陳宏文， 謝桂貞, 李晨， 楊春發(fā)

(華僑大學(xué) 化工學(xué)院， 福建 廈門 361021)

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CSLF法提取蔗渣半纖維素工藝條件的響應(yīng)面優(yōu)化

陳宏文， 謝桂貞, 李晨， 楊春發(fā)

(華僑大學(xué) 化工學(xué)院， 福建 廈門 361021)

摘要：利用中心組合設(shè)計(jì)法(CCD),對(duì)蔗渣半纖維素的纖維素溶劑的木質(zhì)纖維素組分分離(CSLF法)進(jìn)行優(yōu)化.在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定磷酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)、磷酸蔗渣液固比和水浴溫度是影響蔗渣半纖維素提取的3個(gè)關(guān)鍵因素.以半纖維素提取率為響應(yīng)目標(biāo)，采用CCD和響應(yīng)面分析法(RSM)，確定CSLF法半纖維素的最佳提取工藝：磷酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為83%，磷酸蔗渣液固比為8.95 mL·g-1和水浴溫度為48.94 ℃.結(jié)果表明：蔗渣半纖維素提取率可達(dá)到75.29%，比優(yōu)化前提高9%.

關(guān)鍵詞：蔗渣； 半纖維素； CSLF法； 中心組合設(shè)計(jì)法； 響應(yīng)面分析法

木質(zhì)纖維素由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成.其中,質(zhì)量分?jǐn)?shù)占25%～40%的半纖維素是自然界中豐富的可再生纖維資源.半纖維素已被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，如黏合劑、增稠劑、穩(wěn)定劑、水凝膠、食用纖維、乳化劑、濕強(qiáng)劑、食品級(jí)酶制劑和低聚木糖等[1]；同時(shí)，半纖維素水解物木糖能夠生產(chǎn)燃料乙醇、生物氫和糖醇等[2-3].在常壓，50 ℃下,基于纖維素溶劑的木質(zhì)纖維素組分分離(cellulose solvent-based lignocellulose fractionation,CSLF)[4]避免了半纖維素糖降解，減少了發(fā)酵抑制物的生成和成本的投入，其反應(yīng)介質(zhì)是非揮發(fā)性及揮發(fā)性的丙酮或乙醇，易于試劑回收.CSLF纖維素糖化率高，對(duì)農(nóng)作物和木材等具有良好預(yù)處理效果[5-8].影響CSLF預(yù)處理效果的參數(shù)主要包括：磷酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)、處理溫度和處理時(shí)間.許多頑固性原料，如玉米秸稈、柳枝稷和楊樹通過對(duì)這3個(gè)參數(shù)優(yōu)化可獲得較高的纖維素糖化產(chǎn)率或生物乙醇轉(zhuǎn)化率[4,8-9].利用CSLF對(duì)蘆葦進(jìn)行優(yōu)化，纖維素固體中卻殘留了大量的木聚糖[10]，幾乎與水提取液中的木聚糖量相近，造成較低的半纖維素利用率，及較高的微生物雙糖利用能力.即使采用工程菌，糖利用效率仍是關(guān)鍵問題，且下游復(fù)雜的產(chǎn)品分離也會(huì)大大提高生產(chǎn)成本.甘蔗是我國制糖的主要原料，其廢料甘蔗渣中含豐富的半纖維素，質(zhì)量比高達(dá)31.8%～35%[11-12].為了進(jìn)一步提高CSLF法半纖維素提取率，本文以蔗渣為原料，通過中心組合設(shè)計(jì)(central composite design,CCD)和響應(yīng)面分析法(fesponse surface method,RSM)對(duì)蔗渣半纖維素的CSLF法提取工藝進(jìn)行優(yōu)化.

