作者單位：510120 廣州，中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院神經(jīng)科(范勝諾，廖旺，劉軍)，麻醉科(谷貝貝)；510080 廣州，廣東藥學(xué)院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)科(張蓓)；510080 廣州,中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院在讀碩士研究生(范勝諾)

BDNF通過(guò)AKT/mTOR/70S6K途徑影響Aβ25-35誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞自噬的研究

范勝諾張蓓谷貝貝廖旺劉軍

【摘 要】目的探討腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(BDNF)對(duì)抗β-淀粉樣蛋白25-35的神經(jīng)毒性作用是否與自噬有關(guān)，以及該自噬過(guò)程是否通過(guò)蛋白激酶B(AKT)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/核糖體蛋白S6激酶(70S6K)途徑調(diào)控。 方法將Aβ25-35加入不同濃度BDNF預(yù)處理后的HT22細(xì)胞共孵育24 h，采用CCK8法測(cè)細(xì)胞活力；將Aβ25-35及加或不加BDNF、Rapamycin、LY294002處理HT22細(xì)胞24 h，采用蛋白免疫印跡法檢測(cè)LC3、p-AKT、p-70S6K的表達(dá)；采用免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞核周自噬斑點(diǎn)變化情況。結(jié)果BDNF能改善細(xì)胞活力，以100 ng/ml時(shí)最為顯著(P<0.05)；Aβ25-35升高LC3-Ⅱ/Ⅰ比值，降低p-AKT、p-70S6K的表達(dá)，并增加細(xì)胞自噬斑點(diǎn)數(shù)量(P均<0.05)；BDNF能增強(qiáng)Aβ25-35誘導(dǎo)的自噬活動(dòng)，該增強(qiáng)作用可被LY294002抑制(P均<0.05)。結(jié)論BDNF能對(duì)抗Aβ25-35的神經(jīng)毒性，與通過(guò)AKT/mTOR/70S6K途徑增強(qiáng)Aβ25-35誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞自噬相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子；β-淀粉樣蛋白25-35；HT22細(xì)胞；自噬

DOI:10.3969/g.issn.0253-9802.2015.06.004

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(81372919)；廣東省自然科學(xué)基金(S2013010013964)

通訊作者，劉軍， E-mail：docliujun@126.com

收稿日期：(2014-12-31)

Effect of BDNF on Aβ25-35-induced autophagy via AKT/mTOR/70S6K pathway in HT22 cellsFanShengnuo,ZhangBei,GuBeibei,LiaoWang,LiuJun.SunYat-senMemorialHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China

CorrespondingAuthor,LiuJun,E-mail:docliujun@126.com

Abstract【】ObjectiveTo investigate the correlation between neuroprotective effect of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) against Amyloid β-proiein25-35 neurotoxicity, and validate whether the autophagy was regulated by protein kinase B (AKT)/ mammalian target of rapamycin (mTOR)/ ribosomal protein S6 kinase (70S6K) signaling pathway. MethodsAβ25-35 was supplemented and co-cultured with the HT22 cells pretreated with different concentrations of BDNF for 24 h. The viability of HT22 cells was evaluated by cell counting kit-8 (CCK8). The expression levels of microtubule-associated protein light chain 3 (LC3), p-AKT, p-70S6K in HT22 cells were detected by Western blot after treated with Aβ25-35 in the presence or absence of BDNF, rapamycin, LY294002 for 24 h. Immunofluorescence assay was performed to observe the changes in the LC3 puncta in the perinuclear region of HT22 cells. ResultsBDNF could improve HT22 cell viability, especially at the concentration of 100 ng/ml (P<0.05). Aβ25-35 elevated the LC3-Ⅱ/Ⅰ ratio, down-regulated the expression of p-AKT and p-70S6K and increased the number of LC3 puncta in HT22 cells (all P<0.05). BDNF enhanced the autophagy induced by Aβ25-35, which could be inhibited by LY294002 (both P<0.05). ConclusionsBDNF is able to alleviate the neurotoxicity of Aβ25-35 by promoting the Aβ25-35-induced HT22 autophagy via AKT/mTOR/70S6K signaling pathway.

