李世召 郭 偉 杜 超 景宇飛 劉艷利申 靜 姚軍虎 楊小軍（西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，楊凌712100）

用高效液相色譜法檢測(cè)雞胚組織基因組DNA甲基化水平變化規(guī)律

李世召 郭 偉 杜 超 景宇飛 劉艷利申 靜 姚軍虎 楊小軍?
（西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，楊凌712100）

摘 要：本試驗(yàn)旨在優(yōu)化用于基因組DNA甲基化水平檢測(cè)的高效液相色譜法，并初步探索雞胚發(fā)育過(guò)程中不同組織基因組DNA甲基化水平的變化規(guī)律。首先，試驗(yàn)從DNA酶解體系和高效液相色譜儀檢測(cè)條件2個(gè)方面改進(jìn)基因組DNA甲基化水平檢測(cè)方法；然后，以孵化第8、11、14和17天的科寶500肉雞胚胎為材料，利用改進(jìn)的高效液相色譜法測(cè)定心臟、肝臟和肌肉的基因組DNA甲基化水平。結(jié)果表明：3種組織的基因組DNA甲基化水平均隨胚齡增加而升高，且雞胚發(fā)育后期（孵化第17天）肝臟的甲基化水平顯著高于心臟和肌肉（P＜0．05）；各胚齡心臟和肌肉的基因組DNA甲基化水平均差異不顯著（P＞0．05）。結(jié)果提示，優(yōu)化后的高效液相色譜法為快速、準(zhǔn)確地獲取組織基因組DNA甲基化水平奠定了基礎(chǔ)；隨著雞胚發(fā)育的進(jìn)行，基因組DNA甲基化水平逐漸升高，且在胚胎發(fā)育后期肝臟甲基化水平較高。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜；肉雞；胚胎；DNA甲基化

表觀遺傳學(xué)是研究在不涉及DNA序列改變的情況下，引起基因表達(dá)調(diào)控的可遺傳變化的一門學(xué)科［1］。表觀遺傳學(xué)修飾在基因的表達(dá)調(diào)控中具有重要作用。DNA甲基化是最常見(jiàn)的一種表觀遺傳學(xué)修飾，可引起DNA構(gòu)象、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，進(jìn)而影響基因表達(dá)。胚胎期是表觀基因組重編程的關(guān)鍵時(shí)期，易受外界環(huán)境影響。研究表明，孕婦攝取葉酸可預(yù)防胎兒發(fā)生心血管疾病，而葉酸是一種可通過(guò)改變DNA甲基化來(lái)影響基因表達(dá)的甲基供體［2］。孕鼠飼糧中添加的富含甲基的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可通過(guò)改變相關(guān)基因特異位點(diǎn)“CpG島”的甲基化，加重后代的過(guò)敏性哮喘［3］。刺鼠胚胎期飼糧中的甲基供體可使胎兒相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化而影響其表達(dá)，最終改變后代的毛皮顏色［4］。將懷孕大鼠在高劑量農(nóng)藥中暴露一段時(shí)間后，后代成年后會(huì)出現(xiàn)器官損傷，而雄性子代精子出現(xiàn)的異常的DNA甲基化模式至少可持續(xù)4代［5］。因此，了解雞胚發(fā)育過(guò)程中DNA甲基化的變化規(guī)律，對(duì)于從胚胎期入手研究家禽表觀遺傳學(xué)具有重要意義。

