質(zhì)譜技術(shù)在臨床微生物實驗室中的應(yīng)用前景

羅燕萍

(解放軍總醫(yī)院微生物科，北京 100853)

質(zhì)譜技術(shù)在臨床微生物實驗室中的應(yīng)用前景

羅燕萍

(解放軍總醫(yī)院微生物科，北京 100853)

摘要：目前應(yīng)用于臨床微生物實驗室的基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS) 是一種直接從完整細(xì)菌中獲得蛋白指紋圖譜，從而對細(xì)菌進行快速鑒定的方法，由于可以對常見細(xì)菌，諾卡菌、分枝桿菌、厭氧菌、酵母菌及絲狀真菌進行快速和準(zhǔn)確的鑒定，近年來備受推崇。該文對這次質(zhì)譜專題刊登的1篇綜述和4篇論著進行總結(jié)評價。相信隨著相關(guān)研究的不斷深入，這項技術(shù)在臨床微生物實驗室將有更廣闊的應(yīng)用空間。

關(guān)鍵詞：基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜；細(xì)菌鑒定；臨床微生物實驗室

中圖分類號：

文章編號：1673-8640(2015)02-0097-04R446.5

文獻標(biāo)志碼：碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.02.001

Abstract:The matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) technique can be used to generate protein fingerprint signatures from whole bacterial cells. By comparing these fingerprints to a database of reference spectra by the various algorithms, bacteria can be rapidly identified. MALDI-TOF MS can be used for accurate and rapid identification of various microorganisms, such as common bacteria, Nocardia, Mycobacterium, anaerobe, yeast and filamentous fungi. MALDI-TOF MS have recently been widely introduced. The characteristics of one review and four papers published in the special subject about MALDI-TOF MS were reviewed. The development of studies in MALDI-TOF MS will play an important role in the application of mass spectrometry in clinical microbiological laboratories.

作者簡介：羅燕萍，女，1960年生，碩士，主任技師，主要從事臨床微生物耐藥機制研究。

收稿日期：(2014-12-16)

The prospects of mass spectrometry application on microbiologyLUOYanping.(DepartmentofMicrobiology,ChinesePLAGeneralHospital,Beijing100853,China)

Key words: Matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry； Bacteria identification；Clinical microbiology laboratory

自20世紀(jì)80年代起，質(zhì)譜技術(shù)就已經(jīng)成為科學(xué)研究中用于蛋白分析的強大工具。隨著技術(shù)的不斷成熟和廣泛使用，其在微生物檢驗常規(guī)診斷中的作用越來越受到關(guān)注，基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)已經(jīng)進入臨床微生物實驗室用于病原菌鑒定，與傳統(tǒng)的表型鑒定及分子生物學(xué)技術(shù)相比，MALDI-TOF MS快速、準(zhǔn)確、成本低廉。本刊本期集中刊登“質(zhì)譜技術(shù)在臨床微生物檢驗中的應(yīng)用”專題，旨在使臨床和實驗室工作者對其有一個全面的認(rèn)識和了解。

一、MALDI-TOF MS目前的應(yīng)用現(xiàn)狀

傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定流程通常是：根據(jù)細(xì)菌在不同培養(yǎng)基上的生長情況和菌落形態(tài)，應(yīng)用一些簡便、快速的試驗如革蘭染色、觸酶、氧化酶等進行初步分類，然后通過手工生化試驗或自動鑒定系統(tǒng)等來完成鑒定[1-2]。雖然有些試驗幾分鐘即可完成，但大部分情況下，完成常規(guī)細(xì)菌鑒定至少需要8～18 h或更長的時間(如苛養(yǎng)菌)。分子生物學(xué)如聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reactuin,PCR)、DNA 芯片、微陣列技術(shù)等方法雖然敏感性高，但費用高昂，且對操作人員、設(shè)備和環(huán)境有較嚴(yán)格的要求，不適合常規(guī)應(yīng)用。MALDI-TOF MS是將完整的病原菌細(xì)胞(intact-cell，IC)直接進行檢測，無需蛋白提純，樣本準(zhǔn)備很簡便，也有人稱之為 IC MALDI-TOF MS。許多研究表明，IC MALDI-TOF MS敏感性很高，可以區(qū)分表型相似甚至相同的菌株，提供屬、種、型水平的鑒定。目前報道使用質(zhì)譜進行微生物鑒定方面的問題主要集中在質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫容量和有些特定種屬無法明確區(qū)分上。