【Key words】Brain derived neurotrophic factor; Amyloid β-protein25-35; HT22 cells; Autophagy

阿爾茨海默病(AD)是常見(jiàn)的的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，以廣泛的神經(jīng)元丟失、神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFTs)及腦內(nèi)大量β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積形成為典型病理改變。在腦內(nèi)異常形成并堆積的Aβ產(chǎn)生的神經(jīng)毒性是AD形成和發(fā)展的重要因素[1-2]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在AD患者大腦中，腫脹的發(fā)生營(yíng)養(yǎng)障礙的神經(jīng)突中含有大量的自噬泡，Aβ累積在自噬泡中，提示自噬系統(tǒng)與AD的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，AD患者的細(xì)胞自噬功能有不同程度的損傷[1]。腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(BDNF)在神經(jīng)元的存活中起重要作用，有研究表明部分BDNF是通過(guò)調(diào)控磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)及下游蛋白激酶B (PKB/AKT)、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、核糖體蛋白S6激酶(70S6K)，即AKT/mTOR/70S6K途徑參與完成自噬等活動(dòng)[3-4]。我們既往使用Aβ25-35處理HT22細(xì)胞以模擬AD時(shí)發(fā)現(xiàn)，Aβ25-35可誘導(dǎo)HT22發(fā)生自噬[5]。但是該自噬活動(dòng)的機(jī)制尚未明確，因此本課題旨在觀察BDNF對(duì)Aβ25-35處理的HT22細(xì)胞有無(wú)保護(hù)作用，并探討該保護(hù)作用是否與自噬活動(dòng)相關(guān)以及AKT/mTOR/70S6K途徑在其中的作用，以期為AD的治療提供新思路。

材料與方法

一、儀器與試劑

主要儀器包括Thermo恒溫培養(yǎng)箱、奧林巴斯BX51WI研究級(jí)正置熒光顯微鏡、Spectramax M5多功能酶標(biāo)儀、BIO-RAD電泳儀及電轉(zhuǎn)儀；CCK-8購(gòu)自日本同仁公司；胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基、FBS胎牛血清、Neurobasal培養(yǎng)基和N2添加劑均購(gòu)自Gibco公司；自噬激活劑Rapamycin、自噬抑制劑LY294002 購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司； 重組人型BDNF購(gòu)自BioVision公司；抗LC3抗體購(gòu)自MBL公司，其余一抗(p-AKT、p-70S6K、Tublin)及二抗均購(gòu)自CST公司，所有一抗均為兔抗小鼠抗體，二抗為羊抗兔抗體；Aβ25-35由上海生工生物工程股份有限公司合成；ECL發(fā)光液購(gòu)自Millipore公司，BCA法蛋白濃度測(cè)定試劑盒及其余試劑購(gòu)自武漢博士德公司。

二、細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理

HT22細(xì)胞株，是1種永生化的小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞，其培養(yǎng)及分化參照文獻(xiàn)[6]，由本實(shí)驗(yàn)組凍存。Aβ25-35老化處理及合適工作濃度(10 μM、40 μM)由本課題前期工作確定[5]。根據(jù)分組需要分別加入以下試劑，于Aβ25-35處理前2 h加入不同濃度的BDNF，于Aβ25-35處理前0.5 h加入Rapamycin(1 μM)、LY294002(20 μM)。

三、CCK8法測(cè)細(xì)胞活力

將HT22細(xì)胞以5×104/ml的密度種植于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，分4組、每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，重復(fù)做3次，并設(shè)立對(duì)照組。各組分化后加入不同濃度的BDNF(10 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml、500 ng/ml)處理2 h后加入Aβ25-35共培養(yǎng)24 h，對(duì)照組不加任何藥物。每孔加入10 L的CCK-8試劑于37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)溫育1.5 h，用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度并計(jì)算細(xì)胞活力。

四、蛋白免疫印跡法檢測(cè)LC3等蛋白的表達(dá)