1材料與方法

1.1　材料及儀器

1) 材料.蔗渣(用水沖洗，去除殘留的蔗糖，置于60 ℃烘箱中干燥96 h，將干燥的蔗渣用中藥粉碎機(jī)粉碎，篩取40～60目蔗渣粉備用)；硫酸、丙酮、磷酸(上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；D-木糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖、D-葡萄糖(上海BioChemika有限公司)；實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水.2) 儀器設(shè)備.Agilent 1100型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；Shodex型糖類色譜柱(日本島津公司)；Sigma 4K15型高速冷凍離心機(jī)(德國Sigma公司).

1.2　蔗渣單糖成分的測(cè)定

用色譜法測(cè)定蔗渣中單糖組分[13]，色譜條件如下：Shodex型糖類色譜柱；乙腈流動(dòng)相為 80%；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為60 ℃；示差折光檢測(cè)器RID，進(jìn)樣量為20 μL；4個(gè)平行.單糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為

式中:Wx為樣品各種單糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)；Vx為水解液體積(L)；Cx為樣品中液相色譜測(cè)定的單糖質(zhì)量濃度(g·L-1)；0.3為蔗渣粉質(zhì)量(g)；Ca，x為混合糖溶液未酸解前的已知某單糖質(zhì)量濃度(g·L-1)；Cb，x為混合糖溶液酸解后測(cè)定的某單糖質(zhì)量濃度(g·L-1).

1.3　半纖維素的提取和測(cè)定

CSLF法提取半纖維素流程圖(未優(yōu)化前數(shù)據(jù)),如圖1所示.

圖1基于CSLF法提取蔗渣半纖維素流程圖

Fig.1Scheme for fractional isolation of hemicellulose from sugarcane bagasse using the CSLF method

通過CSLF獲得半纖維素，通過高效液相色譜(HPLC)分析獲取水提液中木糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)，進(jìn)而得到木聚糖的提取率，即半纖維素提取率.采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%硫酸，在121 ℃下，高壓酸解半纖維素水溶液1 h，可以完全水解木聚糖，且木糖降解率大大降低[14].用Shodex SUGER SZ5532柱檢測(cè)木糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)，同節(jié)1.2的3個(gè)平行，半纖維素提率為

式中：Rx為半纖維素提取率(%)；Cx為半纖維素水提液稀酸水解后的木糖質(zhì)量濃度(g·L-1)；V為半纖維素水提液的體積(L)；m為蔗渣粉質(zhì)量(g).

1.4　響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)CCD中心組合設(shè)計(jì)原理[15]，利用單因素試驗(yàn)，在磷酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為83%、磷酸蔗渣液固比為9 mL·g-1和水浴溫度為50 ℃的條件下，半纖維素提取率分別出現(xiàn)峰值.因此，以磷酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)(X1)、磷酸蔗渣液固比(X2)和水浴溫度(X3)確定磷酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)、磷酸蔗渣液固比和水浴溫度是影響蔗渣半纖維素提取的3個(gè)關(guān)鍵因素.3個(gè)因素為自變量，以半纖維素Rx為響應(yīng)值，作3因素5水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，響應(yīng)面因素水平設(shè)計(jì)表、試驗(yàn)設(shè)計(jì)安排，如表1所示.表1中：w為磷酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；ρ為磷酸蔗渣液固比；θ為水域溫度.共20個(gè)試驗(yàn).

表1　水平設(shè)計(jì)表

2結(jié)果與分析

2.1　蔗渣單糖成分分析

葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為39.11%,木糖為22.03%,阿拉伯糖為5.55%,半乳糖為2.10%.

2.2　CSLF法提取蔗渣半纖維素工藝條件的優(yōu)化

以磷酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)、磷酸蔗渣液固比和水浴溫度為參數(shù)，根據(jù)CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以半纖維素提取率為響應(yīng)值，得到的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如表2所示.表2中：Rx，exp為預(yù)測(cè)值；Rx，p為實(shí)驗(yàn)值.響應(yīng)面全模型方差分析，如表3所示.