二、質(zhì)譜專題收錄論文的主要內(nèi)容

此次專題共刊登1篇綜述和4篇論著。綜述文章“MALDI-TOF MS在臨床微生物檢驗中的應(yīng)用”，從MADLI-TOF MS的基本原理、在微生物鑒定中的應(yīng)用、在科研中的應(yīng)用等三方面比較全面地介紹了目前MALDI-TOF MS在臨床微生物實驗室應(yīng)用的現(xiàn)狀及前景。質(zhì)譜技術(shù)對以葡萄球菌和鏈球菌為代表的革蘭陽性球菌鑒定到種水平的準(zhǔn)確率>99%，對腸桿菌科細(xì)菌鑒定到種水平的準(zhǔn)確率為96.60%，非發(fā)酵菌為98.75%，結(jié)核分枝桿菌為94.90%，非結(jié)核分枝桿菌為94.60%，對以擬桿菌屬為代表的厭氧菌可以達到97.50%，以酵母菌為主的真菌為97.30%。對臨床常見分離菌鑒定到種水平的準(zhǔn)確率很高，使質(zhì)譜技術(shù)在臨床微生物實驗室中得到廣泛應(yīng)用。另外，從陽性血培養(yǎng)和尿液樣本中直接鑒定病原菌作為一個研究方向也在大量的研究嘗試之中，尚未完全應(yīng)用于常規(guī)鑒定。利用特異峰值的分析對耐藥基因、血清分型、毒力等的研究也在不斷進行中。

本專題中“MALDI-TOF MS在中段尿樣本細(xì)菌直接檢測中的應(yīng)用”一文，應(yīng)用MALDI-TOF MS快速、直接檢測中段尿樣本中的細(xì)菌，嘗試建立中段尿快速細(xì)菌檢測和鑒定方法。其結(jié)論與國外相關(guān)研究相似：涂靶板之前必須將尿液樣本進行離心處理；較高的細(xì)菌計數(shù)可以提高鑒定到種的正確率；如果是2種以上細(xì)菌混合感染，鑒定結(jié)果是否正確取決于2種細(xì)菌的比例。該方法可比常規(guī)尿培養(yǎng)鑒定方法提早40 h左右報告鑒定結(jié)果。

血流感染是一種嚴(yán)重的感染性疾病，當(dāng)血培養(yǎng)瓶報告陽性時，微生物實驗室只能給臨床醫(yī)師暫報涂片結(jié)果，較快明確病原菌是微生物實驗室亟待解決的課題。目前國內(nèi)、外很多學(xué)者嘗試分子生物學(xué)方法如實時熒光定量PCR以及其它一些快速方法如微陣列技術(shù)、雜交探針、流式細(xì)胞術(shù)等直接從血培養(yǎng)陽性瓶中鑒定細(xì)菌。近幾年還有一些研究使用MALDI-TOF MS直接從陽性瓶中鑒定細(xì)菌。該方法首先最重要的一步是將細(xì)菌從細(xì)胞組分中分離出來，F(xiàn)ERRONI等[3]在樣本中環(huán)節(jié)做了很大的改進，血培養(yǎng)瓶報陽性后，應(yīng)用溫和去污劑裂解細(xì)胞膜，這一步只需要幾分鐘，從而使整個鑒定過程縮短到不足30 min。本專題中“分離膠促凝管聯(lián)合 MALDI-TOF MS直接檢測血培養(yǎng)陽性細(xì)菌”一文，采用分離膠促凝管預(yù)處理方法，其優(yōu)點是成本低廉，速度快(平均15 min/樣本)，安全性好，沒有過多的轉(zhuǎn)移、洗滌等工序，不容易引起氣溶膠等生物安全風(fēng)險。缺點是純度不佳，由于沒有額外的洗滌步驟，最終得到的菌體富集物始終還是含有部分細(xì)胞碎片，其對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌的檢出率分別為80.10%和86.90%；聯(lián)合法對念珠菌的檢出率較低，僅為22.20%，還有進一步提升和改進的空間，期待通過方法學(xué)的改進使質(zhì)譜技術(shù)直接實時鑒定血培養(yǎng)陽性瓶中細(xì)菌成為可能。

