姜?jiǎng)ξ?，　楊　宇，　?yīng)春妹

(1. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200127；

2.上海奧普生物醫(yī)藥有限公司，上海 201203；3.復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院，上海 200011)

乳膠增強(qiáng)免疫散射比濁法檢測(cè)血清淀粉樣蛋白A的應(yīng)用評(píng)價(jià)

姜?jiǎng)ξ?，楊宇2，應(yīng)春妹3

(1. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200127；

2.上海奧普生物醫(yī)藥有限公司，上海 201203；3.復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院，上海 200011)

摘要：目的建立乳膠增強(qiáng)散射免疫比濁法檢測(cè)血清淀粉樣蛋白A(SAA)的即時(shí)檢驗(yàn)(POCT)方法，并對(duì)該法的精密度、線性、準(zhǔn)確度等進(jìn)行評(píng)價(jià)。方法建立乳膠增強(qiáng)免疫比濁法測(cè)定SAA的POCT方法，并根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)相關(guān)文件對(duì)建立的POCT方法進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)。結(jié)果本法的分析靈敏度為3.52 mg/L；批內(nèi)變異系數(shù)(CV)<8%、日間CV<10%；抗干擾性較強(qiáng)，血紅蛋白≤4.0 g/L、膽紅素≤400 μmol/L、類風(fēng)濕因子≤1 621 U/L、甘油三酯≤10 mmol/L對(duì)測(cè)定無影響；與進(jìn)口N Latex SAA試劑相關(guān)性良好(Y=1.052 1X+0.001 5，r=0.998 3)；線性范圍為5～200 mg/L。結(jié)論本法具有簡(jiǎn)單、快速(3 min內(nèi)完成檢測(cè))的特點(diǎn)，各項(xiàng)分析指標(biāo)均符合要求，可用于臨床患者血清標(biāo)本的檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：淀粉樣蛋白A；血清；乳膠增強(qiáng)免疫比濁法；即時(shí)檢驗(yàn)

中圖分類號(hào)：

文章編號(hào)：1673-8640(2015)01-0049-04R446.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.01.012

Abstract:ObjectiveTo establish the analysis performance of serum amyloid A (SAA) detected by latex-enhanced immunonephelometry method with point-of-care test (POCT), and to evaluate precision, linearity, accuracy and so on. MethodsAccording to relevant documents of the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)， the methodological evaluation was performed. ResultsThe sensitivity of this method was 3.52 mg/L. The within-run and inter-day coefficients of variation (CV) of this method were <8% and <10%, respectively, with strong anti-interference ability. When the level of hemoglobin was ≤4.0 g/L, the level of bilirubin was ≤400 μmol/L, the level of rheumatoid factor was ≤1 621 U/L, and the level of triglyceride was ≤10 mmol/L, there was no influence on the results. There was a good correlation with that of imported N Latex SAA assay (Y=1.052 1X+0.001 5, r=0.998 3). The detection linear range of this method was 5-200 mg/L. ConclusionsThe latex-enhanced immunonephelometry method for SAA is convenient, and it can be finished within 3 min. Its performance meets the requirements for in vitro diagnostic reagents, and it is suitable for the detection of serum samples in clinical use.

作者簡(jiǎn)介：姜?jiǎng)ξ?，男?983年生，主要從事臨床檢驗(yàn)工作。

通訊作者：應(yīng)春妹，聯(lián)系電話：021-63455050。

收稿日期：(2014-02-17)

Application evaluation of latex-enhanced immunonephelometry method to determine serum amyloid AJIANGJianwei1，YANGYu2，YINGChunmei3.(1.DepartmentofClinicalLaboratory，RenjiHospital，ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine，Shanghai200127，China; 2.ShanghaiUpperBio-TechPharmaCo.，Ltd.，Shanghai201201,China; 3.ObstetricsandGynecologyHospitalofFudanUniversity,Shanghai200011,China)

Key words: Amyloid A；Serum；Latex-enhanced immunonephelometry method；Point-of-care test