目前，用于甲基化檢測(cè)的方法有亞硫酸鹽修飾后測(cè)序［如甲基化特異性PCR（methylation spe?cific PCR，MSP）］、甲基敏感擴(kuò)增片段多態(tài)性（methylation sensitive amplified polymorphism，MSAP）、甲基化DNA免疫沉淀（methylated DNA immunoprecipitation，MeDIP）和焦磷酸測(cè)序等。MSP法利用亞硫酸氫鹽可將未甲基化的C轉(zhuǎn)化為U，經(jīng)PCR擴(kuò)增后又轉(zhuǎn)變成T，而甲基化的C則不變，測(cè)序后比較修飾前后PCR產(chǎn)物的序列差異可獲得其中的甲基化信息［6］。此方法屬于位點(diǎn)特異性DNA甲基化檢測(cè)，只適于檢測(cè)已知基因中包含若干CpG位點(diǎn)的某一片段的甲基化狀態(tài)。MSAP法使用的一對(duì)同裂酶（HPaⅡ和MspⅠ）可識(shí)別基因組中相同的CCGG位點(diǎn)，產(chǎn)生甲基化敏感多態(tài)性片段，隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可明確甲基化狀態(tài)［7］。該方法最大的缺點(diǎn)是，無(wú)法識(shí)別非CCGG序列中的CG位點(diǎn)。MeDIP法應(yīng)用5－甲基胞嘧啶抗體特異性識(shí)別并分離甲基化的DNA片段，進(jìn)行高通量測(cè)序。這種方法費(fèi)用昂貴，不適合多樣品的基因組DNA甲基化測(cè)序。焦磷酸測(cè)序法可測(cè)定基因組中大量存在且DNA甲基化高發(fā)的重復(fù)原件Alu和LINE?1（long interspread nucleotide ele?ment?1）的甲基化率，并以此代表基因組DNA甲基化的總體水平［8］，但該法得到的并非嚴(yán)格意義上的基因組DNA甲基化水平。高效液相色譜（HPLC）法能夠快速、準(zhǔn)確測(cè)定基因組DNA甲基化水平，并可用于高通量混合樣本檢測(cè)，準(zhǔn)確顯示目的片段所有CpG位點(diǎn)的甲基化情況［9］。

本試驗(yàn)改進(jìn)了基因組DNA提取方法、DNA酶解體系和HPLC檢測(cè)條件，通過(guò)檢測(cè)科寶（Cobb）500肉雞胚胎發(fā)育第8、11、14和17天心臟、肝臟和肌肉的基因組DNA甲基化水平，以初步了解雞胚發(fā)育過(guò)程中DNA甲基化水平的變化規(guī)律。

1　材料與方法

1．1 儀器和試劑

藍(lán)電孵化機(jī)（9TV－3A，北京藍(lán)天蛟電子技術(shù)有限公司），日立D－2000 HPLC儀［天美（中國(guó)）科學(xué)儀器有限公司］，Ultimate Polar?RP色譜柱（4．6 mm×250 mm，5 μm）［月旭材料科技（上海）有限公司］；脫氧胞苷（deoxycytidine，dC）（Sigma）和5－甲基脫氧胞苷（deoxy?5?methylcytidine，5?mdC）標(biāo)準(zhǔn)品（TCI）；RNase A，RNase T1，DNaseⅠ，F(xiàn)astAP Thermosensitive Alkaline Phos?phatase，ExonucleaseⅠ（Fermentas）。

1．2 孵化管理與樣品采集

選擇外形、重量均勻的Cobb 500肉雞種蛋100枚孵化，孵化條件如下。

溫度：前期（1～10 d）38．0～38．2℃，后期（11～18 d）37．8～38．0℃，落盤（19～21 d）37．5～37．8℃；相對(duì)濕度：45%～65%；翻蛋周期：120 min；翻蛋時(shí)間：180 s。

于孵化期第8、11、14和17天（分別記為E8、E11、E14和E17）分別選取發(fā)育良好的種蛋6枚，取雞胚心臟、肝臟和肌肉放入凍存管，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．3 樣品處理

DNA提?。罕椒樱确拢愇齑迹?5∶24∶1，體積比）法提取組織DNA。第2次抽提前，加RNase A至終濃度80 μg／mL，RNase T1至終濃度1 500 U／mL，混勻后37℃水浴1 h。提取的DNA溶于40 μL TE緩沖液中，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