根據(jù)CCK8法得出BDNF合適濃度為100 ng/ml，分別以Aβ25-35及加或不加BDNF、Rapamycin(1 μM)、LY294002(20 μM)處理HT22細(xì)胞24 h，裂解后用BCA法測(cè)定蛋白濃度，各組蛋白濃度統(tǒng)一為30 μg/ml，加上樣緩沖液、變性后用12 %分離膠電泳分離蛋白后濕轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，5 %脫脂奶粉室溫封閉1 h, 加入一抗(LC3、p-AKT、p-70S6K，Tublin均為1∶1 000)，4 ℃過(guò)夜，TBST洗膜15 min×3次，二抗(1∶3 000)室溫1 h ，TBST洗膜15 min×3次后用ECL法曝光。

五、免疫熒光法測(cè)定自噬小體

參考文獻(xiàn)[5-6]前期基礎(chǔ)研究方法，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的HT22細(xì)胞種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板的細(xì)胞爬片上，貼壁后以Aβ25-35及加或不加BDNF、Rapamycin(1 μM)、LY294002(20 μM)處理HT22細(xì)胞24 h，用4%多聚甲醛溶液固定15 min，透膜封閉后加入一抗Anti-LC3于4 ℃孵育過(guò)夜，加入二抗常溫孵育1 h，DAPI染核5 min后封片，并于正置熒光顯微鏡下拍照。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果

一、BDNF和Aβ25-35對(duì)細(xì)胞活力的影響

單獨(dú)使用BDNF處理濃度為10 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml時(shí)，細(xì)胞活力與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，當(dāng)BDNF處理濃度為500 ng/ml時(shí)細(xì)胞活力明顯降低(圖1A)；單獨(dú)予Aβ25-3540 μM時(shí)，細(xì)胞活力降低，與我們前期研究結(jié)果一致，而預(yù)先使用不同濃度BDNF與Aβ25-35共處理時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)，BDNF濃度為50 ng/ml、100 ng/ml時(shí)均能改善細(xì)胞活力，其中以100 ng/ml時(shí)最為顯著，提示了BDNF有對(duì)抗Aβ25-35細(xì)胞毒性作用，我們以100 ng/ml BDNF濃度為后續(xù)工作濃度(圖1B)。

圖1　BDNF處理及BDNF預(yù)處理后加入Aβ 25-35 24 h對(duì)細(xì)胞活力的影響

A：經(jīng)不同濃度BDNF處理后結(jié)果，可見(jiàn)單獨(dú)使用BDNF時(shí)，當(dāng)濃度為500 ng/ml時(shí)細(xì)胞活力出現(xiàn)降低[活力為(76.217±5.832)%]，與對(duì)照組比較，*為t=7.113，P<0.001；B：經(jīng)Aβ25-3540μM 與不同濃度BDNF處理時(shí)，BDNF濃度為50 ng/ml[活力為(85.600±4.615)%]、100 ng/ml[活力為(94.800±3.962)%]時(shí)細(xì)胞活力均得到改善，其中以100 ng/ml時(shí)最明顯；2組比較，*為t=4.437、P=0.017，**為t=7.839、P<0.001

二、Aβ25-35處理對(duì)LC3、p-AKT、p-70S6K表達(dá)強(qiáng)度的影響

LC3是自噬活動(dòng)的標(biāo)志蛋白，自噬發(fā)生時(shí)LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)C3-Ⅱ，因此LC3-Ⅱ/Ⅰ比值能大致反映自噬水平的高低(參考2012年的《Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy》)。我們單獨(dú)予Aβ25-35處理HT22細(xì)胞24 h，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值高于對(duì)照組，而40 μM處理組較10 μM 處理組比值高(圖2A)；PI3K通路標(biāo)志蛋白AKT、70S6K磷酸化水平的比較結(jié)果示，Aβ25-35處理抑制了p-AKT、p-70S6K的表達(dá)，較之10 μM 處理組，40 μM處理組的抑制效果更明顯(圖2B)，這提示可能是PI3K通路參與了Aβ25-35誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞自噬活動(dòng)。當(dāng)使用BDNF、自噬抑制劑LY294002與Aβ25-35共孵育，以及Rapamycin作為陽(yáng)性對(duì)照時(shí)，與單獨(dú)使用Aβ25-35比較，BDNF進(jìn)一步升高了LC3-Ⅱ/Ⅰ比值，該升高效益可被LY294002抑制(圖3A、B)；同樣的，BDNF可降低p-AKT、p-70S6K的表達(dá)，LY294002能抑制該作用(圖3C、D)，這提示BDNF可通過(guò)PI3K途徑增強(qiáng)Aβ25-35誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞自噬活動(dòng)。

