作者單位：261053 濰坊，濰坊醫(yī)學院病理生理學教研室

β-synuclein對SH-SY5Y細胞酪氨酸羥化酶表達的影響

倪明楊璐樊秀雙滿建梅郭軍堂

【摘要】目的探討β-synuclein對酪氨酸羥化酶(TH)表達的影響。方法采用流式細胞技術(shù)檢測穩(wěn)定表達β-synuclein神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞(實驗組)與神經(jīng)母細胞瘤 SH-SY5Y 細胞(對照組)內(nèi)活性氧類物質(zhì)(ROS)的含量。采用原位免疫熒光法、免疫組織化學染色法及蛋白免疫印跡法檢測實驗組與對照組細胞內(nèi)TH的表達情況。結(jié)果流式細胞儀顯示實驗組的ROS峰值較對照組左移。原位免疫熒光法、免疫組織化學染色法及蛋白免疫印跡法檢測結(jié)果顯示TH在實驗組中的表達水平較對照組低(P均<0.05)。結(jié)論β-synuclein可能抑制TH的表達。

【關(guān)鍵詞】β-synuclein；帕金森病；酪氨酸羥化酶；活性氧類物質(zhì)

DOI:10.3969/g.issn.0253-9802.2015.06.006

基金項目：山東省自然科學基金( ZR2011HM014)

通訊作者，郭軍堂，E-mail:guojuntang@163.com

收稿日期：(2014-12-29)

Effect of β-synuclein on the expression of tyrosine hydroxylase in SH-SY5Y cellsNiMing,YangLu,FanXiushuang，ManJianmei，GuoJuntang.DepartmentofPathophysiology，WeifangMedicalUniversity，Weifang261053，China

Correspondingauthor,GuoJuntang,E-mail:guojuntang@163.com

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effect of β-synuclein upon the expression of tyrosine hydroxylase (TH). MethodsThe intracellular reactive oxygen species (ROS) was measured by flow cytometry in the human neuroblastoma cell line SH-SY5Y stably expressing β-synuclein (experimental group) and normal SH-SY5Y cells (control group). The levels of TH in SH-SY5Y cells of experimental group and control group were detected by in situ immunofluorescence, immunohistochemical staining and western blot. Results The ROS peak in the experimental group was shifted to the left compared with that in the control group revealed by flow cytometry. The expression level of TH in the experimental group was significantly lower than that in the control group (P<0.05) detected by in situ immunofluorescence, immunohistochemistry and western blot. Conclusionβ-synuclein might be able to suppress the expression of TH.

【Key words】β-synuclein; Parkinson’s disease; Tyrosine hydroxylase; Reactive oxygen species

帕金森病是目前威脅老年人健康的重大疾病之一。其病理特征主要是多巴胺能神經(jīng)元逐漸喪失和路易小體的形成。α-synuclein 是路易小體的主要組成成分，有研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠單一的紋狀體內(nèi)注射合成的錯誤折疊的α-synuclein可引起小鼠神經(jīng)細胞內(nèi)一系列的退行性病理改變，如黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元選擇性損失、運動協(xié)調(diào)障礙，因此α-synuclein的異常狀態(tài)足以導致帕金森病的基本病理及行為改變[1]。同時α-synuclein還可通過調(diào)節(jié)酪氨酸羥化酶(TH)的活性等途徑來影響多巴胺的合成及代謝，進而促進帕金森病的發(fā)生和發(fā)展[2]。β-synuclein與α-synuclein是同族異構(gòu)體，但是β-synuclein能通過分子間的相互作用阻止α-synuclein蛋白的異常聚集，進而對神經(jīng)元起保護作用，但其具體機制尚未明確[3]。本研究主要探討β-synuclein對TH表達的影響，探討其在帕金森病發(fā)病過程中的作用。