DNA酶解：參照前人研究［9－13］，將DNA酶解體系設(shè)為150 μL，其中組織DNA約20 μg，醋酸銨（pH＝7．5）15 μL，DNaseⅠ10 μL，10×DNaseⅠBuffer（MgCl2）15 μL，F(xiàn)astAP Thermosensitive Al?kaline Phosphatase 10 μL，10×Alkaline Phosphatase Buffer 15 μL，ExonucleaseⅠ5 μL，10×Exonucle?aseⅠBuffer 15 μL，超純水補(bǔ)足至150 μL。37℃孵育4～5 h，過(guò)0．22 μm濾膜，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

HPLC分析：色譜柱為Ultimate Polar?RP （4．6 mm×250．0 mm，5 μm）；流動(dòng)相為0．2%（體積分?jǐn)?shù)）磷酸；流速為1．3 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)為273 nm；進(jìn)樣量為20 μL。

1．4 DNA甲基化水平計(jì)算

分別配制7種濃度（0．5、1．0、2．0、5．0、10．0、20．0和50．0 mg／L）的dC和5?mdC標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品色譜圖中2種脫氧核苷峰面積對(duì)應(yīng)的濃度（分別記為CdC和C5?mdC），則樣品基因組DNA的甲基化水平（methylation level，ML）為：

ML（%）＝100×C5?mdC／（C5?mdC＋CdC）。

1．5 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 18．0統(tǒng)計(jì)軟件單因素方差分析（one?way ANOVA）過(guò)程對(duì)同一胚齡不同組織和不同胚齡同一組織的基因組DNA甲基化水平進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan氏法對(duì)差異顯著處理進(jìn)行多重比較，顯著水平為P＜0．05。

2　結(jié)果與分析

2．1 DNA酶解效果檢測(cè)

HPLC法檢測(cè)基因組DNA甲基化水平的前提是DNA必須完全酶解為單個(gè)脫氧核苷。為檢驗(yàn)樣品DNA是否完全酶解為單個(gè)脫氧核苷，并比較組織DNA與酶解DNA，本試驗(yàn)對(duì)酶解前后的組織DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果（圖1）顯示，基因組DNA已酶解為單個(gè)脫氧核苷。

圖1　DNA酶解效果Fig．1 Result of DNA digested by enzymes

2．2 DNA甲基化水平的計(jì)算

通過(guò)2種方法確定dC和5?mdC的色譜峰位置（圖2和圖3）：比較樣品洗脫峰和標(biāo)準(zhǔn)品洗脫峰的保留時(shí)間；在樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)品，觀察色譜峰的變化。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線［相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）＝0．68%（n＝7）］（圖4）計(jì)算樣品中2種脫氧核苷的濃度，并通過(guò)公式得到樣品基因組DNA甲基化水平。

2．3 最低檢測(cè)限、最小定量限和回收率的測(cè)定

以信噪比為3和10確定的dC的最低檢測(cè)限（LOD）和最小定量限（LOQ）分別為0．015和0．045 mg／L，5?mdC的分別為0．097和0．323 mg／L。

分別配制5種不同濃度（1、2、5、10和20 mg／L）的dC和5?mdC標(biāo)準(zhǔn)品溶液，取已知dC 和5?mdC濃度的樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率測(cè)定，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品濃度重復(fù)3次，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　脫氧胞苷和5－甲基脫氧胞苷的平均回收率Table 1 The average recovery of dC and 5?mdC（n＝3）　%

圖2　2種脫氧核苷標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖Fig．2 Chromatograms of 2 kinds of deoxynucleoside standard samples

2．4 雞胚不同組織基因組DNA甲基化水平檢測(cè)結(jié)果

2．4．1 雞胚不同組織基因組DNA甲基化水平隨胚齡的變化趨勢(shì)