圖2　Aβ 25-35處理24 h后LC3、p-AKT、p-70S6K表達(dá)強(qiáng)度

A：蛋白免疫印跡圖 。B：定量分析圖，可見(jiàn)Aβ25-35處理HT22細(xì)胞24 h，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值高于對(duì)照組(與對(duì)照組比較，*為P<0.05)，40 μM處理組較10 μM 處理組升高(2組比較，# 為P<0.05)；各組LC3-Ⅱ/Ⅰ比值如下，對(duì)照組為0.400±0.079，10 μM組為1.580±0.192，40 μM組為4.510±0.361；各組比較的t值及P值如下,對(duì)照組vs. 10 μM組t=7.804，P<0.001；對(duì)照組vs. 40 μM組t=34.778，P<0.001；10 μM組vs. 40 μM組t=19.312，P<0.001。Aβ25-35處理抑制了p-AKT、p-70S6K的表達(dá)(與對(duì)照組比較，*為P<0.05)，較之10 μM 處理組，40 μM處理組抑制效果更明顯(#為P<0.05)，各組p-AKT/Tublin表達(dá)如下，對(duì)照組為0.810±0.152，10 μM組為0.300±0.037，40 μM組為0.137±0.019；各組比較的t值及P值如下,對(duì)照組vs.10 μM組t=8.883，P<0.001；對(duì)照組vs. 40 μM組t=11.531，P<0.001；10 μM組vs. 40 μM組t=2.648，P=0.044。各組pS6K/Tublin表達(dá)如下，對(duì)照組為1.580±0.202；10 μM組為0.800±0.158；40 μM組為0.360±0.065；各組比較的P值及t值如下, 對(duì)照組vs.10 μM組t=8.074，P<0.001；對(duì)照組vs. 40 μM組t=12.628，P<0.001；10 μM組vs. 40 μM組t=4.554，P=0.002

圖3　BDNF對(duì)LC3、p-AKT、p-70S6K表達(dá)的影響

A：蛋白免疫印跡圖。B：定量分析，比起單獨(dú)使用Aβ25-35，BDNF進(jìn)一步升高了LC3-Ⅱ/Ⅰ比值(與對(duì)照組比較，*為P<0.05；2組間比較，#為P<0.05)，各組LC3-Ⅱ/Ⅰ比值如下，Aβ25-35組為2.500±0.292，Aβ25-35+BDNF組為6.520±0.581，Aβ25-35+BDNF+LY組為2.040±0.336，Aβ25-35+Rapa組為4.440±0.365；各組比較的t值與P值如下，Aβ25-35組vs. Aβ25-35+BDNF組為t=16.75、P<0.001，Aβ25-35+BDNF組vs. Aβ25-35+BDNF+LY組 為t=18.667、P<0.001，Aβ25-35組vs. Aβ25-35+Rapa組為t=8.083、P<0.001。C、D：定量分析，對(duì)比單獨(dú)使用Aβ25-35，BDNF能進(jìn)一步降低p-AKT、p-70S6K的表達(dá)，LY294002能抑制BDNF上述作用，各組p-AKT/Tublin表達(dá)如下，Aβ25-35組為1.010±0.297，Aβ25-35+BDNF組為 0.470±0.079，Aβ25-35+BDNF+LY組為1.360±0.297，Aβ25-35+Rapa組為0.634±0.117；各組比較的t值與P值如下，Aβ25-35組vs. Aβ25-35+BDNF組t=3.333、P=0.033；Aβ25-35+BDNF組vs. Aβ25-35+BDNF+LY組為t=5.494、P<0.001；Aβ25-35組vs. Aβ25-35+Rapa組 為t=2.321、P= 0.031。各組p-70S6K/Tublin表達(dá)如下，Aβ25-35組為0.600±0.127，Aβ25-35+BDNF組為 0.216±0.048，Aβ25-35+BDNF+LY組為0.601±0.091，Aβ25-35+Rapa組為0.402±0.042；各組比較的t值與P值如下，Aβ25-35組vs. Aβ25-35+BDNF組t=7.385、P<0.001 ，Aβ25-35+BDNF組vs. Aβ25-35+BDNF+LY組t=0.737、P<0.001，Aβ25-35組vs. Aβ25-35+Rapa組t=3.799、P= 0.011