表2　初始工藝條件的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3　響應(yīng)面模型方差分析

采用Design Expert 7.0軟件進(jìn)行多元回歸擬合，獲得二次多項(xiàng)式回歸模型方程，即

Y=72.88+0.50X1-0.85X2-1.67X3-0.34X1X2-

式中：Y為半纖維素提取率；X1，X2和X3分別為磷酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)、磷酸蔗渣液固比和水浴溫度的編碼值；常數(shù)項(xiàng)72.88表明半纖維素的平均提取率在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi)處于較高的水平；線性系數(shù)有正有負(fù)，而所有的二次項(xiàng)系數(shù)和交叉項(xiàng)均為負(fù)值.

模型的響應(yīng)預(yù)測(cè)值和實(shí)驗(yàn)值的相關(guān)性，如圖2所示.由圖2可知：模型預(yù)測(cè)值和實(shí)驗(yàn)值之間的相對(duì)誤差都小于0.8%，模型的邊際效應(yīng)非常?。豁憫?yīng)的預(yù)測(cè)值和實(shí)驗(yàn)值之間的相關(guān)系數(shù)接近1，表明模型回歸是顯著的，與實(shí)際相符合.

圖2　預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值的相關(guān)性Fig.2　Correlation of the predicted and the actual

二次模型的決定系數(shù)R2=0.986 6，說明提取率變化有98.66%來源于磷酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，磷酸蔗渣液固比和提取溫度3個(gè)因素，該模型能夠反映模型中所選變量的真實(shí)關(guān)系.adjR2=0.971 5，predR2=0.912 2兩者較為接近，說明該模型的擬合顯著性.變異系數(shù)CV=0.9，較低說明實(shí)驗(yàn)操作可信度高.Adeq presision=29.808 4，說明模型信號(hào)夠強(qiáng)，可以用于指導(dǎo)試驗(yàn).由以上分析可知，該回歸方程可以較好地描述各因素和響應(yīng)值(提取率)之間的真實(shí)關(guān)系，可以利用該回歸方程確定最佳提取條件.

2.3　響應(yīng)面分析

磷酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)和磷酸蔗渣液固比(溫度為50 ℃)、溫度和磷酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)(磷酸蔗渣液固比為9 mL·g-1時(shí))、磷酸蔗渣液固比和溫度(磷酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為83%時(shí))對(duì)半纖維素提取率影響的響應(yīng)曲面圖和等高線圖分別如圖3～5所示.圖3～5中：R代表半纖維素提取率；ρ代表磷酸蔗渣液固比；w代表磷酸質(zhì)量分?jǐn)?shù).響應(yīng)面圖可以直接反映出各因子對(duì)響應(yīng)值的影響大小，響應(yīng)面曲線越陡，說明因子對(duì)半纖維素提取率的影響越顯著.等高線的形狀反映交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，圓形表示兩個(gè)因素交互作用不顯著，而橢圓形則表示兩因素的交互作用顯著.圖3等高線呈圓形，而圖4，5等高線則是呈現(xiàn)橢圓形，即磷酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)和磷酸蔗渣液固比交互作用不顯著，而磷酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)和溫度、磷酸蔗渣液固比和溫度之間的交互作用顯著，這與表3全模型方差分析結(jié)果相同.

(a) 響應(yīng)曲面圖 (b) 等高線圖圖3　磷酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)和磷酸蔗渣液固比對(duì)提取率影響Fig.3　Effect of H3PO4 concentration and ratio of H3PO4 to sugarcane bagasse on extraction rate

(a) 響應(yīng)曲面圖 (b) 等高線圖圖4　溫度和磷酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)提取率影響Fig.4　Effect of temperature and H3PO4 concentration on extraction rate

(a) 響應(yīng)曲面圖 (b) 等高線圖圖5　磷酸蔗渣液固比和溫度對(duì)提取率影響Fig.5　Effect of ratio of H3PO4 to sugarcane bagasse and temperature on extraction rate

響應(yīng)面通過回歸方程預(yù)測(cè)時(shí),一般不能超過自變量的取值范圍，故在磷酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)、磷酸蔗渣液固比和水浴溫度3個(gè)因素的取值范圍內(nèi),通過Design Expert 7.0 軟件得到優(yōu)化提取工藝：磷酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為83%，磷酸蔗渣液固比為8.95 mL·g-1，水浴溫度為48.94 ℃，理論值半纖維素提取率為73.37%.