由表2可知，雞胚心臟、肝臟和肌肉的基因組DNA甲基化水平均隨胚齡增加而升高。E14和E17心臟的基因組DNA甲基化水平顯著高于E8 和E11（P＜0．05）；各胚齡肝臟的基因組DNA甲基化水平均差異顯著（P＜0．05）；E8和E17肌肉的基因組DNA甲基化水平差異顯著（P＜0．05），E11和E14肌肉的基因組DNA甲基化水平分別與其他3個(gè)胚齡差異不顯著（P＞0．05）。

圖3　DNA樣品的色譜圖Fig．3 Chromatogram of DNA sample

圖4　2種脫氧核苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig．4 Standard curves of 2 kinds of deoxynucleoside

2．4．2 雞胚不同胚齡各組織基因組DNA甲基化水平比較

由表2可知，E8、E11和E14肝臟基因組DNA甲基化水平與其他2種組織均差異不顯著（P＞0．05），但E17肝臟基因組DNA甲基化水平顯著高于心臟和肌肉（P＜0．05）。各胚齡心臟和肌肉基因組DNA甲基化水平均差異不顯著（P＞0．05）。

3　討 論

3．1 HPLC法測(cè)定基因組DNA甲基化條件的優(yōu)化及注意事項(xiàng)

3．1．1 HPLC法測(cè)定基因組DNA甲基化條件的優(yōu)化

DNA分階段酶解［10，13］需要至少3次酶解和水浴，操作繁瑣且孵育時(shí)間長(zhǎng)。本試驗(yàn)采用了尹慧等［11］的酶解體系，一次性加入DNA酶解所需的核酸外切酶、內(nèi)切酶和堿性磷酸酶，只經(jīng)過(guò)1次水浴，并在保證酶解效果的前提下將酶解時(shí)間縮短至4～5 h。將酶解體系增加至150 μL，使經(jīng)0．22 μm濾膜的濾液更多，保證足夠的濾液用于HPLC上樣前的潤(rùn)洗和進(jìn)樣。

表2　不同胚齡雞胚各組織基因組DNA甲基化水平Table 2 Genome DNA methylation level of different tissues at different chick embryo ages　%

根據(jù)脫氧核苷的性質(zhì)，本試驗(yàn)選擇0．2%（體積分?jǐn)?shù)）磷酸作為流動(dòng)相［11］。Ultimate Polar?RP色譜柱的最佳流速為0．8 mL／min，在保證色譜柱使用壽命和色譜峰分離效果的同時(shí)，為盡量縮短采樣時(shí)間，本試驗(yàn)將流速設(shè)為1．3 mL／min。用于DNA酶解的關(guān)鍵酶全部購(gòu)自同一家公司，改善了dC和5?mdC色譜峰的分離效果（圖2和圖3）。

DNA變性是指核酸雙螺旋堿基對(duì)的氫鍵斷裂，雙鏈變成單鏈，改變了核酸的天然構(gòu)象和性質(zhì)。將DNA樣本在100℃加熱3 min可實(shí)現(xiàn)DNA變性［13］。DNA甲基化水平檢測(cè)需在上樣檢測(cè)前徹底酶解為單個(gè)脫氧核苷，因此本試驗(yàn)省去了DNA變性過(guò)程。終止酶解反應(yīng)是為防止殘存酶液對(duì)后續(xù)反應(yīng)產(chǎn)生影響，常通過(guò)高溫來(lái)實(shí)現(xiàn)，如65或85℃加熱10～15 min［11，13］。本試驗(yàn)中，酶解后的DNA為核酸基本單位，且直接用于HPLC檢測(cè)，無(wú)后續(xù)反應(yīng)，故省略。

3．1．2 HPLC法測(cè)定基因組DNA甲基化的注意事項(xiàng)

本試驗(yàn)使用的HPLC法對(duì)DNA濃度和質(zhì)量均有較高要求，建議用傳統(tǒng)方法提取。經(jīng)檢驗(yàn)，本試驗(yàn)設(shè)置的體系最多可消化25 μg DNA。此上限內(nèi)，增加用于酶解的DNA量可增加色譜峰面積，降低系統(tǒng)誤差。