材料與方法

一、材料

神經(jīng)母細胞瘤 SH-SY5Y 細胞株購自中國醫(yī)學科學院基礎所;穩(wěn)定表達β-synuclein神經(jīng)母細胞瘤細胞株SH-SY5Y 由本課題組構(gòu)建; ECL化學發(fā)光劑購自碧云天生物技術(shù)研究所; β-synuclein兔抗人多克隆抗體及鼠抗人β-actin 單克隆抗體購自Santa Cruz公司; 異硫氰酸熒光素(FITC) 標記山羊抗兔IgG、辣根酶標記山羊抗兔IgG、辣根酶標記山羊抗小鼠IgG及 DAB 顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；2’-7’-二氯熒光素雙醋酸鹽(DCFH-DA)購自Sigma公司。

二、方法

采用流式細胞技術(shù)檢測細胞內(nèi)活性氧類物質(zhì)水平。采用原位免疫熒光法、免疫組織化學(免疫組化)染色法及蛋白免疫印跡法檢測TH的表達情況。

1.細胞培養(yǎng)

將細胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5%二氧化碳孵育箱中傳代培養(yǎng)。

2.流式細胞技術(shù)

用胰酶消化細胞后，加入DMEM培養(yǎng)基將其吹打成細胞懸液，用細胞計數(shù)板計數(shù)，取1×106個細胞，1 000 rpm/min離心5 min，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞沉淀并重懸離心2次。洗滌后的細胞沉淀加入1 ml的PBS重懸，將細胞懸液用細胞篩過濾成單層細胞懸液，再加入熒光探針DCFH-DA染色液，使終濃度為10 μmol/L，室溫避光孵育10 min，每隔2 min顛倒混勻1次，使熒光探針DCFH-DA與細胞充分接觸進入細胞內(nèi)。每個樣本孵育到第10 min時，用流式細胞儀以激發(fā)波長為488 nm、發(fā)射波長為525 nm來檢測細胞內(nèi)活性氧類物質(zhì)(ROS)變化水平。以穩(wěn)定表達β-synuclein神經(jīng)母細胞瘤 SH-SY5Y 細胞為實驗組，神經(jīng)母細胞瘤 SH-SY5Y 細胞為對照組。

3.原位免疫熒光法

取出培養(yǎng)72 h 的細胞蓋玻片，用PBS漂洗，以甲醇與丙酮比例為3∶1的固定液固定細胞15 min, 0.5%的聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)通透細胞20 min。用5%山羊血清室溫封閉30 min，加入PBS稀釋的TH抗體(1∶100) 于4℃ 過夜;避光加入PBS稀釋的FITC標記的山羊抗兔IgG二抗(1∶200)于37℃孵育2 h。用50%甘油封片。以穩(wěn)定表達β-synuclein細胞為實驗組，神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞為對照組，于熒光倒置顯微鏡下觀察，有綠色熒光為TH蛋白表達陽性。

4.免疫組化染色法

將細胞接種于載玻片上培養(yǎng)48 h，用4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗5 min × 3 次，抗原修復及封閉后，加入PBS稀釋的TH抗體(1∶100)于4℃ 過夜;PBS洗滌，加入辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG二抗(1∶200)于37℃孵育2 h，用PBS洗滌，進行DAB顯色。以穩(wěn)定表達β-synuclein細胞為實驗組，神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞為對照組。蘇木素復染、脫水、透明、封片，鏡下觀察，以上實驗重復3次。

5.蛋白免疫印跡法

當細胞密度達到約85%時,用細胞裂解液裂解細胞,用BCA試劑盒進行核蛋白定量，取蛋白樣品約30 μg經(jīng)12% SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白條帶轉(zhuǎn)移到0.45 μm 硝酸纖維素膜上，置于5%的脫脂奶粉封閉液中，加一抗TH(1∶500)于4℃ 過夜;TBST洗膜3次各10 min，加入辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG二抗(1∶5 000)于室溫孵育2 h，TBST洗膜3次各10 min，將膜置于ECL化學發(fā)光劑中，用X線膠片曝光、顯影及定影。β-actin 作為內(nèi)參。重復實驗3次。

三、統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料的比較行t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

一、流式細胞技術(shù)檢測結(jié)果

在SH-SY5Y多巴胺能神經(jīng)元細胞中，多巴胺代謝是ROS產(chǎn)生的主要原因。通過流式細胞技術(shù)檢測ROS峰值變化可精確反應SH-SY5Y細胞內(nèi)的ROS含量的變化。當峰值左移時提示其抑制ROS的表達，當峰值右移時提示其促進ROS的表達。實驗組的ROS峰值較對照組明顯左移，提示β-synuclein抑制細胞內(nèi)ROS的表達(圖1A、B)。