血清淀粉樣蛋白A(serum amyloid A protein ，SAA)是一種急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，屬于載脂蛋白家族中的異質(zhì)類蛋白質(zhì)，相對(duì)分子質(zhì)量約為12 000。在急性時(shí)相反應(yīng)中，經(jīng)白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1、IL-6和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)刺激，SAA在肝臟中由被激活的巨噬細(xì)胞和纖維母細(xì)胞合成，可升高到最初濃度的100～1 000倍。與C反應(yīng)蛋白 (C reactive protein，CRP) 類似，SAA是反映感染性疾病早期炎癥的敏感指標(biāo)，有助于診斷炎癥、評(píng)估其活性、監(jiān)控其活動(dòng)及治療。研究表明在病毒感染性急性期，SAA水平明顯升高，而CRP升高并不明顯，因此SAA是判斷病毒感染靈敏而可靠的指標(biāo)[1-3]。SAA和CRP聯(lián)合檢測(cè)有助于患者細(xì)菌感染和病毒感染的鑒別診斷。另外，SAA在診斷病毒感染、腎移植排斥反應(yīng)患者(特別是進(jìn)行免疫抑制治療的患者)以及用腎上腺皮質(zhì)激素治療的囊性纖維化患者方面比CRP更敏感[4-6]。

目前，已有許多方法應(yīng)用于血清SAA的檢測(cè)，包括放射性免疫檢測(cè)法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、免疫速率散射比濁法和微球捕獲酶免疫法等[7]。這些方法具有較好的敏感度和特異性，可用于自動(dòng)化分析。但是，目前通過中國食品藥品監(jiān)督管理局(CFDA)審批的SAA試劑盒只有西門子公司一家，難以滿足市場(chǎng)需求。為此，我們建立了乳膠增強(qiáng)散射免疫比濁法測(cè)定SAA的即時(shí)檢驗(yàn)(point-of-care testing，POCT)方法，并評(píng)價(jià)其各項(xiàng)性能指標(biāo)以及在臨床檢測(cè)應(yīng)用中的可行性。

材料和方法

一、材料

1. 試驗(yàn)材料SAA多抗購自丹麥Dako公司；SAA校準(zhǔn)品購自英國國家生物制品鑒定所(National Institute for Biological Standards and Control, NIBSC; NIBSC code:92/680)，使用時(shí)稀釋至相應(yīng)濃度；羧化聚苯乙烯乳膠微球由上海奧普生物醫(yī)藥有限公司通過乳液聚合方法制備。

2. 試劑和儀器西門子BNProspec特定蛋白分析儀及配套N Latex SAA試劑盒由德國西門子公司生產(chǎn)。F1多通道散射免疫濁度分析儀(簡(jiǎn)稱F1免疫分析儀，注冊(cè)號(hào)：滬食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2013第2400203號(hào))由上海奧普生物醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)。CP70ME超速離心機(jī)由日本日立公司生產(chǎn)。

3. 研究對(duì)象40例患者血清標(biāo)本來自上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院門診及住院患者。

二、POCT方法的建立

1. 羧化聚苯乙烯乳膠微球的合成根據(jù)文獻(xiàn)[8]的方法合成羧化聚苯乙烯乳膠微球。

2. SAA多抗與羧化聚苯乙烯微球的連接將1 mL 10%粒徑大小為80 nm的羧化聚苯乙烯微球用10 mL 0.1 mol/L 2-N-嗎啉代乙磺酸(MES)緩沖液(pH值6.0)稀釋，加入10 mg/mL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)溶液1 mL，活化15 min。加入10 mg/mL N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)溶液1 mL，室溫下反應(yīng)1 h，以64 400×g離心1 h，去上清，沉淀用0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS; pH值7.2)懸浮并超聲分散均勻。5 mg SAA多抗用0.05 mol/L PBS(pH值7.2)稀釋后加入到超聲分散好的羧化聚苯乙烯乳膠微球溶液中，室溫下反應(yīng)24 h，用封閉緩沖液[0.05 mol/L三羥甲基氨基甲烷(Tris，pH值8.0)、0.5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)]封閉1 h，64 400×g離心，用洗滌緩沖液[0.05 mol/L Tris溶液(pH值8.0)]洗滌2次，64 400×g離心，去上清，沉淀部分用30 mL恢復(fù)液[0.05 mol/L PBS(pH值7.2)]恢復(fù)，超聲分散均勻得到包被了SAA多抗的乳膠微球，即為試劑2。測(cè)定校準(zhǔn)品，根據(jù)測(cè)定值在儀器上的反應(yīng)性能，調(diào)整PEG6000的含量，配制成相應(yīng)的試劑1[除PEG含量調(diào)整外，其余配方為0.05 mol/L PBS(pH值7.2)]。

3. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定SAA高值血清分別稀釋到5、10、50、100、150、200和250 mg/L，每個(gè)濃度測(cè)定3次，取平均值與儀器檢測(cè)值做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

4. 操作步驟的確定在比色杯中預(yù)先分裝500 μL試劑1，加入5 μL測(cè)試樣品，然后加入85 μL試劑2，混勻，在5 s內(nèi)將比色杯插入F1免疫分析儀中，儀器自動(dòng)識(shí)別比色杯的插入并開始自動(dòng)檢測(cè)，每10 s測(cè)定一次散射值，取70 s和10 s散射值的差值與樣品濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

三、性能分析

3. 準(zhǔn)確度回收試驗(yàn)根據(jù)文獻(xiàn)[11]配制系列濃度回收血清樣品，每份樣品測(cè)定3次，結(jié)果取其平均值，計(jì)算回收率。

4. 干擾試驗(yàn)向正常人混合血清中加入不同濃度膽紅素(bilirubin，Bil)、甘油三酯(triglyceride，TG)、血紅蛋白(hemoglobin，Hb)，評(píng)價(jià)檢測(cè)方法抗黃疸、脂血、溶血干擾的能力。另外加入對(duì)比濁法試劑影響較大的類風(fēng)濕因子(rheumatoid factor，RF)，評(píng)價(jià)檢測(cè)方法對(duì)RF的抗干擾能力。Bil和TG為純品，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，使用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解后與正常人血清混合。RF和Hb樣品來自上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院住院患者，其RF和Hb濃度經(jīng)西門子BNProspec特定蛋白分析儀和配套試劑盒測(cè)定得到。

5. 對(duì)比試驗(yàn)將40例收集的臨床血清隨機(jī)分成5組，每天用本法和N Latex SAA試劑分別測(cè)定1組(8份)血清樣品，每份血清樣品測(cè)定2次，連續(xù)測(cè)定5 d，每種方法得到80個(gè)數(shù)據(jù)[12]。

6. 線性范圍測(cè)定按照CLSI EP6-P文件做線性評(píng)價(jià)。取一高濃度標(biāo)準(zhǔn)品(200 mg/L)和一低濃度標(biāo)準(zhǔn)品(5 mg/L)，然后把兩份樣品等體積混合產(chǎn)生中間濃度值的樣品，再分別將中間濃度值的樣品和高低濃度值的樣品混合，共產(chǎn)生了5個(gè)濃度值的樣品。在F1免疫分析儀上用本法對(duì)5個(gè)不同濃度的樣品分別平行測(cè)定5次，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，得到該檢測(cè)方法的線性范圍。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 10.0和Microsoft Excel 2007軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用配對(duì)t檢驗(yàn)對(duì)兩種方法的SAA結(jié)果做回歸和相關(guān)性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、方法檢測(cè)參數(shù)

1. 基本特性由于在F1免疫分析儀中的檢測(cè)時(shí)間只有70 s，加上加入樣品和試劑2的時(shí)間，單個(gè)樣品的檢測(cè)時(shí)間總共不超過3 min。

2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為一元二次方程Y=-0.251X2+126.7X+87.89，R2=0.998，見圖1。該曲線為SAA濃度為0～250 mg/L時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)曲線；當(dāng)樣品SAA>250 mg/L時(shí)，需將樣品稀釋后再測(cè)。

