周韻嬌，　李　鵬，　張麗紅，　錢英俊，　牛建英

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，上海 200240；

2.復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院腎內(nèi)科，上海 200240)

慢性腎小球腎炎患者外周血Th1/Th2及CD28+細(xì)胞的變化及其臨床意義

周韻嬌1，李鵬2，張麗紅2，錢英俊2，牛建英2

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，上海 200240；

2.復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院腎內(nèi)科，上海 200240)

摘要：目的探討慢性腎小球腎炎(CGN)患者外周血Th1/Th2及CD28+細(xì)胞百分率的變化在疾病進(jìn)程中可能的細(xì)胞免疫學(xué)機(jī)制。方法采用流式細(xì)胞術(shù)檢測50例CGN患者及30名正常人(對照組)外周血Th1/Th2和CD28+細(xì)胞的百分率，用SPSS 16.0軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果與對照組比較，CGN患者外周血CD3+CD4+細(xì)胞百分率和CD4/CD8比值明顯降低(P<0.05)，Th1和Th2細(xì)胞百分率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但Th1/Th2比值明顯增高(P<0.05)；CGN患者CD28+、CD4+CD28+細(xì)胞百分率明顯減少(P均<0.01)。結(jié)論CGN患者體內(nèi)T細(xì)胞免疫功能紊亂和活化受限，細(xì)胞免疫功能低下，Th1和Th2細(xì)胞失衡，通過對CGN患者外周血Th1/Th2及CD28+細(xì)胞的檢測，有助于了解患者的細(xì)胞免疫狀態(tài)，為臨床診斷和免疫治療提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：Th1/Th2細(xì)胞；CD28+細(xì)胞；流式細(xì)胞術(shù)；慢性腎小球腎炎

中圖分類號：

文章編號：1673-8640(2015)02-0141-04R446.63

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.02.009

Abstract:ObjectiveTo investigate the possible mechanism of cellular immunology in the process of chronic glomerulonephritis (CGN) by the detection of Th1/Th2 ratio and CD28+cell percentages from peripheral blood in patients with CGN. MethodsTh1/Th2 ratio and CD28+cell percentages were detected by flow cytometry from 50 patients with CGN and 30 healthy subjects (control group). SPSS 16.0 software was used to analyze the results. ResultsCompared with control group, the percentages of CD3+CD4+cells and CD4/CD8 ratio of patients with CGN decreased significantly (P<0.05). Although there was no statistical significance in the percentages of Th1 and Th2 cells (P>0.05), yet Th1/Th2 ratio increased significantly (P<0.05). The percentages of CD28+and CD4+CD28+cells decreased significantly (P<0.01). ConclusionsT cell immune function is disorder, and activation is restricted in patients with CGN. Their cellular immune function is low, and there exists imbalance between Th1 and Th2 cells. The detection of Th1/Th2 ratio and percentages of CD28+cells from peripheral blood in patients with CGN is valuable to understand the immune state so as to provide the theoretical basis for immune therapy.

基金項(xiàng)目：閔行區(qū)科委自然基金項(xiàng)目(2010MHZ027)

作者簡介：周韻嬌，女，1981年生，碩士，主管技師，主要從事細(xì)胞免疫研究工作。

通訊作者：牛建英，聯(lián)系電話：021-64308151。

收稿日期：(2014-02-25)

The variation and its clinical significance of Th1/Th2 and CD28+cells from peripheral blood in patients with chronic glomerulonephritisZHOUYunjiao1,LIPeng2,ZHANGLihong2,QIANYingjun2,NIUJianying2.(1.CentralLaboratory,theFifthPeople′sHospitalofShanghai,FudanUniversity,Shanghai200240,China; 2.DepartmentofNephrology,theFifthPeople′sHospitalofShanghai,FudanUniversity,Shanghai200240,China)

Key words: Th1/Th2 cell; CD28+cell; Flow cytometry; Chronic glomerulonephritis

慢性腎小球腎炎(chronic glomerulonephritis，CGN)是引起腎功能衰竭的主要病因，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，不僅與體液免疫有關(guān)，而且免疫活性細(xì)胞也參與了疾病的發(fā)生和發(fā)展。作為免疫炎癥性腎病，體液免疫在CGN發(fā)病及進(jìn)展中的機(jī)制已經(jīng)得到了廣泛而深入的研究和證實(shí)，而關(guān)于CGN細(xì)胞免疫方面的研究較少。T淋巴細(xì)胞是機(jī)體細(xì)胞免疫的重要指標(biāo)，在CGN的發(fā)生與發(fā)展中起著重要的作用，而T細(xì)胞的活化是其發(fā)揮免疫效應(yīng)的基礎(chǔ)。本研究通過觀察50例CGN患者外周血Th1/Th2細(xì)胞比值及共刺激分子CD28的水平，探討Th1/Th2細(xì)胞比值及共刺激分子CD28的變化在CGN進(jìn)展過程中可能的細(xì)胞免疫學(xué)機(jī)制，為臨床診斷和尋找有效、合理的治療手段提供線索和思路。