二、原位免疫熒光法檢測結(jié)果

實驗組與對照組細胞內(nèi)均可見綠色熒光，提示穩(wěn)定表達β-synuclein 的神經(jīng)細胞與SH-SY5Y細胞內(nèi)TH表達均陽性，經(jīng)IPP圖像分析系統(tǒng)分析(重復3次實驗后取均值)，對照組的灰度值為4.452±0.03、實驗組為1.223±0.02，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(t=44.7，P<0.05)，提示β-synuclein抑制TH的表達(圖1C、D)。

三、免疫組化染色法檢測結(jié)果

于顯微鏡下觀察實驗組與對照組細胞背景清晰, 細胞核和細胞質(zhì)區(qū)別明顯,2種細胞的胞質(zhì)中均見被染色的棕黃色顆粒，但實驗組與對照組相比顏色較淺(圖1E、F)。

圖1　流式細胞技術(shù)、原位免疫熒光法及免疫組化染色法檢測結(jié)果

A：流式細胞技術(shù)檢測圖，可見對照組的ROS峰值在102處；B：流式細胞技術(shù)檢測圖，可見實驗組的ROS峰值在102左側(cè)，出現(xiàn)了左移；C:原位免疫熒光檢測圖，實驗組細胞內(nèi)可見綠色熒光，強度較弱；D:原位免疫熒光檢測圖，對照組細胞內(nèi)可見較亮綠色熒光，強度較強；E:免疫組化染色法檢測圖，可見對照組胞質(zhì)中有多量棕黃色顆粒，且顏色較深；F: 免疫組化染色法檢測圖，可見實驗組胞質(zhì)中有少量被染色的棕黃色顆粒

四、蛋白免疫印跡法檢測結(jié)果

實驗組與對照組內(nèi)參β-actin蛋白條帶亮度大致相同，提示實驗組與對照組均存在TH蛋白的表達，但實驗組泳道出現(xiàn)的蛋白條帶與對照組相比顏色較淺。經(jīng)IPP圖像分析系統(tǒng)分析(重復3次實驗后取均值)，實驗組、對照組與β-actin的灰度值之比分別為1.692±0.02、0.553±0.03，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(t=126.6，P<0.05)，提示β-synuclein抑制TH的表達(圖2)。

圖2　蛋白免疫印跡法檢測結(jié)果

A：可見實驗組TH條帶和內(nèi)參β-actin相比顏色較淺；B：可見對照組TH條帶和內(nèi)參β-actin相比亮度幾乎無異

討論

帕金森病是常見的神經(jīng)退行性疾病，臨床表現(xiàn)為靜止性震顫、肌強直、運動遲緩和姿勢不穩(wěn)等。帕金森病的特點是中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元逐漸喪失和細胞內(nèi)存在包涵體，即路易小體。α-synuclein是一種前突觸蛋白，大腦含量豐富。α-synuclein可能通過不同作用機制引起氧化應激損傷, 同時氧化應激條件也能影響α-synuclein的代謝, α-synuclein在帕金森病的發(fā)病過程中起重要作用[4]。有研究表明，α-synuclein的表達在某種程度上會影響多巴胺的合成，而α-synuclein與多巴胺合成途徑中蛋白產(chǎn)生異常相互作用可能會干擾細胞[5]。另有動物實驗表明，帕金森病基因α-synuclein的過表達對秀麗線蟲具有明顯的毒性作用, α-synuclein轉(zhuǎn)基因線蟲的壽命明顯縮短、運動能力顯著下降，于熱休克條件下其存活能力減弱[6]。顯然α-synuclein在帕金森病以及其他神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病過程中扮演了重要的角色。

