楊 蕊，張博洋，朱春玲，張洪毅，潘英樹，唐 博，張學(xué)明*

(1.吉林大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130062；2.吉林大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130062)

精子發(fā)生是一個(gè)高度有序而復(fù)雜的過程，生精母細(xì)胞(gonocytes)和精原干細(xì)胞(spermatogonial stem cells,SSCs)的正常發(fā)育分化受多種激素和細(xì)胞因子等的調(diào)控[1-2]。在幼齡至性成熟前的雄性個(gè)體，其睪丸曲細(xì)精索為實(shí)芯結(jié)構(gòu)，生精上皮僅由位于曲細(xì)精索中部的生精母細(xì)胞和位于周邊的未成熟支持細(xì)胞(sertoli cells,SCs)構(gòu)成[3-4]。SCs主要為精原細(xì)胞提供支持和營養(yǎng)作用，還有調(diào)控精子發(fā)生的功能[5]。隨著日齡的增長和睪丸的發(fā)育，生精母細(xì)胞逐漸遷移至生精上皮基膜發(fā)育為SSCs；SCs和SSCs在激素和細(xì)胞因子等的調(diào)控下協(xié)同發(fā)育，SSCs不斷增殖、分化和遷移，形成各級生精細(xì)胞；在青春期的特定階段，生精上皮內(nèi)側(cè)逐漸形成腔隙，腔隙不斷融合擴(kuò)大成管腔，形成曲細(xì)精管[6-8]。因此，生精母細(xì)胞和SSCs是精子發(fā)生的基礎(chǔ)，分離培養(yǎng)這些細(xì)胞對深入探討精子發(fā)生機(jī)理有重要的意義，而其特異分子標(biāo)記驗(yàn)證又是分離培養(yǎng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

目前，人和小鼠生精母細(xì)胞和SSCs的特異性分子標(biāo)記相關(guān)研究已取得顯著進(jìn)展。研究表明，SCs產(chǎn)生的膠質(zhì)細(xì)胞源神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)等對生精母細(xì)胞和SSCs的自我更新和增殖有重要調(diào)節(jié)作用[9]。而GDNF家族受體α-1(GDNF family receptor alpha-1,GFRα-1) 則可用于標(biāo)記小鼠等的生精母細(xì)胞和SSCs[7,10]。但在牛等大家畜，由于缺乏種屬特異性較強(qiáng)的抗體，雖有報(bào)道但尚有爭議，有必要進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證[1,11-13]。為此，基于前期工作，本研究從轉(zhuǎn)錄水平、蛋白表達(dá)水平和組織、細(xì)胞層面分別探討了這一問題，以期為后續(xù)相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑非必需氨基酸、β-巰基乙醇、青鏈霉素(雙抗)購自Hyclone 公司；0.25% 胰蛋白酶、DMEM高糖培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(PBS)購自Gibco 公司；胎牛血清(FBS)購自Biological Industries公司；牛血清白蛋白(BSA)購自Biosharp 公司；RNAiso plus購自大連TaKaRa公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo公司；胰蛋白酶、透明質(zhì)酸酶購自Sigma；兔抗GFRα-1、Nanog、IgG抗體和SABC免疫組化試劑盒購自武漢博士德公司；山羊抗兔Alexa Flour?-594購自美國Life Technologies公司；核熒光染料DAPI購自北京碧云天公司；GFRα-1、Nanog、18S RNA引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 睪丸組織的冷凍保存和復(fù)蘇動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(No.SY201903002)。新生1 d齡健康荷斯坦?fàn)倥２G丸在超凈臺內(nèi)將白膜剝除并將睪丸剪成體積約0.5 cm3的小塊，參照文獻(xiàn)[1,14]方法將其液氮保存?zhèn)溆?。取出凍存管，迅速置?7℃水浴中解凍復(fù)蘇睪丸組織，一部分用于原代生精細(xì)胞分離，另一部分用于石蠟切片蘇木精-伊紅(HE)染色、冰凍切片免疫熒光染色或曲細(xì)精索漂浮染色。