5?mdC易氧化，如果DNA放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，酶解后的HPLC色譜圖中5?mdC所在峰右側(cè)會(huì)出現(xiàn)與主峰混合的小雜峰，造成積分誤差。因此，應(yīng)盡早酶解DNA進(jìn)行HPLC檢測(cè)。

酶解后的DNA體系，在過(guò)0．22 μm濾膜前后進(jìn)行瞬時(shí)離心，可保證較多的液體用于HPLC上樣檢測(cè)。

3．2 雞胚各組織基因組DNA甲基化水平變化規(guī)律

在哺乳動(dòng)物上的研究表明，表觀基因組于配子形成期和胚胎發(fā)育期經(jīng)歷2次消除和重建［14］，而表觀基因組水平與其穩(wěn)定性和環(huán)境敏感性直接相關(guān)。傳統(tǒng)的靜態(tài)模型理論認(rèn)為，表觀基因組的穩(wěn)定性與DNA甲基化和組蛋白修飾情況呈正比［15］。配子形成期和胚胎發(fā)育期的表觀基因組處于動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，易受外界環(huán)境影響。因家禽的胚胎發(fā)育環(huán)境區(qū)別于哺乳動(dòng)物，本試驗(yàn)研究了肉雞的胚胎發(fā)育期，以初步了解家禽胚胎發(fā)育過(guò)程中表觀基因組重編程的基本規(guī)律。

愛(ài)拔益加肉雞和紅原雞的DNA甲基化圖譜顯示，DNA甲基化集中在基因體和重復(fù)序列，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)的甲基化水平較低［16］?；騿?dòng)子區(qū)域的甲基化與否與基因表達(dá)密切相關(guān)：?jiǎn)?dòng)子甲基化抑制基因表達(dá)，去甲基化促進(jìn)基因表達(dá)。當(dāng)基因具有轉(zhuǎn)錄活性時(shí)，其啟動(dòng)子處于低甲基化狀態(tài)，即開啟基因表達(dá)。染色體存在復(fù)雜的折疊結(jié)構(gòu)，影響mRNA的轉(zhuǎn)錄效率，而DNA甲基化可改變?nèi)旧w的空間結(jié)構(gòu)，舒展折疊狀態(tài)，利于轉(zhuǎn)錄因子與基因結(jié)合，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。研究表明，有活性X染色體的甲基化水平是無(wú)活性的2倍，且主要表現(xiàn)在基因體上，基因啟動(dòng)子則呈現(xiàn)低甲基化狀態(tài)［17］。

雞胚發(fā)育分3個(gè)階段：孵化第1～4天發(fā)育內(nèi)部器官，為發(fā)育早期；第5～15天發(fā)育外部器官發(fā)育階段，為發(fā)育中期；第16～19天是雞胚的生長(zhǎng)階段，為發(fā)育后期。實(shí)際操作中，從雞胚發(fā)育第8天起能有效分離足夠的心臟、肝臟和肌肉組織用于DNA提取，因此，本試驗(yàn)選取的第1個(gè)時(shí)間點(diǎn)為雞胚發(fā)育第8天。試驗(yàn)結(jié)果表明，雞胚發(fā)育過(guò)程中基因組DNA甲基化水平同哺乳動(dòng)物一樣呈逐漸升高的趨勢(shì)。

雞胚發(fā)育中期，骨骼和肌肉等功能相對(duì)單一的外部器官未完全發(fā)揮功能，DNA甲基化水平升高緩慢；雞胚發(fā)育后期，各組織器官體積快速增大，充分發(fā)揮功能以備出殼，基因中有礙mRNA轉(zhuǎn)錄的結(jié)構(gòu)可能通過(guò)甲基化作用得以改善，使DNA甲基化水平隨之迅速升高。部分研究認(rèn)為，雞胚在孵化后期出現(xiàn)甲基化高峰可能與該時(shí)期的胚胎體重增加有關(guān)［18］。