三、不同處理組HT22細(xì)胞內(nèi)免疫熒光斑點(diǎn)及定量分析結(jié)果

使用LC3抗體對(duì)各處理組進(jìn)行染色，發(fā)現(xiàn)經(jīng)Aβ25-35處理后的HT22細(xì)胞核周出現(xiàn)明顯斑點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)，預(yù)先使用BDNF后，細(xì)胞中高亮的斑點(diǎn)更多，甚至成斑塊狀，LY294002能減少BDNF導(dǎo)致的大量斑點(diǎn)形成(圖4)。

圖4　不同處理組HT22細(xì)胞內(nèi)免疫熒光斑點(diǎn)及定量分析

Aβ組結(jié)果示經(jīng)Aβ25-35處理后的HT22細(xì)胞核周出現(xiàn)明顯斑點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)(箭頭所示為熒光斑點(diǎn))；Aβ+BDNF組結(jié)果示合用BDNF后的細(xì)胞斑點(diǎn)更多，甚至成斑塊狀；Aβ+BDNF+LY 組結(jié)果示LY294002能抑制BDNF的作用；Rapa組為陽(yáng)性對(duì)照組。對(duì)照組斑點(diǎn)定量為(4.100±1.581) Dots/Unit，Aβ25-35組為(44.020±7.778) Dots/Unit，Rapa組為(45.715±4.527)Dots/Unit，Aβ25-35+BDNF組為(65.200±10.986)Dots/Unit，Aβ25-35+BDNF+LY組為(30.060±7.021)Dots/Unit。各組比較的t值與P值如下，對(duì)照組vs.Aβ25-35組t=8.889、P<0.001，對(duì)照組vs.Rapat=9.111、P<0.001，對(duì)照組vs. Aβ25-35+BDNF組t=13.556、P<0.001，對(duì)照組vs.Aβ25-35+BDNF+LY組t=5.911、P<0.001，Aβ25-35組vs. Aβ25-35+BDNF組t=4.711、P=0.001，Aβ25-35+BDNF組vs.Aβ25-35+BDNF+LY組t=7.689、P<0.001。柱狀圖所示，與對(duì)照組比較，*為P<0.05；2組間比較，#為P<0.05

討論

AD病理機(jī)制的研究和藥物的開(kāi)發(fā)已成為醫(yī)學(xué)界關(guān)注的老年病熱點(diǎn)問(wèn)題，目前針對(duì)AD的基礎(chǔ)研究主要集中在抑制Aβ異常聚集，AD患者大腦中過(guò)度聚集的Aβ主要由清除障礙引起，因此，清除AD患者大腦中過(guò)度聚集的Aβ是治療的關(guān)鍵點(diǎn)[7]。

自噬作為細(xì)胞在不利環(huán)境下的1種存活機(jī)制，可通過(guò)將細(xì)胞內(nèi)的長(zhǎng)壽命蛋白、可溶性蛋白、受損細(xì)胞器等胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體進(jìn)行降解，重新利用以滿足細(xì)胞所需，從而降低毒性物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的傷害，這其中就包括Aβ這種難以降解的蛋白[8-9]。自噬過(guò)程中形成自噬泡，為包裹廢棄的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器的雙層膜結(jié)構(gòu)，它和溶酶體融合形成成熟的自噬溶酶體，更好地對(duì)胞內(nèi)成分如衰老受損的細(xì)胞器、無(wú)生物功能的大分子進(jìn)行降解，還能解除蛋白質(zhì)異常折疊，起細(xì)胞清道夫的作用。自噬功能障礙與各種神經(jīng)變性疾病，如AD、帕金森病、亨廷頓病等關(guān)系密切[10]。研究表明，AD患者大腦神經(jīng)元中含有大量的自噬泡，Aβ積聚在自噬泡中，且自噬功能有不同程度的障礙。我們既往在使用海馬神經(jīng)元細(xì)胞系HT22接受Aβ25-35干預(yù)以體外模擬AD時(shí)發(fā)現(xiàn)，高濃度Aβ25-35對(duì)HT22細(xì)胞有明顯的毒性作用，且與細(xì)胞自噬功能密切相關(guān)[5]。本研究再次證實(shí)了Aβ25-35能誘導(dǎo)HT22細(xì)胞發(fā)生自噬，且該自噬與處理濃度相關(guān)。