1.3 RT-PCR按1.2方法去除睪丸間質(zhì)，收集純化的曲細(xì)精索段。用TRIzol Reagent常規(guī)提取總RNA于-80℃保存?zhèn)溆谩⒓?xì)胞總RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)為cDNA。PCR反應(yīng)體系：R-Taq酶12.5 μL，cDNA 1 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，水10.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共45個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min。引物及片段大小見表1。

表1 PCR引物信息

1.4 石蠟切片HE染色將睪丸組織用PBS清洗后在4%多聚甲醛4℃下固定過夜，流水沖洗30 min，常規(guī)脫水、透明、包埋后切片(5 μm)烘干。經(jīng)二甲苯脫蠟、透明、復(fù)水、HE染色、梯度乙醇脫水、二甲苯透明后，用中性樹脂封片，晾干后觀察拍照。

1.5 生精母細(xì)胞分離培養(yǎng)參照文獻(xiàn)[4]方法，將睪丸組織復(fù)蘇后PBS清洗，用眼科剪將其充分剪碎，用PBS吹打重懸，靜置10～15 min后棄上清，重復(fù)多次直至去掉間質(zhì)細(xì)胞和組織，獲得較純的曲細(xì)精索段。加入消化液Ⅰ(含50 mg/L DNaseⅠ及1 g/L 膠原酶Ⅳ的DMEM)，在5% CO2、37℃條件下孵育30 min，隨后用含有10% FBS的DMEM終止消化，離心洗滌(1 000 r/min，5 min)去除上清，加入消化液Ⅱ(含1 g/L胰蛋白酶、1 g/L透明質(zhì)酸酶、50 mg/L DNase Ⅰ、1 g/L膠原酶Ⅳ的DMEM)同條件孵育5～10 min，孵育過程中需反復(fù)在顯微鏡下觀察組織消化程度，有大量單細(xì)胞出現(xiàn)后即終止消化；PBS離心洗滌數(shù)次，將所獲細(xì)胞用培養(yǎng)液(高糖DMEM+10% FBS+1%非必需氨基酸+0.1% β-巰基乙醇)重懸，40 μm網(wǎng)篩過濾去除未消化的組織塊及細(xì)胞團(tuán)塊，將細(xì)胞接種于0.1%明膠包被的培養(yǎng)皿中，5% CO2、37℃下培養(yǎng)2 h后觀察并收集未貼壁細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。

1.6 免疫組織化學(xué)染色組織冰凍切片(30 μm)的免疫染色步驟為：將切片用PBS緩沖的4%多聚甲醛室溫固定30 min，用30% H2O2-甲醇溶液(1∶50)室溫孵育30 min，雙餾水洗2次，再用5% BSA處理20 min；GFRα-1一抗(1∶200)室溫孵育1 h，PBS洗3×5 min(下同)，加入生物素化山羊抗兔二抗(1∶100)室溫下處理2 h；PBS洗后滴加SABC試劑，室溫孵育20 min；PBS洗后用DAB顯色，鏡下控制時(shí)間，蒸餾水清洗；封片晾干后顯微鏡下觀察拍照。

1.7 免疫熒光染色曲細(xì)精管漂浮免疫熒光染色按如下步驟進(jìn)下[11,15]。按1.5中所述，分離獲得的曲細(xì)精索段置于1.5 mL離心管中(以下都在管中進(jìn)行)，4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS洗后用50 mmol/L 甘氨酸處理15 min；PBS洗后用PBS+(加4%山羊血清+0.5% Triton X-100)處理1 h，加兔抗GFRα-1(PBS+1∶200稀釋)4℃孵育過夜。次日PBS清洗后用Alexa Fluor?594-山羊抗免IgG(PBS+1∶500稀釋)室溫避光(下同)孵育1 h；PBS清洗后加入DAPI(PBS 1∶1 000稀釋)染色10 min，磷酸緩沖液清洗3×5 min，將染色后的曲細(xì)精索段撈出鋪到載玻片上晾干，用抗淬滅劑封片，用Nikon 80iFL-F-P熒光顯微鏡觀察拍照。培養(yǎng)細(xì)胞(5 d)的免疫熒光染色步驟基本同上。