研究表明，同種動(dòng)物不同組織的基因組DNA甲基化模式存在差異［19－21］。本試驗(yàn)中，肝臟的甲基化模式明顯異于心臟和肌肉，可能與肝臟系生化代謝中心，各種mRNA轉(zhuǎn)錄旺盛，而心臟和肌肉同屬肌肉組織，功能相對(duì)單一有關(guān)。家雞胚胎發(fā)育早期DNA甲基化的MSAP分析結(jié)果顯示，家雞胚胎甲基化呈現(xiàn)較高的組織特異性，其中肝臟的甲基化程度較高，肺臟較低，腎臟和胸肌的甲基化水平相近。隨著雞胚發(fā)育的進(jìn)行，DNA甲基化水平呈逐漸增高的趨勢(shì)［18］。本試驗(yàn)結(jié)果與之相同。

4　結(jié) 論

①本試驗(yàn)應(yīng)用HPLC法檢測(cè)了雞胚基因組DNA甲基化水平，優(yōu)化后的HPLC法簡(jiǎn)化了操作步驟，縮短了酶解時(shí)間，改善了dC和5?mdC色譜峰的分離效果，為快速、準(zhǔn)確獲取各種組織基因組DNA甲基化水平奠定了基礎(chǔ)。

②隨著雞胚發(fā)育的進(jìn)行，各組織基因組DNA甲基化水平逐漸升高，且雞胚發(fā)育后期肝臟呈現(xiàn)較高的甲基化水平。

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（編輯 菅景穎）

Analysis of Variation of Genome DNA Methylation Level of Chick Embryo Tissues with High Performance Liquid Chromatography

LI Shizhao GUO Wei DU Chao JING Yufei LIU Yanli SHEN Jing YAO Junhu YANG Xiaojun?
（College of Animal Science and Technology，Northwest A＆F University，Yangling 712100，China）

?Corresponding author，associate professor，E?mail：yangxj＠nwsuaf．edu．cn

Abstract：This experiment was conducted to develop the high performance liquid chromatography（HPLC）method for genome DNA methylation level detection，and to explore the variation of genome DNA methylation level of chick embryo tissues preliminary．Firstly，the genome DNA methylation level detection method was improved from 2 aspects including DNA enzymatic hydrolysis system and HPLC instrument detection condi?tion；then，the DNA methylation level of heart，liver and muscle at embryonic ages of 8，11，14，17 days of Cobb 500 broiler chick embryo was detected by improved HPLC method，respectively．The results showed that the genome DNA methylation level of 3 tissues was increased with embryonic age increasing and that of liver was significantly higher than that of heart and muscle in later embryonic development（embryonic age of 17 days）（P＜0．05）．Heart and muscle showed no significant difference in DNA methylation level among all em?bryonic ages（P＞0．05）．It is concluded that the developed HPLC laid a good foundation for genome DNA methylation determination of tissues rapidly and accurately．Otherwise，the genome DNA methylation level ri?ses gradually with chick embryonic age increasing，and that of liver is higher in later embryonic development．［Chinese Journal of Animal Nutrition，2015，27（1）：171?177］

Key words：HPLC；chick；embryo；DNA methylation

通信作者：?楊小軍，副教授，碩士生導(dǎo)師，E?mail：yangxj＠nwsuaf．edu．cn

作者簡(jiǎn)介：李世召（1987—），男，河北邢臺(tái)人，博士研究生，從事家禽營(yíng)養(yǎng)表觀遺傳學(xué)研究。E?mail：lishizhao10160＠163．com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然基金項(xiàng)目（31272464，31001017）；教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才（NCET?12?0476）；陜西省科技新星基金（2012KJXX?18）

收稿日期：2014－08－24

doi：10．3969／j．issn．1006?267x．2015．01．021

文章編號(hào)：1006?267X（2015）01?0171?07

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

中圖分類號(hào)：S188