有學(xué)者將MALDI-TOF MS 與其它方法做比對進行細(xì)菌鑒定，得出的結(jié)論是質(zhì)譜技術(shù)對常規(guī)分離細(xì)菌的鑒定正確率相對于其它方法而言較高?！癕icroflexTMMALDI-TOF MS和Vitek 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)對腸桿菌科細(xì)菌鑒定能力的比較”一文，將關(guān)注點放在腸桿菌科細(xì)菌上，這2種儀器對細(xì)菌種的鑒定符合率分別為97.10%和83.30%，對于陰溝腸桿菌復(fù)合群內(nèi)的陰溝腸桿菌、霍氏腸桿菌和路德維希腸桿菌，普通變性桿菌復(fù)合群中的普通變形桿菌和潘氏變形桿菌，液化沙雷菌群中的液化沙雷菌，小腸結(jié)腸耶爾森菌群中的小腸結(jié)腸耶爾森菌，質(zhì)譜技術(shù)通常可以鑒定到種水平，而后者只能鑒定到群，印證了質(zhì)譜技術(shù)對于常規(guī)分離細(xì)菌鑒定到種的正確率較高的結(jié)論。

“兩種MALDI-TOF MS系統(tǒng)快速鑒定血培養(yǎng)中白念珠菌以外酵母樣真菌”一文，比較了2種不同MALDI-TOF MS系統(tǒng)對白念珠菌以外酵母樣真菌的鑒定率，目前市場上有不同廠家的質(zhì)譜儀盡管原理相似，但各有自己的特點，該文的結(jié)論指出Autoflex MALDI-TOF MS 對念珠菌尤其是近平滑念珠菌復(fù)合體鑒定的分辨率較高，但本研究對比的菌株數(shù)略少(59株，包括11種真菌)，結(jié)論需要更大、更多樣化樣本的支持。如在LACROIX等[4]的兩種質(zhì)譜技術(shù)在念珠菌鑒定的研究中，樣本量達到1 383株，最終2種方法的鑒定正確率均為98.30%，相差并不顯著。

本次質(zhì)譜專題收錄的文章主要涉及到鑒定方法的比對和從血培養(yǎng)陽性及尿液樣本中直接檢測鑒定細(xì)菌，這也是近幾年國內(nèi)外相關(guān)研究的熱點，我們也期待有更多質(zhì)譜應(yīng)用方面的研究，推動質(zhì)譜技術(shù)在臨床微生物領(lǐng)域的應(yīng)用范圍進一步擴大。

三、MALDI-TOF MS未來的發(fā)展方向

近年來，越來越多的臨床微生物實驗室開始引入MALDI-TOF MS進行常規(guī)樣本的細(xì)菌和真菌鑒定，隨著研究的不斷深入，MALDI-TOF MS的應(yīng)用領(lǐng)域也將變得越來越廣泛，主要有3個方面：在流行病學(xué)中的應(yīng)用、從患者樣本中直接檢測病原菌和對耐藥機制的檢測。

(一)流行病學(xué)