圖1　SAA標(biāo)準(zhǔn)曲線

二、檢測(cè)方法的分析性能

1. 分析靈敏度零參考標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定10次的平均值加上2倍的標(biāo)準(zhǔn)差所得值為530.76，將其作為Y值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，得X值為3.52。所以本法的分析靈敏度為3.52 mg/L。

2. 精密度批內(nèi)精密度和日間精密度結(jié)果見表1。

3.回收試驗(yàn)本法的回收率為93.21%。

4.干擾試驗(yàn)Bil≤400 μmol/L、Hb≤4.0 g/L、TG≤10 mmol/L、RF≤1 621 U/L對(duì)本法測(cè)定SAA無影響。見表2。

表1　批內(nèi)和日間精密度結(jié)果

表2　本法測(cè)定SAA的干擾試驗(yàn)結(jié)果

5. 對(duì)比試驗(yàn)方法學(xué)比對(duì)結(jié)果顯示本法和N Latex SAA試劑測(cè)定40例患者SAA的檢測(cè)值主要落在5.12～185.67 mg/L之間。兩種方法的相關(guān)系數(shù)(r)=0.998 3，P>0.05，見圖2。對(duì)兩種方法的測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行Bland-Altman分析，結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，有10%(4/40)的點(diǎn)在95%一致性界限以外；在一致性界限以內(nèi)，兩種方法差值的最大值為9.21 mg/L，兩種方法測(cè)定結(jié)果的平均值為50.81 mg/L。這種相差的幅度在臨床上可以接受。因此兩種方法測(cè)定的結(jié)果具有一致性，在臨床上可以互相替代使用。

圖2　本方法測(cè)定值與N Latex SAA試劑盒測(cè)定SAA比較

圖3　兩種方法SAA測(cè)定值的Bland-Altman圖

6. 線性范圍本法線性范圍為5～200 mg/L，其回歸方程的截距和斜率分別為a=1.022 8、b=0.032 6，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖4。

圖4　本法線性范圍

討論

目前在國內(nèi)已注冊(cè)的SAA試劑盒很少，限制了SAA在臨床上的應(yīng)用。本研究建立的SAA POCT測(cè)定方法是通過將SAA多抗共價(jià)包被到羧化聚苯乙烯乳膠微球的表面，并優(yōu)化配方制備得到了穩(wěn)定的免疫乳膠試劑，與F1免疫分析儀配套使用，可在3 min內(nèi)給出SAA的定量結(jié)果，且只需要5 μL血清，是一種快速測(cè)定SAA的POCT方法，可滿足醫(yī)院快速檢測(cè)SAA的需要。

為了評(píng)價(jià)本法測(cè)定SAA的效果，本研究對(duì)方法的分析靈敏度、重復(fù)性試驗(yàn)、回收試驗(yàn)、干擾試驗(yàn)和線性范圍進(jìn)行了分析。本法的分析靈敏度為3.52 mg/L，可滿足臨床檢測(cè)的需要；批內(nèi)、天間CV均<10%，符合POCT體外診斷試劑CV須<15%方可用于臨床患者樣品檢測(cè)[10]的要求；本法的抗干擾能力較強(qiáng)，RF含量高達(dá)1 621 U/L對(duì)檢測(cè)也無影響；線性范圍為5～200 mg/L，在這個(gè)區(qū)間內(nèi)可以真實(shí)地反映患者SAA的水平。對(duì)比試驗(yàn)顯示本法和N Latex SAA試劑在5.12～185.67 mg/L范圍內(nèi)相關(guān)性較好，兩種方法之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

綜上所述，本研究建立的SAA檢測(cè)方法的各項(xiàng)分析性能指標(biāo)符合相關(guān)要求，具有簡(jiǎn)單、快速的優(yōu)點(diǎn)，可滿足臨床日常檢測(cè)的需求。

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(本文編輯：龔曉霖)