2 結(jié)果

2.1 Nanog和GFRα-1 mRNA在犢牛曲細(xì)精索中的表達(dá)RT-PCR分析顯示，犢牛生精上皮有多能性基因Nanog和生精母細(xì)胞/精原干細(xì)胞標(biāo)記基因GFRα-1 mRNA的表達(dá)，后者的表達(dá)水平顯著高于前者(P<0.05)。

圖1 新生犢牛曲細(xì)精索生精上皮中Nanog和GFRα-1 mRNA表達(dá)的RT-PCR檢測(*示P<0.05)

2.2 GFRα-1蛋白在犢牛生精母細(xì)胞中的表達(dá)HE染色顯示，曲細(xì)精索結(jié)構(gòu)及睪丸間質(zhì)保存良好，曲細(xì)精索中部可見許多SSCs的前體細(xì)胞，即生精母細(xì)胞，其核質(zhì)較大，呈大圓形(紅色箭頭)；緊靠基膜位于生精上皮周邊的是細(xì)胞核深染的未成熟SCs；生精上皮基膜、長梭形管周肌樣細(xì)胞及睪丸間質(zhì)細(xì)胞等結(jié)構(gòu)均清晰可見(圖2A)。以IgG為陰性對照(圖2B)，GFRα-1免疫組織化學(xué)染色顯示，曲細(xì)精索內(nèi)的中部有許多大圓形陽性細(xì)胞(紅色箭頭)，其位置和分布與圖2A中生精母細(xì)胞一致(圖2C)；曲細(xì)精索GFRα-1免疫熒光漂浮染色全鋪片結(jié)果進(jìn)一步顯示，GFRα-1陽性細(xì)胞位于曲細(xì)精索中部，與圖2A、C顯示的生精母細(xì)胞一致。

A.HE染色；B～C.GFRα-1免疫組化染色(B為陰性對照)；D～F.曲細(xì)精索GFRα-1免疫熒光漂浮染色(D為DAPI染色示核，E為GFRα-1陽性信號，F(xiàn)為DAPI/GFRα-1融合)紅色箭頭示生精母細(xì)胞

2.3 GFRα-1在體外培養(yǎng)犢牛生精母細(xì)胞/SSCs中的表達(dá)犢牛生精上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)2 h后部分細(xì)胞(主要是SCs)貼壁極化，伸出多個(gè)突起，而生精母細(xì)胞尚未貼壁。此時(shí)，收集懸浮細(xì)胞(主要為生精母細(xì)胞)進(jìn)一步培養(yǎng)，5 d后進(jìn)行免疫熒光染色鑒定(圖3)。這些細(xì)胞表現(xiàn)為典型的生精細(xì)胞形態(tài)，呈單個(gè)、成對、團(tuán)鏈狀、簇狀存在(圖3A,E，紅色虛線和箭頭)，貼附在少量未去除凈的有巨大扁平核的SCs上(圖3B,D,F,H，白色箭頭)生長，仍有GFRα-1和Nanog蛋白的表達(dá)(圖3C,D,G,H)。

A,E.差速貼壁分離培養(yǎng)5 d后明場示單個(gè)、成對、團(tuán)鏈(簇)狀的生精母細(xì)胞/SSCs；B,F.DAPI染色；C.GFRα-1陽性染色；D.DAPI/GFRα-1融合；G.Nanog陽性染色；H.DAPI/Nanog融合；紅色箭頭示生精母細(xì)胞/SSCs；白色箭頭示SCs核