BDNF與原肌球蛋白受體激酶(TrkB)結(jié)合后可激活絲裂原激活蛋白激酶/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(MAPK/ERK)、磷脂酶Cg(PLCg)和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)通路，其中PI3K通路對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)育、分化、再生、存活、突觸可塑性、軸突逆向運(yùn)輸?shù)扔兄匾饔肹11]。研究表明，BDNF能有效對(duì)抗缺氧、自由基損傷、Aβ等導(dǎo)致的神經(jīng)毒性[3-4, 12]。本研究也觀察到BDNF能改善Aβ25-35導(dǎo)致的細(xì)胞活力降低。哺乳動(dòng)物mTOR是自噬的負(fù)調(diào)控因子，是1種絲氨酸/蘇氨酸激酶，在細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)中發(fā)揮重要作用。mTOR在神經(jīng)元軸突的伸展方向、樹(shù)突的發(fā)育和樹(shù)突棘的形狀過(guò)程中都至關(guān)重要[13-14]。PI3K通過(guò)AKT/mTOR/70S6K調(diào)控自噬活性是一重要的信號(hào)級(jí)聯(lián)，研究表明，激活的PI3K/AKT信號(hào)通路作用于mTOR抑制神經(jīng)元凋亡；磷酸化的AKT能激活下游的 TSC1/2，進(jìn)一步磷酸化mTOR、mTOR通過(guò)抑制下游分子ULK1復(fù)合體來(lái)調(diào)控自噬，因此AKT、p70S6K磷酸化水平與自噬水平成反比[15]。我們使用Aβ25-35誘導(dǎo)HT22細(xì)胞發(fā)生自噬時(shí)，p-AKT、p-70S6K表達(dá)降低，熒光圖顯示自噬斑點(diǎn)增多，而加用BDNF后p-AKT、p-70S6K表達(dá)進(jìn)一步降低，自噬斑點(diǎn)進(jìn)一步增多，且自噬抑制劑LY294002在一定程度上能抵消BDNF的作用，提示BDNF在此自噬活動(dòng)中對(duì)Aβ25-35有同向增強(qiáng)的效果。結(jié)合使用BDNF后能緩解Aβ25-35導(dǎo)致的細(xì)胞活力降低，我們認(rèn)為BDNF能對(duì)抗Aβ25-35的神經(jīng)毒性，與增強(qiáng)神經(jīng)元自噬及調(diào)控AKT/mTOR/70S6K通路相關(guān)。

在一些神經(jīng)疾病中，自噬活性的高水平對(duì)神經(jīng)元的存活極其不利，但在AD的研究中，較多研究者傾向于自噬對(duì)神經(jīng)元變性有明顯的改善作用[16-18]。本研究發(fā)現(xiàn)BDNF通過(guò)AKT/mTOR/70S6K途徑增強(qiáng)Aβ25-35誘導(dǎo)的神經(jīng)元自噬，這種自噬的發(fā)生伴隨著HT22細(xì)胞活力的改善。也有學(xué)者認(rèn)為通過(guò)激活mTOR，可在一定情況下阻止細(xì)胞發(fā)生自噬從而加速細(xì)胞死亡，而抑制 mTOR則能加強(qiáng)自噬以消化胞內(nèi)異常聚集的蛋白以使細(xì)胞存活[19]。自噬作為一把雙刃劍，活性過(guò)高或過(guò)低均不利于細(xì)胞功能的穩(wěn)定，AKT/mTOR/70S6K通路調(diào)控自噬可能存在一“平衡點(diǎn)”，但目前我們對(duì)這個(gè)“平衡點(diǎn)”仍處于未知階段。BDNF是如何增強(qiáng)神經(jīng)元自噬的調(diào)控機(jī)制需要我們作進(jìn)一步探討。

參考文獻(xiàn)

[1]Nixon RA. Autophagy, amyloidogenesis and Alzheimer disease. J Cell Sci,2007,120(Pt 23):4081-4091.

