高效液相色譜法同時測定霉酚酸酯及霉酚酸的血藥濃度

朱順海1*趙夢蕓2陳佳2許志良1**

（1.浙江中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院 杭州 310053；2.中科（杭州）生命科學院有限公司 杭州 310052)

摘 要目的：建立高效液相色譜法同時測定人體血漿中霉酚酸酯及霉酚酸的藥物濃度。方法：血漿樣品經乙腈沉淀蛋白后直接進樣，采用Zorbax SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 mm）的色譜柱，流動相為0.3%的三乙胺水溶液（用磷酸調節(jié)pH 5.3）-乙腈（50∶50）。檢測波長為215 nm，柱溫 35 ℃，流速 1.0 ml/min。結果：本方法測定的線性范圍為0.25 ~20 mg/ml，r(霉酚酸)=0.999 76，r(霉酚酸酯)=0.999 99。霉酚酸和霉酚酸酯的加標回收率分別為（87.38±2.97）%和（99.71±1.18）%，最低檢出限分別為0.035 mg/ml和0.070 mg/ml（S/N=3）。結論：本方法簡單，靈敏，重現(xiàn)性好，適合器官移植等患者霉酚酸及霉酚酸酯的血藥濃度監(jiān)測，以及霉酚酸酯的藥代動力學研究。

關鍵詞霉酚酸酯 霉酚酸 血藥濃度 高效液相色譜法 藥代動力學

Simultaneous determination of the concentration of mycophenolate mofetil and mycophenolic acid in plasma by HPLC

ZHU Shunhai1*, XU Zhiliang1, ZHAO Mengyun2, CHEN Jia2**

(1.Basic Medical College, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China; 2. Zhongke (Hangzhou) Life Sciences Co. Ltd., Hangzhou 310052, China)

ABSTRACTObjective: To establish an HPLC method for simultaneous determination of the concentrations of mycophenolate mofetil and mycophenolic acid in human plasma. Methods: The plasma sample was analyzed by HPLC on a Zorbax SB-C18column (4.6 mm×250 mm，5 mm) with 0.3% aqueous triethylamine - acetonitrile (50:50) as a mobile phase at the detection wavelength of 215 nm, column temperature of 35 ℃ and flow velocity of 1.0 ml/min after the proteins were precipitated out by acetonitrile. Results: The standard curve was linear over the range of 0.25 ~10 mg/ml with r(MPA)=0.999 76, r(MMF)=0.999 99. The recoveries of MPA and MMF were （87.38±2.97）% and（99.71±1.18）% and the limit of detection for MPA and MMF were 0.035 mg/ml and 0.070 mg/ml（S/N=3）. Conclusion: This method is simple, sensitive, reproducible, and suitable for the monitoring of the concentrations of mycophenolic acid and mycophenolate mofetil in patients with organ transplantation and the pharmacokinetic study of mycophenolate mofetil.

KEY WORDSmycophenolate mofetil; mycophenolic acid; blood concentration; HPLC; pharmacokinetics

霉酚酸酯(又稱麥考酚酸酯，mycophenolate mofetil，MMF)，商品名為驍悉（Cellcept），是霉酚酸(Mycophenolic acid， MPA)的嗎啉代乙酯。1995年5月霉酚酸酯獲得美國食品藥品管理局(FDA)認可，用于預防腎移植急性排斥反應，并在以后的應用中取得了較好效果。1998年10月該藥成為美國正式批準上市的具有免疫抑制作用的藥物[1]。作為免疫抑制劑，霉酚酸酯已廣泛應用于預防腎臟等實體器官移植的急性排斥反應[2]。MMF在體內代謝為活性代謝物MPA而發(fā)揮作用，MPA主要通過非競爭性、可逆性抑制嘌呤從頭合成途徑的限速酶次黃嘌呤單核苷酸脫氫酶（IMPDH），強烈抑制T、B淋巴細胞增殖而發(fā)揮免疫抑制作用[3-4]。國內臨床上應用常規(guī)劑量（1～2 g/d）獲得理想效果，但由于MMF的個體間差異普遍存在，所以常規(guī)劑量可能會帶來個體間療效差異和不良反應的出現(xiàn)?？赏ㄟ^監(jiān)測MMF和MPA的血藥濃度，制定個體化給藥方案，達到最佳療效

