唐莉麗 高 濱 鄭云恒
臨床研究發(fā)現(xiàn),冠心病患者在發(fā)病的中、晚期,其心臟會發(fā)生血液灌注,這種情況會使其心肌細(xì)胞發(fā)生氧化損傷,進(jìn)而可使其心肌細(xì)胞的功能明顯減弱,從而引起心力衰竭和心肌梗死,危及其生命安全[1]。因此,如何保護(hù)發(fā)生氧化損傷的心肌細(xì)胞、促進(jìn)其功能的恢復(fù)是治療冠心病的關(guān)鍵。近年來的臨床研究發(fā)現(xiàn),五味子木脂素對發(fā)生氧化損傷的心肌細(xì)胞具有很強(qiáng)的保護(hù)作用[2]。為了進(jìn)一步研究五味子木脂素對發(fā)生氧化損傷心肌細(xì)胞的保護(hù)作用,我們進(jìn)行了本次研究?,F(xiàn)將研究結(jié)果報告如下:
本次實驗使用的動物為10只SD乳鼠(雌雄不限)。這10只乳鼠均由長春高新區(qū)醫(yī)學(xué)動物實驗研究中心提供,其出生時間均在3天以內(nèi)。
1.2.1 實驗用的試劑、藥品和儀器 本次實驗使用的試劑、藥品和儀器包括超氧化物歧化酶試劑盒、丙二醛試劑盒、乳酸脫氫酶試劑盒(這三種試劑盒均由南京建成生物工程研究所生產(chǎn))、DMEM培養(yǎng)基(由北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司生產(chǎn))、五味子木脂素(由北華大學(xué)林學(xué)院提供)、電子分析天平(由北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司生產(chǎn))、超凈工作臺(由蘇州凈化設(shè)備有限公司生產(chǎn))、高速低溫離心機(jī)(由長沙易達(dá)儀器有限公司生產(chǎn))、680型全自動酶標(biāo)儀(由美國BIO-RAD公司生產(chǎn))、倒置顯微鏡及照相系統(tǒng)(由麥克奧迪有限公司生產(chǎn))。
1.2.2 心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)方法 該培養(yǎng)方法參照文獻(xiàn)[3]進(jìn)行。
1.2.3 對用不同濃度H2O2處理的發(fā)生氧化損傷的心肌細(xì)胞進(jìn)行研究
1.2.3.1 實驗分組 ①對照組:對該組模型進(jìn)行正常培養(yǎng)。②H2O2Ⅰ組:在進(jìn)行心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)的基礎(chǔ)上,使用H2O2對該組模型進(jìn)行預(yù)處理,使其心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)液的濃度達(dá)到200μmol/L。③H2O2Ⅱ組:使用②中的方法將該組模型心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)液的濃度調(diào)節(jié)至400μmol/L。④H2O2Ⅲ組:使用②中的方法將該組模型心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)液的濃度調(diào)節(jié)至600μmol/L 。
1.2.3.2 實驗方法 用MTT比色法測定心肌細(xì)胞的活力,具體的方法是:①吸取細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)的上清液,用PBS對其清洗2次。②在每個培養(yǎng)孔內(nèi)加入無血清的DMEM培養(yǎng)液 200μl和 MTT溶液 (5mg/ml)20μl,在 37℃的環(huán) 境中進(jìn)行孵育4h。③棄去孔內(nèi)的培養(yǎng)液,在每個培養(yǎng)孔加入150μl的DMSO,振蕩10min,使結(jié)晶物充分溶解。④在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各培養(yǎng)孔的吸光度OD490值(選擇的波長為490nm,),然后分別于H2O2發(fā)生作用后的lh、3h、6h、12h和18h再次測定其吸光度OD490值。⑤取五味子木脂素50g,向其中加入數(shù)滴細(xì)胞培養(yǎng)液,用高壓乳勻儀對其進(jìn)行處理,制成SCL乳劑。
1.2.4 進(jìn)行對心肌細(xì)胞氧化損傷保護(hù)作用量效關(guān)系的實驗
1.2.4.1 實驗分組 ①對照組:對該組模型進(jìn)行正常培養(yǎng)。②H2O2組:在進(jìn)行心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)的基礎(chǔ)上,使用H2O2對該組模型進(jìn)行預(yù)處理,使其心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)液的濃度達(dá)到400μmol/L。③SCLⅠ組:使用SCL對該組模型進(jìn)行預(yù)處理,使其心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)液的濃度達(dá)到2.5×10-5g/L,④SCLⅡ組:使用③中的方法將該組模型心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)液的濃度調(diào)節(jié)至5×10-5g/L。⑤SCLⅢ組:使用③中的方法將該組模型心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)液的濃度調(diào)節(jié)至1×10-4g/L。
1.2.4.2 實驗方法 按照1.2.3.2中的方法分別于H2O2發(fā)生作用后的lh、3h、6h、12h、18h測定各組模型的吸光度OD490值。
1.2.5 進(jìn)行發(fā)生氧化損傷的心肌細(xì)胞對酶學(xué)影響的實驗