[2]Lewczuk P, Mroczko B, Fagan A, Kornhuber J. Biomarkers of Alzheimer’s disease and mild cognitive impairment: A current perspective. Adv Med Sci,2014,60(1):76-82.

[3]Kim JH. Brain-derived neurotrophic factor exerts neuroprotective actions against amyloid beta-induced apoptosis in neuroblastoma cells. Exp Ther Med,2014,8(6):1891-1895.

[4]Chen A, Xiong LJ, Tong Y, Mao M. Neuroprotective effect of brain-derived neurotrophic factor mediated by autophagy through the PI3K/Akt/mTOR pathway. Mol Med Rep,2013,8(4):1011-1016.

[5]張蓓，谷貝貝，范勝諾，趙嘉，趙仲艷，劉軍. β-淀粉樣蛋白Aβ25-35誘導(dǎo)HT22細(xì)胞自噬及其對(duì)V-ATPase表達(dá)的影響. 中山大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)科學(xué)版,2013,34(1):1-5.

[6]Zhao ZY, Luan P, Huang SX, Xiao SH, Zhao J, Zhang B, Gu BB, Pi RB, Liu J. Edaravone protects HT22 neurons from H2O2-induced apoptosis by inhibiting the MAPK signaling pathway. CNS Neurosci Ther,2013,19(3):163-169.

[7]李家林，王金環(huán). 阿爾茨海默病免疫治療的研究進(jìn)展. 新醫(yī)學(xué),2012,43(1):1-3.

[8]Jiang P, Mizushima N. Autophagy and human diseases. Cell Res,2014,24(1):69-79.

[9]Zhu XC, Yu JT, Jiang T, Tan L. Autophagy modulation for Alzheimer’s disease therapy. Mol Neurobiol,2013,48(3):702-714.

[10]Wong E, Cuervo AM. Autophagy gone awry in neurodegenerative diseases. Nat Neurosci,2010,13(7):805-811.

[11]Numakawa T, Suzuki S, Kumamaru E, Adachi N, Richards M, Kunugi H. BDNF function and intracellular signaling in neurons. Histol Histopathol,2010,25(2):237-258.

[12]Xia Y, Wang CZ, Liu J, Anastasio NC, Johnson K M. Brain-derived neurotrophic factor prevents phencyclidine-induced apoptosis in developing brain by parallel activation of both the ERK and PI-3K/Akt pathways. Neuropharmacology,2010,58(2):330-336.

[13]Child ND, Benarroch EE. mTOR: its role in the nervous system and involvement in neurologic disease. Neurology,2014,83(17):1562-1572.

[14]Lee DH, Luo X, Yungher BJ, Bray E, Lee J K, Park KK. Mammalian target of rapamycin’s distinct roles and effectiveness in promoting compensatory axonal sprouting in the injured CNS. J Neurosci,2014,34(46):15347-15355.

[15]Jung CH, Ro SH, Cao J, Otto NM, Kim DH. mTOR regulation of autophagy. FEBS Lett,2010,584(7):1287-1295.

[16]Yang Y, Coleman M, Zhang L, Zheng X, Yue Z. Autophagy in axonal and dendritic degeneration. Trends Neurosci,2013,36(7):418-428.

[17]Wang S, Zhou SL, Min FY, Ma JJ, Shi XJ, Bereczki E, Wu J. mTOR-mediated hyperphosphorylation of tau in the hippocampus is involved in cognitive deficits in streptozotocin-induced diabetic mice. Metab Brain Dis,2014,29(3):729-736.

[18]Caccamo A, Majumder S, Richardson A, Strong R, Oddo S. Molecular interplay between mammalian target of rapamycin (mTOR), amyloid-beta, and Tau: effects on cognitive impairments. J Biol Chem,2010,285(17):13107-13120.

[19]Heras-Sandoval D, Perez-Rojas JM, Hernandez-Damian J, Pedraza-Chaverri J. The role of PI3K/AKT/mTOR pathway in the modulation of autophagy and the clearance of protein aggregates in neurodegeneration. Cell Signal,2014,26(12):2694-2701.

(本文編輯：洪悅民)

基礎(chǔ)研究論著