及最低不良反應。目前針對MPA的血藥濃度含量檢測也比較多見，國內外報道的主要有高效液相色譜法（HPLC）和酶放大免疫分析技術（EMIT）兩種方法。EMIT特異性不如HPLC，因為葡萄糖苷酸代謝產物AcMPAG與MPA有交叉反應， 因此， EMIT法測出的MPA濃度偏高，而HPLC 可單獨測MPA 濃度，不受AcMPAG的影響[5]。所以目前用的最多的是HPLC法[6-9]，但是同時對MMF 和MPA進行血藥濃度測定不多。本文旨在建立HPLC法同時測定血漿中霉酚酸酯和霉酚酸的血藥濃度，其操作簡單，分析速度快，有望適于臨床上開展MMF和MPA的血藥濃度監(jiān)測，實現(xiàn)患者個體化給藥的目標。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀，配紫外可見波長檢測器（安捷倫科技有限公司），Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司），德國IKAVortex 3渦旋混合器（廣州意測儀器有限公司），貝克曼Allegra 64 R高速冷凍臺式離心機（美國貝克曼庫爾特有限公司）。

1.2 試劑

霉酚酸酯及霉酚酸對照品（Sigma，含量：≥98%，上海純優(yōu)生物科技有限公司）；甲醇和乙腈均為色譜純（南京榮華科學器材有限公司）；三乙胺（杭州蕭山創(chuàng)益化工儀器有限公司）與磷酸（杭州永星五交化有限公司）均為分析純。

2 實驗方法與結果

2.1 色譜條件

Zorbax SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 mm），流動相：0.3%的三乙胺水溶液（用磷酸調節(jié)pH至5.3）-乙腈（50∶50），流速：1.0 ml/min，柱溫：35 ℃，檢測波長：215 nm，進樣量10 ml。

2.2 標準溶液配制

2.2.1 標準儲備液

分別精密稱取霉酚酸及霉酚酸酯對照品10.0 mg于10 ml容量瓶中，用甲醇溶解并定量至刻度，使它們質量濃度都為1.00 mg/ml的標準儲備液，4 ℃冷藏保存。

2.2.2 標準工作液

分別精確吸取200 ml的霉酚酸和霉酚酸酯標準儲備液，置于10 ml的容量瓶中，用甲醇定容至刻度，使之濃度為20.00 mg/ml的混合標準溶液。繼而用甲醇稀釋成濃度分別為0.25、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00及20.00 mg/ml的混合標準工作液。分別進樣10 ml，并記錄色譜圖，繪制標準曲線。

2.3 線性范圍

在“2.1”色譜條件下，將“2.2.2”配制的標準工作液分別從低濃度到高濃度進樣，以所得峰面積對相對應的標準工作液濃度（mg/ml）作標準曲線。實驗測得霉酚酸和霉酚酸酯在0.25 ~20.00 mg/ml的濃度范圍內，其線性回歸方程分別為C=88.102 36A-8.368 51 （r=0.999 76）；C=58.397 29A+5.319 83（r=0.999 99）。表明其線性均良好。

2.4 樣品處理

取200 ml血漿樣品于1.5 ml Eppendorf管中，加乙腈800 ml，渦旋振蕩2 min，15 000 r/ min離心10 min，取上清液10 ml進樣分析。記錄色譜圖，從標準曲線上查得霉酚酸及霉酚酸酯的濃度。

2.5 色譜圖

在2.1項色譜條件下，霉酚酸和霉酚酸酯分別在4.5 min和8.5 min左右出峰，血漿中其他雜質基本在4 min內洗脫下來。對照品、空白血漿樣品和加標血漿樣品以及患者口服1.0 g驍悉膠囊0.5 h后的血漿樣品色譜峰見圖1。

2.6 精密度實驗

為了考察方法的精密度，精密吸取對照品儲備液適量，分別用空白血漿稀釋配制成含MPA和MMF 0.25、10.00及20.00 mg/ml血漿溶液，按2.4項方法處理，在2.1項色譜條件下，獲得色譜圖，外標法讀取MPA和MMF的濃度。在同一天內和不同天內（n=5）分別考察方法的精密度和重復性。結果顯示均符合體內血藥濃度分析要求（RSD%≤10%，表1）。