TH是多巴胺生物合成途徑的關(guān)鍵酶，酪氨酸在TH催化下生成左旋多巴，再經(jīng)芳香族氨基酸脫羧酶作用生成多巴胺。在多巴胺合成循環(huán)過程中發(fā)揮了關(guān)鍵調(diào)控作用。該酶在生物體內(nèi),尤其是在人腦黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)中，其質(zhì)和量的變化會直接影響多巴胺的生物合成。有研究表明，TH表達的衰減和α-synuclein表達的升高是與帕金森病發(fā)病密切相關(guān)的生化事件[7]。另有研究提出α-synuclein作為一種反式作用因子，可能具有影響TH基因啟動子的功能，對多巴胺代謝有負性調(diào)控作用[8]。β-synuclein作為synucleins的家族成員之一，同樣主要分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸前末梢，與α-synuclein存在很高的序列同源性。有學者發(fā)現(xiàn)，共同培養(yǎng)α-synuclein和β-synuclein，由這2種蛋白直接結(jié)合成的另一種蛋白，能降低α-synuclein原纖維的聚集，并改善α-synuclein引起的的神經(jīng)組織退化，因此其推斷β-synuclein可能對神經(jīng)元細胞具有保護作用[9]。

本研究結(jié)果顯示，流式細胞技術(shù)檢測到實驗組的ROS峰值較對照組左移，提示β-synuclein能抑制細胞內(nèi)ROS的表達，說明β-synuclein具有神經(jīng)保護作用。原位免疫熒光、免疫組化染色法及蛋白免疫印跡法檢測結(jié)果均顯示：TH在實驗組中的表達水平較對照組低，提示β-synuclein可能與TH存在直接相互作用并抑制該蛋白的表達。鑒于以上結(jié)果，我們提出假設，β-synuclein可能通過調(diào)節(jié)TH的表達，參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)多巴胺的代謝過程，抑制多巴胺的合成，進而減少ROS對神經(jīng)細胞的損害，起神經(jīng)保護作用。

參考文獻

[1]Luk KC, Kehm V, Carroll J, Zhang B, O’Brien P, Trojanowski JQ, Lee VM. Pathological α-synuclein? Transmission initiates?Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science，2012，338(6109):949-953.

[2]Yu S, Zuo X, Li Y, Zhang C, Zhou M, Zhang YA, Uéda K, Chan P. Inhibition of tyrosine hydroxylase expression in alpha-synuclein-transfected dopaminergic neuronalcells. Neurosci Lett, 2004, 367(1): 34-39.

[3]Lee D, Paik SR, Choi KY. Beta-synuclein exhibits chaperone activity more efficiently than alpha-synuclein.FEBS Letters,2004,576(1-2):256-260.

[4]沈原,趙永波,劉功祿,趙圣杰. α-突觸核蛋白的表達與氧化應激水平的相互影響.中國神經(jīng)免疫學和神經(jīng)病學雜志, 2011,18(3):177.

[5]Ozansoy M, Basak AN. The central theme of Parkinson’s disease: α-synuclein. Mol Neurobiol, 2013,47(2):460-465.

[6]孫亞奇,盧錫林,蘇鳳娟,龍思梅,梁鳳銀,郭文苑,孫喜翠,黃頤,裴中,鐘翎. 帕金森病基因α-Synuclein過表達對秀麗隱桿線蟲毒性作用的研究.新醫(yī)學，2013, 44(4): 273-277.

[7]Marwarha G, Rhen T, Schommer T, Ghribi O. The oxysterol 27-hydroxycholesterol regulates α-synuclein and tyrosine hydroxylase expression levels in human neuroblastoma cells through modulation of liver X receptors and estrogen receptors-Relevance to Parkinson’s disease. J Neurochem, 2011, 119(5): 1119-1136.

[8]Gao N, Li YH, Li X, Yu S, Fu GL, Chen B. Effect of α-synuclein on the promoter activity of tyrosine hydroxylase gene. Neuroscience Bulletin, 2007, 23(1): 53-57.

[9]Vigneswara V, Cass S, Wayne D, Bolt EL, Ray DE, Carter WG. Molecular Ageing of Alpha- and Beta-Synucleins: Protein Damage and Repair Mechanisms. PloS One，2013,8(4):e61442.

(本文編輯：洪悅民)

臨床研究論著