材料和方法

一、研究對象

收集上海市第五人民醫(yī)院CGN患者50例，其中男30例，女20例，年齡(55.06±15.71)歲，診斷符合“1992年《中華內(nèi)科雜志》編委會腎病專業(yè)組“原發(fā)性腎小球疾病分型與治療及診斷標(biāo)準(zhǔn)”[1]，排除繼發(fā)性腎小球疾病、合并感染及其它自身免疫性疾病，所有病例半年內(nèi)未使用糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑等治療。對照組為上海市第五人民醫(yī)院同期體檢健康者，共30名，其中男18名，女12名，年齡(52.67±13.42)歲，無自身免疫性疾病或遺傳性疾病家族史。

二、 試劑和儀器

1.試劑雙色淋巴細(xì)胞亞群分析試劑盒[抗體組成為CD3/CD4、CD3/CD8、IgG1/IgG2a，均為異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)/藻紅蛋白(phycoerythrin, PE)雙色標(biāo)記]、CD3-多甲藻葉綠素蛋白(multivalent algal chlorophll protein, PerCP)、CD4-FITC、CD8-FITC、CD28-PE、白細(xì)胞介素4(interleukin4, IL-4)-PE、干擾素γ(interferon gamma,IFN-γ)-PE、IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1-PerCP、IgG2b-PE均為Becton-Dickinson(美國)公司產(chǎn)品，溶血素、固定破膜劑和標(biāo)準(zhǔn)熒光微球?yàn)锽eckman Coulter公司生產(chǎn)，佛波醇酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)、莫能霉素(monensin)、離子霉素(ionomycin)、二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)均為Sigma公司(美國)產(chǎn)品，RPMI1640、胎牛血清、青鏈霉素均為GIBCO公司(美國)產(chǎn)品，無水甲醇為國藥集團(tuán)(中國)生產(chǎn)。

2.儀器Beckman Coulter Epics XL流式細(xì)胞分析儀(美國)，Thermo Forma公司(美國)CO2培養(yǎng)箱，Eppendorf 5702低速離心機(jī)(德國)。

三、 方法

1.樣本采集 所有研究對象于清晨空腹靜脈采血2 mL(肝素抗凝),充分顛倒混勻，用于流式細(xì)胞術(shù)分析。

2.T細(xì)胞亞群及CD28+細(xì)胞的檢測采用流式細(xì)胞術(shù)檢測所有研究對象外周血中的CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、Th1(CD4+IFN-γ+)、Th2(CD4+IL-4+)、CD28+、CD4+CD28+、CD8+CD28+細(xì)胞百分率。

四、 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié)果

一、CGN組和對照組外周血T淋巴細(xì)胞亞群

與對照組比較，CGN患者CD3+CD4+細(xì)胞百分率和CD4/CD8比值降低(P<0.05)，CD3+、CD3+CD8+細(xì)胞百分率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；Th1/Th2比值增高(P<0.05)，但Th1和Th2細(xì)胞百分率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1CGN患者與對照組外周血T細(xì)胞亞群結(jié)果比較

組別 CD3+(%)CD3+CD4+(%)CD3+CD8+(%)Th1(%)Th2(%)CD4/CD8Th1/Th2對照組65.69±6.3837.43±5.0723.50±7.249.90±3.121.45±0.591.85±1.007.62±2.91CGN組63.46±7.3734.65±5.53*27.28±8.8111.51±3.931.30±0.371.47±0.72*9.67±5.15*

注：與對照組比較，*P<0.05;CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+細(xì)胞百分率用占淋巴細(xì)胞總數(shù)的百分比表示，Th細(xì)胞百分率用占CD3+細(xì)胞的百分比表示

二、CGN組和對照組外周血CD28+細(xì)胞

與對照組比較，CGN患者CD28+和CD4+CD28+細(xì)胞百分率明顯降低(P均<0.01)，CD8+CD28+細(xì)胞百分率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2CGN患者與對照組外周血CD28+細(xì)胞

百分率結(jié)果比較

組別 CD28+CD4+CD28+CD8+CD28+對照組56.69±6.8234.04±4.878.35±3.47CGN組50.54±5.59*30.58±5.30*9.50±2.53