優(yōu)化后的提取條件如下：1 g蔗渣粉中按照8.95 mL·g-1加入83% 的濃磷酸攪勻，在48.94 ℃，150 r·min-1水浴振蕩40 min；再用丙酮、蒸餾水離心洗滌沉淀4次，得到半纖維素水提液；最后,用4倍無水乙醇醇沉獲得半纖維素，共進(jìn)行了6次重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，并取平均值.實(shí)驗(yàn)結(jié)果半纖維素提取率為75.29%，與Design Expert 7.0計(jì)算得到的理論值73.37%相近.

優(yōu)化前，按照磷酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為83%，磷酸蔗渣液固比為9 mL·g-1和水浴溫度為50 ℃的預(yù)處理，半纖維素的提取率為69.30%.通過響應(yīng)面優(yōu)化，半纖維素提取率為75.29%，比優(yōu)化前提高了9%.在上述優(yōu)化條件下，凍干后，1.000 g蔗渣可以提取得到干燥的0.239 g的半纖維素，0.396 g的纖維素.

3結(jié)束語

CSLF是近年來開發(fā)的一種溫和條件下的木質(zhì)纖維素預(yù)處理方法，應(yīng)用響應(yīng)面法，優(yōu)化CSLF，提取蔗渣半纖維素的工藝條件如下：磷酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為83%，磷酸蔗渣液固比為8.95 mL·g-1和水浴溫度為48.94 ℃，蔗渣半纖維素提取率為75.29%，比優(yōu)化前提高了9%.實(shí)驗(yàn)證明：液固比也是影響CSLF預(yù)處理的關(guān)鍵因素.對(duì)乙醇醇沉半纖維素后的上清液進(jìn)行HPLC檢測(cè)，結(jié)果顯示：上清液中沒有木糖、葡萄糖、阿拉伯糖等單糖及其副產(chǎn)物，表明通過優(yōu)化不僅提高了蔗渣半纖維素的提取率，而且減少了半纖維糖的水解，有助于避免發(fā)酵抑制物的生成；CSLF預(yù)處理獲得的無定形纖維素、半纖維素可進(jìn)一步作為生物煉制的原料.

參考文獻(xiàn)：

[1]張盆,胡惠仁,石淑蘭.半纖維素的應(yīng)用[J].天津造紙,2006(2):16-18.

[2]GIRIO F M,FONSECA C,CARVALHEIRO F,et al.Hemicelluloses for fuel ethanol: A review[J].Bioresource Technology,2010,101(13)：4775-4800.

[3]GIRIO F M,CARVALHERIO F,DUARTE L C,et al.D-xylitol[M].Heidelberg:Springer-Verlag,2012：3-37.

[4]ZHANG Yiheng,DING Shiyou,MIELENZ J R,et al.Fractionating recalcitrant lignocellulose at modest reaction conditions[J].Biotechnology and Bioengineering,2007,97(2):214-223.

[5]SATHITSUKSANOH N,GEORGE A,ZHANG Yiheng.Cellulose solvent- and organic solvent-based lignocellulose fractionation enabled efficient sugar release from a variety of lignocellulosic feedstocks[J].Bioresource Technology,2012,117:228-233.

[6]SATHITSUKSANOH N,ZHU Zhiguang,ZHANG Yiheng.Cellulose solvent-based pretreatment for corn stover and avicel:concentrated phosphoric acid versus ionic liquid [BMIM]Cl[J].Cellulose,2012,19(4):1161-1172.

[7]SATHITSUKSANOH N,GEORGE A,ZHANG Yiheng.New lignocellulose pretreatments by using cellulose solvents: A review[J].Chem Eng Biotechnol,2013,88(2):169-180.

