)