注：與對照組比較，*P<0.01；CD28+、CD4+CD28+、CD8+CD28+細(xì)胞用占CD3+細(xì)胞的百分比表示

討論

CGN是一種病程遷延、緩慢、進(jìn)行性發(fā)展的慢性腎病，以往對CGN免疫病理機(jī)制的研究較集中于細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，由其介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在疾病進(jìn)展中的機(jī)制也已經(jīng)得到了公認(rèn)[2-3]，而對免疫活性細(xì)胞在疾病進(jìn)展中的機(jī)制研究較少，但它卻在CGN的整個(gè)病程中發(fā)揮著重要的作用[4-5]。

淋巴細(xì)胞是人體內(nèi)最主要的免疫活性細(xì)胞，正常情況下，機(jī)體通過淋巴細(xì)胞亞群間的相互作用維持正常的免疫功能，某一亞群數(shù)量或功能的異常，均會導(dǎo)致機(jī)體的免疫紊亂，出現(xiàn)一系列的病理改變。T細(xì)胞是淋巴細(xì)胞中的主要細(xì)胞亞群，是細(xì)胞免疫和免疫調(diào)節(jié)的主要執(zhí)行者，其數(shù)量和活性的改變是機(jī)體細(xì)胞免疫狀態(tài)的重要指標(biāo)。CD4+和CD8+細(xì)胞是T淋巴細(xì)胞的2個(gè)亞群，兩者形成的T細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)維持并調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫功能的平衡，任何原因引起的CD4+或CD8+細(xì)胞數(shù)量的升高或降低都會使兩者比例失調(diào)，導(dǎo)致機(jī)體免疫功能的異?；蛭蓙y，從而出現(xiàn)自身免疫性疾病。

CGN作為一種感染引發(fā)的自身免疫性疾病，細(xì)胞免疫在疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用，腎纖維化患者出現(xiàn)大量的CD4+T淋巴細(xì)胞浸潤[6]。為了深入探討細(xì)胞免疫介導(dǎo)的CGN的可能發(fā)病機(jī)制，本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測了50例CGN患者外周血Th1/Th2及CD28+細(xì)胞的百分率。為了獲得更準(zhǔn)確和可靠的試驗(yàn)結(jié)果，檢測前，采用標(biāo)準(zhǔn)熒光微球?qū)x器進(jìn)行光路校準(zhǔn)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，CGN患者CD3+CD4+細(xì)胞百分率和CD4/CD8比值明顯降低，CD3+CD8+細(xì)胞百分率雖有增多趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CD3+CD4+細(xì)胞百分率的降低導(dǎo)致CD4/CD8比值的變化，說明CGN患者存在T細(xì)胞亞群失衡，機(jī)體細(xì)胞免疫功能紊亂，CD3+CD4+細(xì)胞是引起T細(xì)胞亞群失衡的主要因素，該結(jié)果證實(shí)了已有的報(bào)道[4]。

CD4+T細(xì)胞根據(jù)產(chǎn)生的細(xì)胞因子和功能不同可以分為Th1和Th2亞群，Th1具有促進(jìn)細(xì)胞免疫和免疫調(diào)節(jié)的作用，其效應(yīng)反應(yīng)失調(diào)會導(dǎo)致細(xì)胞免疫介導(dǎo)的器官特異性自身免疫性疾病，Th2具有增強(qiáng)體液免疫和免疫調(diào)節(jié)的作用，2種細(xì)胞比例的失調(diào)與自身免疫性疾病的發(fā)病密切相關(guān)。本研究以CD4+IFN-γ+和CD4+IL-4+分別作為Th1和Th2細(xì)胞的標(biāo)志，結(jié)果顯示，CGN 患者Th1和Th2細(xì)胞百分率較對照組分別有增多和減少的趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而Th1/Th2比值較對照組增高。該結(jié)果說明CGN患者存在Th1/Th2平衡失調(diào)，機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性遭到破壞，這可能與CGN患者細(xì)胞免疫功能的異常和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫病理過程有關(guān)。

細(xì)胞免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)是T細(xì)胞對抗原的識別和有效激活，這是一個(gè)由多因素參與的復(fù)雜的生物學(xué)過程，有賴于共刺激分子提供協(xié)同刺激信號，從而調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能。在這一過程中，CD28和B7分子分別作為受體和配體，在T細(xì)胞的活化和增殖中起主導(dǎo)作用[7]。CD28分子持續(xù)表達(dá)于T淋巴細(xì)胞表面[8]，與表達(dá)在抗原遞呈細(xì)胞(antigen presenting cell，APC)上的B7分子結(jié)合，為識別APC提呈的特異性抗原后的初始T細(xì)胞提供協(xié)調(diào)刺激信號，促進(jìn)T細(xì)胞活化和增殖，增強(qiáng)免疫應(yīng)答[9]。此外，CD28/B7還參與調(diào)節(jié)Th細(xì)胞的分化，CD28分子與B7的相互作用，促進(jìn)Th2細(xì)胞分化，間接抑制Th1的分化[10-11]。有研究表明，CD28+細(xì)胞參與了終末期腎臟病患者的疾病進(jìn)程，接受腹膜透析的患者，CD4+CD28null細(xì)胞較健康對照組明顯增多[12-13]。