圖1 霉酚酸和霉酚酸酯的色譜圖

表1 MPA、MMF血藥濃度測定的精密度（n=5）

2.7 回收率實驗

按2.6項同法操作，測定加標回收率（每個濃度平行測得5次），以考察方法的準確度。以測得的量與加入量之比作為回收率的值。結果見表2。

表2 MPA、MMF血藥濃度測定的回收率（n=5）

2.8 方法檢出限

選取空白血清，添加MPA、MMF混和標準溶液，使得添加濃度依次為0.025、0.035、0.050、0.070 和0.10 mg/ml，按2.6項同法操作，以考察方法檢出限。我們以S/N=3計，得到霉酚酸和霉酚酸酯在本方法中的檢出限分別為0.035 mg/ml和0.070 mg/ml。

2.9 穩(wěn)定性實驗

精密吸取混合標準溶液適量，用空白血漿稀釋成濃度為5.0 mg/ml的模擬血漿樣品4份，均在室溫保存，分別于0、2、24和48 h按2.4項下方法處理樣品，在2.1項色譜條件下進樣分析。計算每個時間點的回收率（表3）。參照2010版藥典規(guī)定，如相對回收率在80%～120%范圍內，即認為樣品沒有明顯差異。結果顯示室溫對MPA及MMF血藥濃度沒有明顯影響，在48 h內穩(wěn)定。

表3 血樣在室溫下放置不同時間對MPA、MMF的回收率影響

2.10 血樣數據

腎臟移植患者口服1.0 g驍悉膠囊后，分別于0、0.5、1、2和6 h采集血樣，分離出血漿，HPLC分析結果顯示他們血漿內的MMF濃度均為0，可見MMF體內吸收迅速（表4）。

表4 腎臟移植患者口服MMF后MPA的血藥濃度（mg/ml）監(jiān)測

3 討論

pH對MMF和MPA峰型影響很大，可能是由于酚

羥基及羧基與色譜柱的硅醇基結合較緊密，導致峰型不好和拖尾現(xiàn)象，因此合理的pH至關重要。我們經過多次實驗發(fā)現(xiàn)當0.3%的三乙胺水溶液的pH用磷酸調到5.3左右時，峰型較對稱。乙腈-0.3%的三乙胺水溶液為50∶50時，MPA和MMF可以很好地分離，且不受內源性藥物的影響。

本方法采用乙腈沉淀蛋白方法處理血漿樣品，快速、簡單，MMF和MPA在10 min之前均能出峰且回收率和重現(xiàn)性好，非常適合臨床上患者服用MMF后的血藥濃度監(jiān)測及藥物代謝動力學研究。

口服霉酚酸酯后，體內迅速吸收，在血漿酯酶作用下變成具有生物活性的霉酚酸。本文研究表明腎臟移植患者口服霉酚酸酯膠囊（1.0 g）0.5 h后幾乎檢測不到MMF，但這并不意味著檢測MMF的血藥濃度毫無意義。因為，一方面，檢不出MMF的含量就說明了患者體內有足夠或相當量活性的血漿酯酶；另一方面，血漿酯酶存在個體差異，在血漿酯酶活性極低的患者，可能能夠檢出MMF[9]，對這類患者，同時檢測MMF和MPA的血藥濃度有重要的臨床意義。

有文獻研究報道，MMF 的個體間藥代動力學差異較大， 在器官移植兩周后，服用1 g劑量的霉酚酸酯膠囊，不同患者間Co最大可相差21.4倍（0.32～6.86 mg/L），AUC 0-12 h最大可相差9.3倍（10.60～98.73 mg/L）[10]，即使同一個患者，在移植后數周內的MPAAUC可升高30%~50%[11]。主要是可能受到移植腎功能、并發(fā)癥和聯(lián)合用藥等眾多因素的影響，造成患者服用同樣劑量，但不良反應卻有顯著差異。因此，監(jiān)測MMF 和MPA的血藥濃度，有助于了解個體MMF的藥代動力學，有望實現(xiàn)個性化給藥。

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收稿日期：（2014-11-11）

通訊作者：**許志良（1966-），男，副教授，碩士生導師，從事系統(tǒng)生物學的現(xiàn)代化研究。E-mail: xzl8811@163.com

作者簡介：*朱順海（1988-），男，碩士研究生。E-mail: zsh261908@126.com

文章編號：1006-1533(2015)07-0077-04

文獻標識碼：A

中圖分類號：O657.72; R979.5