微生物實驗室、感染控制人員和臨床醫(yī)師面臨的挑戰(zhàn)之一是在某個臨床菌株暴發(fā)流行時可以得到菌株代表分類的特異數(shù)據(jù)，如沙門菌、鏈球菌等，為了準(zhǔn)確得到血清型、亞型或其它分類，實驗室必須耗費更多的時間做進一步檢測，而且許多菌株分型需要特殊的試驗方法、儀器、耗材等。因此，條件有限的實驗室就需要外送做檢測，可能導(dǎo)致檢測時間延長、丟失重要的流行病學(xué)數(shù)據(jù)、增加檢測費用、結(jié)果不準(zhǔn)確等。但如果在微生物實驗室內(nèi)快速、準(zhǔn)確完成重要數(shù)據(jù)的結(jié)果將會幫助臨床醫(yī)師、護士、感控人員和衛(wèi)生機構(gòu)處理、追蹤感染病原菌并掌握其流行狀況。目前，通過大量菌株的群、屬、種分析，以及許多菌株分型研究的深入，MALDI-TOF MS所具備的鑒定這些高度相關(guān)菌株的能力將使臨床微生物實驗室的影響力提升。將來可能出現(xiàn)更加精密的MALDI-TOF MS儀器，不但可以鑒定病原菌，同時可以快速、準(zhǔn)確地提供菌株的流行病學(xué)數(shù)據(jù)，這將使臨床微生物實驗室在醫(yī)院感染控制、病原菌暴發(fā)、耐藥菌國家監(jiān)測及生物防御等領(lǐng)域扮演重要角色。

(二)MALDI-TOF MS直接從患者樣本鑒定細(xì)菌

因為不需要對目標(biāo)物質(zhì)進行擴增以及其鑒定病原菌的高敏感性， MALDI-TOF MS直接從樣本中檢測細(xì)菌的能力可能取代PCR。通過對這些患者樣本處理方法的改良，主要包括去除蛋白、核酸、細(xì)胞碎片等可以影響分析的組分，MALDI-TOF MS直接從樣本中進行細(xì)菌鑒定的能力會進一步提高。以下是直接從不同樣本類型中鑒定的報道。

1.尿液樣本目前的研究表明，對于計數(shù)>105的尿液樣本，通過低速離心去除細(xì)胞碎片和白細(xì)胞，高速離心得到細(xì)菌，再用甲酸和乙腈處理得到蛋白用于質(zhì)譜分析，鑒定準(zhǔn)確率>90%[5-6]。存在的問題是MALDI-TOF MS尚不能對混合感染的尿液進行準(zhǔn)確鑒定；沒有標(biāo)準(zhǔn)化的尿液前期處理流程。而上述的處理流程是目前被證實較簡便、快速且保證質(zhì)譜鑒定準(zhǔn)確的方法[6-7]?？傊琈ALDI-TOF MS在單一細(xì)菌的尿液樣本中直接檢測具有很強大的、準(zhǔn)確的鑒定能力。

2.腦脊液細(xì)菌性腦膜炎是臨床最嚴(yán)重的感染之一，快速、準(zhǔn)確的檢測非常重要，目前通過MALDI-TOF MS直接檢測腦脊液細(xì)菌的研究較少，有一份報道肺炎鏈球菌引起的腦膜炎，前期處理流程與尿液樣本相似[8]。

3.血培養(yǎng)陽性瓶中直接鑒定目前有許多從陽性血培養(yǎng)瓶中準(zhǔn)確鑒定病原菌的方法，但由于使用的軟件不同，血培養(yǎng)瓶(培養(yǎng)系統(tǒng))不同，因此，無法客觀地比較這些方法的優(yōu)劣。有的研究認(rèn)為提取細(xì)胞蛋白優(yōu)于完整細(xì)胞分析，無碳顆粒的血培養(yǎng)瓶會得到準(zhǔn)確的鑒定率，而含有碳顆粒的血培養(yǎng)瓶則結(jié)果不好[9-12]。總之，從血培養(yǎng)瓶中直接檢測細(xì)菌和真菌可以顯著地縮短鑒定時間[13-14]，隨著研究的深入，這些檢測方法也會進一步改進，以獲得更方便可行的操作和更高的敏感性，提高革蘭陽性菌及念珠菌等病原菌的檢出能力。

(三)耐藥性檢測

微生物實驗室不但要提供精確的病原菌鑒定結(jié)果，同時還要檢測其敏感性，為臨床醫(yī)生提供治療依據(jù)。常規(guī)的藥物敏感性試驗方法比較費時，一些酶聯(lián)免疫、凝集等方法只能局限于少數(shù)細(xì)菌。MALDI-TOF MS可為耐藥基因檢測提供一個很好的平臺，可以分析幾乎所有的耐藥機制，目前報道的方法主要基于下列幾種原理：分析抗菌藥物及被修飾后的產(chǎn)物；分析細(xì)胞組分；分析核糖體DNA甲基化；檢測突變等。