本研究結(jié)果顯示，CGN患者CD28+、CD4+CD28+細(xì)胞百分率較對照組明顯減少，CD8+CD28+細(xì)胞百分率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CD28分子作為T細(xì)胞活化和耐受的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子，在Th(CD4+)細(xì)胞上的表達(dá)低下，說明CGN患者Th細(xì)胞的活化受到限制，從而不能產(chǎn)生有效的細(xì)胞免疫應(yīng)答，導(dǎo)致CGN患者細(xì)胞免疫功能低下，體液免疫也因此受累。由于CGN患者CD28+細(xì)胞百分率的降低，無法產(chǎn)生足夠的信號促進(jìn)Th2細(xì)胞的分化，間接促進(jìn)了Th1細(xì)胞的分化。Th1細(xì)胞通過分泌相應(yīng)的細(xì)胞因子啟動并促進(jìn)了腎組織的炎癥，從而加重腎臟的損傷。

綜上所述，CGN患者存在細(xì)胞免疫功能紊亂和T細(xì)胞亞群失衡，CD3+CD4+細(xì)胞是引起該失衡的主要因素，Th1/Th2平衡失調(diào)可能與細(xì)胞介導(dǎo)的免疫病理過程有關(guān)；CGN患者T細(xì)胞活化受抑，導(dǎo)致細(xì)胞免疫功能低下。通過對CGN患者外周血Th1/Th2和CD28+細(xì)胞的檢測，有助于了解體內(nèi)細(xì)胞免疫狀態(tài)，對病情的判斷和預(yù)后有一定的臨床參考價(jià)值，為免疫治療提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]王海燕, 鄭法雷, 劉玉春, 等. 原發(fā)性腎小球疾病分型與治療及診斷標(biāo)準(zhǔn)專題座談會紀(jì)要[J].中華內(nèi)科雜志，1993，32(2)：131-134.

[2]KIM YG, KIM EY, IHM CG, et al. Gene polymor-phisms of interleukin-17 and interleukin-17 receptor are associated with end-stage kidney disease[J]. Am J Nephrol, 2012, 36(5):472-477.

[3]王玲.慢性腎炎患者治療前后血漿leptin和血清IL-10、IL-18檢測的臨床意義[J]. 放射免疫學(xué)雜志，2010，23(5)：511-512.

[4]劉薇娜，鮑培玉，蔣全.慢性腎炎治療前后血清IL-2、IL-6、IL-10、IL-18和T淋巴細(xì)胞亞群檢測意義[J].中國實(shí)用醫(yī)藥，2010，5(15)：27-28.

[5]YOON JW, GOLLAPUDI S, PAHI MV, et al. Naive and central memory T-cell lymphopenia in end-stage renal disease [J]. Kidney Int, 2006, 70(2): 371-376.

[6]LIU L, KOU P, ZENG Q, et al. CD4+ T lymphocytes, especially Th2 cells, contribute to the progress of renal fibrosis[J]. Am J Nephrol, 2012, 36(4): 386-396.

[7]NDEJEMBI MP, TEIJARO JR, PATKE DS, et al. Control of memory CD4 T cell recall by the CD28/B7 costimulatory pathway[J]. J Immunol, 2006, 177(11): 7698-7706.

[8]MUGNAINI EN, EGELAND T, SPURKLAND A, et al. The T cell receptor repertoire of CD8+CD28- T lymphocytes is dominated by expanded clones that persist over time[J]. Clin Exp Immunol, 1999, 117(2): 298-303.

[9]SANSOM DM, MANZOTTIi CN, ZHENG Y. What′s the difference between CD80 and CD86[J]. Trends Immunol, 2003, 24(6):314-319.

[10]BOUR-JORDAN H, BLUESTON JA. CD28 function: a balance of costimulatory and regulatory signals[J]. J Clin Immunol, 2002, 22(1):1-7.

[11]WEBB LM, FELDMANN M. Critical role of CD28/B7 costimulation in the development of human Th2 cytokine-producing cells[J]. Blood, 1995, 86(9):3479-3486.

[12]SUN Z, YE H, TANG B, et al. Prevalence of circulating CD4+CD28 null T cells is associated with early atherosclerotic damage in patients with end-stage renal disease undergoing hemodialysis[J]. Hum Immunol, 2013, 74(1): 6-13.

[13]YADAV AK, JHA V. CD4+CD28null cells are expanded and exhibit a cytolytic profile in end-stage renal disease patients on peritoneal dialysis[J]. Nephrol Dial Transplant, 2011, 26(5): 1689-1694.

(本文編輯：姜敏)