[8]SATHITSUKSANOH N,XU Bin,ZHAO Bingyu,et al.Overcoming biomass recalcitrance by combining genetically modified switchgrass and cellulose solvent-based lignocellulose pretreatment[J].Cellulose Solvent Pretreated Transgenic Plants,2013,8(9):e73523.

[9]ZHU Zhiguang,SATHITSUKSANOH N,VINZANT T,et al.Comparative study of corn stover pretreated by dilute acid and cellulose solvent-based lignocellulose fractionation: Enzymatic hydrolysis, supramolecular structure, and substrate accessibility[J].Bioengineering and Biotechnology,2009,103(4):715-724.

[10]SATHITSUKSANOH N,ZHU ZhiGuang,TEMPLETON N,et al.Saccharification of a potential bioenergy crop, phragmites australis (common reed), by lignocellulose fractionation followed by enzymatic hydrolysis at decreased cellulase loadings[J].Industrial and Engineering Chemistry Research,2009,48(13):6441-6447.

[11]GE Xumeng,BURNER D M,XU Jianfeng,et al.Bioethanol production from dedicated energy crops and residues in arkansas, USA[J].Biotechnology Journal,2011,6(1):66-73.

[12]SUN Jinxia,SUN Xiaofeng,SUN Runcang,et al.Fractional extraction and structural characterization of sugarcane bagasse hemicelluloses[J].Carbohydrate Polymers,2004,56(2):195-204.

[13]彭云云,武書彬,程江娜,等.離子色譜法測(cè)定蔗渣半纖維素中的單糖及糖醛酸含量[J].造紙科學(xué)與技術(shù),2009,28(5):10-12.

[14]MOXLEY G,ZHANG Yiheng.More accurate determination of acid-labile carbohydrates in lignocellulose by modified quantitative saccharification[J].Energy,2007,21(6):3684-3688.

[15]BEZERRA M A,SANTELLI R E,OLIVEIRA E P,et al.Response surface methodology (RSM) as a tool for optimization in analytical chemistry[J].Talanta,2008,76(5):965-977.

(責(zé)任編輯： 陳志賢英文審校： 劉源崗)

Optimization of Sugarcane Bagasse Hemicelluloses Extraction by

the Cellulose Solvent-Based Lignocellulose Fractionation

Using Response Surface Methodology

CHEN Hongwen, XIE Guizhen, LI Chen, YANG Chunfa

(College of Chemical Engineering, Huaqiao University, Xiamen 361021, China)

Abstract：In this study, the central composition design (CCD) was applied to optimize the cellulose solvent-based lignocelluloses fractionation (CSLF) extraction conditions of the sugarcane bagasse hemicelluloses. The single factor test results showed that the H3PO4concentration, the ratio of H3PO4to sugarcane bagasse, and the temperature were the main affecting factors. With hemicelluloses extraction rate as the target response, the optimal extraction conditions were determined by CCD and response surface method (RSM). The optimal extraction conditions were 83% H3PO4concentration, 8.95 mL·g-1ratio of H3PO4to sugarcane bagasse and 48.94 ℃ with sugarcane bagasse hemicelluloses extraction efficiency reaching up to 75.29%, which was 9% higher than that of the initial.

Keywords：sugarcane bagasse; hemicellulose; cellulose solvent-based lignocellulose fractionation; central composite design； response surface method

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21476093)； 福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2013J01049)； 華僑大學(xué)科研基金資助項(xiàng)目(12BS132)

通信作者：陳宏文(1969-)，女，副教授，博士，主要從事微生物代謝工程和生物煉制的研究.E-mail:chenhw@hqu.edu.cn.

收稿日期：2015-06-12

中圖分類號(hào)：TQ 914.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

doi:10.11830/ISSN.1000-5013.2016.01.0103

文章編號(hào)：1000-5013(2016)01-0103-06