1.2.5.1 實驗分組 ①對照組:對該組模型進(jìn)行正常培養(yǎng)。②H2O2組:在進(jìn)行心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)的基礎(chǔ)上,使用H2O2對該組模型進(jìn)行預(yù)處理,使其心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)液的濃度達(dá)到400μmol/L,并連續(xù)處理3h。③SCL組:使用SCL對該組模型進(jìn)行預(yù)處理,使其心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)液的濃度達(dá)到5×10-5g /L,并連續(xù)處理12h。
1.2.5.2 實驗方法 分別用上清乳酸脫氫酶(LDH)、超氧化物岐化酶(SOD)和丙二醛(MDA)測定各組模型細(xì)胞的活性
我們使用SPSS13.0軟件包對本次實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,計量資料用(x± s )表示,采用t檢驗,計數(shù)采用χ2檢驗,用P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義[3]。
①在H2O2作用1h后,對照組模型、H2O2Ⅰ組模型、H2O2Ⅱ組模型和H2O2Ⅲ組模型的吸光度分別為0.433±0.020、0.453±0.030、0.311±0.012 和 0.278±0.203,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。②在H2O2作用3h后,對照組模型、H2O2Ⅰ組模型、H2O2Ⅱ組模型和H2O2Ⅲ組 模 型 的 吸 光 度 分 別 為 0.442±0.047、0.391±0.121、0.241±0.043和 0.179±0.016, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。③在H2O2作用6至18h后,對照組模型、H2O2Ⅰ組模型、H2O2Ⅱ組模型和H2O2Ⅲ組模型的吸光度 分 別 為 0.477±0.032、0.078±0.013、0.063±0.084和0.041±0.007,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。
在H2O2作用12至18h后,對照組模型、H2O2組模型、SCLⅠ組模型、SCLⅡ組模型和SCLⅢ組模型的量效關(guān)系分別為 0.397±0.017、0.063±0.009 、0.071±0.001、0.072±0.004、0.073±0.002,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.01)。
①與對照組模型相比,H2O2組模型培養(yǎng)基中的LDH含量、MDA含量和SOD含量無顯著差異(P>0.05)。②與對照組模型相比,SCL組模型培養(yǎng)基中的LDH含量、MDA含量和SOD含量有顯著差異(P<0.01)。詳情見表1。
表3 進(jìn)行SCL預(yù)處理對發(fā)生氧化損傷心肌細(xì)胞酶學(xué)的影響
臨床研究發(fā)現(xiàn),心肌缺血是冠心病患者最主要的臨床表現(xiàn)。而心肌在發(fā)生缺血后,心臟就會出現(xiàn)再灌注的現(xiàn)象。病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),心肌在發(fā)生再灌注時會產(chǎn)生大量的氧自由基。這些氧自由基會對心肌細(xì)胞造成傷害,從而影響心肌細(xì)胞的功能[4]。五味子木脂素是從中藥五味子中提取出的一種藥物成分。該成分能夠激活人體內(nèi)的SOD(一種存在于細(xì)胞質(zhì)和線粒體內(nèi)的金屬蛋白酶,具有清除氧自由基的作用),從而有效地清除心肌細(xì)胞中的氧自由基,保護(hù)發(fā)生氧化損傷的心肌細(xì)胞,促進(jìn)其功能的恢復(fù)[5]。
本次研究的結(jié)果說明,SCL對發(fā)生氧化損傷的心肌細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用,而且其濃度與作用呈線性關(guān)系。SCL之所以具有此作用,可能與其能夠激活人體內(nèi)的SOD有關(guān)。
[1] Murphy E, Steenbergen C. Meehanisms underlying aeute Proteetion from eardiae isehemia-reperfusion injury [J]Physiol Rev,2008,88(2):581-609.
[2] 馬育軒,黃艷霞,周海純,等.五味子現(xiàn)代藥理及臨床研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥信息,2014(10):125-126.
[3] 王娜,關(guān)鵬,段相林等,新生大鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)方法的改進(jìn)[J].河北師范大學(xué)學(xué)報,2007,31(2):256-259.
[4] Hoffman JW Jr, Gilbert TB,Poston RS, etal. Myocardial reperfusion injury: etiology, mechanisms, and therapies[J].J Extra Corpor Technol, 2004,36(4):391-411.
[5] 高嘯巍,劉苑,等.毛莨總苷對大鼠離體心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[J].中藥材,2014(08):1430-1433.