1.通過抗菌藥物的變化檢測酶活性如直接檢測β-內(nèi)酰胺酶活性，檢測方法基本相似：收集新鮮培養(yǎng)的待測細(xì)菌，與β-內(nèi)酰胺分子反應(yīng)后，用MALDI-TOF MS檢測β-內(nèi)酰胺分子及其降解產(chǎn)物的特異峰[15-16]。有文獻報道通過檢測美羅培南及其降解產(chǎn)物，證實了30株產(chǎn)IPM-7、VIM-2的銅綠假單胞菌，產(chǎn)VIM-1、KPC-2、NDM-1的腸桿菌產(chǎn)生碳青霉烯酶，其敏感性和特異性均超過95%。檢測β-內(nèi)酰胺酶尤其是碳青霉烯酶的方法已經(jīng)應(yīng)用于一些常規(guī)實驗室[17-21]。

2.MALDI-TOF MS直接檢測耐藥決定基團對多耐藥細(xì)菌蛋白組學(xué)的研究可以建立耐藥機制相關(guān)的主要蛋白指紋圖譜，最近一種檢測耐萬古霉素腸球菌的方法已經(jīng)被證實有效。這種方法可以在微生物實驗室用于vanB陽性屎腸球菌的快速檢測[22]。用MALDI-TOF MS區(qū)分耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌時有一定挑戰(zhàn)，盡管有相關(guān)研究，但方法需要進一步優(yōu)化和驗證[23]。到目前為止，還沒有一種方法可以檢測其它的如β-內(nèi)酰胺酶耐藥決定基團的特異性峰值[24]。

3.分析細(xì)胞壁組分幾乎一半以上的抗菌藥物的作用靶位位于細(xì)胞壁上，因此，細(xì)菌細(xì)胞壁在抗菌藥物耐藥中的重要性不言而喻。其它抗菌藥物則需要越過細(xì)胞壁屏障到達它們的作用靶點。對革蘭陰性桿菌外膜蛋白的蛋白組學(xué)和基因組學(xué)研究表明，膜孔蛋白、外排泵、脂多糖等細(xì)胞組分系統(tǒng)主要是通過對不同抗菌藥物泵入和泵出的調(diào)節(jié)而表現(xiàn)耐藥的[25]。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳及2D電泳結(jié)合MALDI-TOF MS指紋圖譜可以用來鑒定耐藥和敏感菌株表達水平不同的外膜及周漿蛋白，建立一個綜合的數(shù)據(jù)庫來研究各種細(xì)胞組分，在耐藥檢測中發(fā)揮不同的作用[26-27]。

4. 檢測耐藥機制MALDI-TOF MS通過分析DNA來檢測耐藥機制，如可以通過檢測單核苷酸多態(tài)性來鑒定SHV-型、TEM-型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶等[28-29]。

5.抗菌藥物檢測MALDI-TOF MS檢測的相對分子質(zhì)量范圍較大，而抗菌藥物的相對分子質(zhì)量通常<1 000因此，基質(zhì)和較高的背景干擾使得這項技術(shù)在檢測抗菌藥物時變得復(fù)雜。LIN等通過方法學(xué)的改進，目前已成功檢測出水楊酰胺等6種抗菌藥物，未來這種方法有可能用于耐藥機制及檢測血樣本中的微生物毒素和藥物等[30]。

隨著質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫及分析軟件的不斷更新，所有病原菌鑒定的時間都會縮短。盡管一些方法目前還不能常規(guī)應(yīng)用于微生物實驗室，但隨著這些檢測方法的不斷優(yōu)化和標(biāo)準(zhǔn)化，一定會有廣闊的應(yīng)用前景。實驗技術(shù)不斷發(fā)展，使得臨床微生物實驗室從曾經(jīng)最慢速服務(wù)的實驗室逐步轉(zhuǎn)變?yōu)橐粋€可以快速、準(zhǔn)確為患者提供結(jié)果的充滿活力的新實驗室。我們相信MALDI-TOF MS在未來一定會在臨床微生物實驗室扮演更重要的角色。

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(本文編輯：姜敏)