3 討論

哺乳動(dòng)物精子發(fā)生是一個(gè)持續(xù)不斷的細(xì)胞增殖與分化過程。在新生個(gè)體的睪丸中，曲細(xì)精索呈實(shí)芯狀，此時(shí)生精上皮僅由位于中部的生精母細(xì)胞和周邊的未成熟SCs兩類形態(tài)截然不同的細(xì)胞組成[1,3-4,11]。這一階段在不同物種持續(xù)的時(shí)間不同，因細(xì)胞類型少，所以此階段有利于生殖細(xì)胞或SCs分離純化。隨著睪丸發(fā)育的進(jìn)行，SCs不斷接近成熟；生精母細(xì)胞則從中央漸向上皮基膜遷移并不斷增殖分化，到達(dá)由基膜和SCs突起及緊密連接等結(jié)構(gòu)形成的基底室，形成SSCs。SSCs通過自我更新和多次增殖分化，形成單個(gè)型(Asingle,As)、成對型(Apaired,Apr)、鏈狀(Aaligned,Aal)、A1-4型、間型(intermediate)、B型精原細(xì)胞及精母細(xì)胞、精子細(xì)胞、精子等，鑲嵌在SCs胞質(zhì)側(cè)面和頂部形成的凹陷中[3,7]。接近性成熟時(shí)，曲細(xì)精索中部逐漸形成管腔，此時(shí)稱為曲細(xì)精管，此時(shí)生精上皮由成熟SCs和各級生精細(xì)胞組成，細(xì)胞類型較為復(fù)雜，不利于各類細(xì)胞的分離純化及其分子標(biāo)記檢測。鑒于以上原因，本研究選用新生1 d齡犢牛睪丸為試驗(yàn)材料。

在嚙齒類、人、猴等物種，GFRα-1可作為SSCs的相對特異的分子標(biāo)記已取得共識[7,10,16]。在牛、羊、豬等大家畜，由于缺乏有種屬特異性的抗體等因素，GFRα-1在生精母細(xì)胞/SSCs的表達(dá)雖有報(bào)道，但仍有爭議[1,11-13]。為此，本試驗(yàn)從轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平、組織細(xì)胞原位和體外培養(yǎng)方面探究了這一問題。首先，分離了犢牛曲細(xì)精索片段，提取了生精上皮總RNA，RT-PCR方法檢測了Nanog和GFRα-1 mRNA水平的表達(dá)。Nanog是細(xì)胞多能性因子之一，其表達(dá)與生精母細(xì)胞/SSCs可分化為三胚層來源組織細(xì)胞的報(bào)道一致[17]。高水平GFRα-1 mRNA的表達(dá)提示其可作為生精母細(xì)胞/SSCs的分子標(biāo)記。

HE染色顯示，犢牛曲細(xì)精索中生精母細(xì)胞的形態(tài)和位置與小鼠一致[8]。在此基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)分別用普通免疫組化技術(shù)和曲細(xì)精索漂浮免疫熒光染色技術(shù)研究了GFRα-1在犢牛生精母細(xì)胞中的表達(dá)。這些GFRα-1陽性細(xì)胞的形態(tài)、大小和位置與HE染色切片中所示的生精母細(xì)胞完全一致。這從蛋白表達(dá)水平說明，GFRα-1可作為犢牛生精母細(xì)胞的分子標(biāo)記。

本試驗(yàn)進(jìn)一步用二步酶消化和差速貼壁法分離了犢牛生精母細(xì)胞，探討了體外培養(yǎng)中這些細(xì)胞是否持續(xù)表達(dá)GFRα-1。形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果表明，牛生精母細(xì)胞經(jīng)短暫培養(yǎng)后，其后代細(xì)胞表現(xiàn)出典型的SSCs或未分化精原細(xì)胞的特征，即呈單個(gè)存在的As型和由不完全胞質(zhì)分裂形成的細(xì)胞間橋(intercellular bridges)相連的Apr、Aal型等[7,10,17]。免疫熒光染色顯示，這些細(xì)胞不但持續(xù)表達(dá)GFRα-1蛋白，還表達(dá)多能性標(biāo)記蛋白Nanog，提示其為生精母細(xì)胞來源細(xì)胞且有一定干性(stemness)。

綜上所述，本研究基于前期基礎(chǔ)，從mRNA和蛋白水平、組織細(xì)胞原位表達(dá)和培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)等方面，驗(yàn)證了GFRα-1在牛生精母細(xì)胞及其后代細(xì)胞SSCs中的表達(dá)，為后續(xù)相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。