丁曼 盧祖能

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Creutzfeldt-Jakob病非侵入性診斷方法研究新進展

丁曼 盧祖能

朊病毒是一種非常規(guī)意義上的傳染性病原體，常導致致命性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其中以Creutzfeldt-Jakob病(CJD)最為常見。CJD屬于一種罕見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床進展迅速，致死性達100%。此疾病有多種類型，其中以散發(fā)型最為常見。目前此病的最大挑戰(zhàn)即臨床診斷。到目前為止臨床確診的金標準仍為腦組織活檢，但將其作為診斷金標準仍存在一定局限性。隨著研究的逐步進展，亟需探討新的非侵入性的檢測(手段)，以利于疾病診斷。本文就有關CJD生物標記物檢測、基因篩查、影像學檢查及電生理檢查等非侵入性手段的研究進展進行綜述，旨在協(xié)助CJD的診斷，為CJD的確診提供新的思路。

朊病毒??；克-雅綜合征；PrPSc；PRNP

朊蛋白病(prion diseases)又稱傳染性海綿狀腦病(transmissible spongiform encephalopathy)，是一類由朊蛋白(prion protein，PrP)感染引起的進行性致死性中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。人類朊蛋白病主要包括克-雅病(Creutzfeldt-Jakob disease，CJD)、庫魯病(Kuru disease)、格斯特曼綜合征(Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome)及家族性致死性失眠(fatal familial insomnia，F(xiàn)FI)等，以CJD最為常見。CJD屬于一種進行性神經(jīng)系統(tǒng)退行性變疾病，潛伏期從數(shù)個月至數(shù)年不等，疾病進展迅速。大多數(shù)CJD患者在出現(xiàn)臨床癥狀后才被確診，一般于診斷后1年內(nèi)死亡。根據(jù)起病方式不同，CJD主要分為4種類型：散發(fā)性CJD(sporadic CJD，sCJD)、家族性遺傳型CJD(familiar CJD，fCJD)、醫(yī)源性CJD(itrogenic CJD，iCJD)和變異型CJD(variant CJD，vCJD)[1]。其中sCJD最多見，占CJD總發(fā)病人數(shù)的85%～90%，每年大約(1～1.5)/百萬人感染；fCJD占CJD的5%～15%，由Pmp基因突變引起；iCJD占CJD的1%左右，由醫(yī)療行為引起的感染；vCJD則由人食入牛海綿狀腦病(bovine spongiform encephalopathy，BSE)牛制品引起。CJD代表性癥狀包括進行性癡呆、肌陣攣以及共濟失調等。根據(jù)WHO[2]1998年提出的CJD診斷標準以及美國疾病控制和預防中心(Center for Disease Control and Prevention in the US)及歐洲疾病控制預防中心(the European Centre for Disease Prevention and Control，ECDC)2009年修訂的標準[3]，依體格檢查、臨床檢測結果等將疾病分為明確診斷、很可能診斷及可能診斷。腦組織活檢仍為診斷CJD的金標準。手術取材的靶區(qū)域也常常為影像學改變最為明顯的區(qū)域，而這些區(qū)域往往為皮層下較深部位；且手術取材后行病理檢查時并非所有腦區(qū)均會出現(xiàn)典型的CJD病理改變。因此腦組織活檢也存在一定的局限性。目前尚缺乏可確診CJD的非侵入性檢查手段和更敏感的檢測新方法用于協(xié)助臨床診斷CJD，因此隨著研究的逐步進展，臨床亟需新的非侵入性診斷方法進行早期疾病診斷。

1 CJD實驗室診斷

PrPSc聚集在腦中形成PrP沉積物，引起典型的病理改變，如神經(jīng)元丟失、星形膠質細胞增生及空泡形成，導致海綿狀組織沉積甚至死亡[4]。采取侵入性方式取腦組織進行免疫組織化學檢測以明確其神經(jīng)病理學改變依然是目前的一種必不可少的確診方法。然而患者及家屬對此種侵入式的方法接受程度較低，導致低活檢率或尸檢率，這是CJD確診率低的原因之一。對一些有效的生物標記物如14-3-3蛋白進行檢測的方法已經(jīng)發(fā)展成熟，并在一定程度上降低了漏診率。聯(lián)合檢測多種已知的生物標記物彌補了檢測單一生物標記物的低敏感性和/或低特異性的缺點。

1.1 朊病毒的檢測方法 朊病毒感染后，在宿主細胞內(nèi)尤其是神經(jīng)元內(nèi)表達的PrPc轉變?yōu)镻rPSc。PrPc具有調控氧化應激反應、調節(jié)鈣銅的平衡、保持生物周期穩(wěn)定的功能，同時能夠幫助宿主維持空間學習能力及記憶力，在信息傳遞及突觸形成等方面也起一定作用。PrPSc聚集在腦中形成PrP沉積物，引起朊蛋白病特征性病理改變。且因朊蛋白病能夠傳染，其病理改變的特點不同于其他的淀粉樣變性病。由于“種屬屏障”的存在，可傳染性疾病通常在不同物種中很難傳播，而BSE能傳染給人類致vCJD，因此對BSE進行研究至關重要。

侵入性腦組織活檢為目前唯一一種能夠確診的方法，但在操作過程中可能損傷正常腦組織，為降低侵入性，也有學者采用嗅黏膜及骨骼肌等組織進行其診斷意義的研究，但均未經(jīng)過驗證或推廣。也有學者通過檢測vCJD患者扁桃體中的PrPSc進行診斷的相關報道[5]。扁桃體活檢對診斷vCJD有一定意義，但并不能用于診斷sCJD[5]。2005年Castilla等[6]采用蛋白錯誤折疊循環(huán)擴增(PMCA)的方法進行CJD的診斷研究，該研究通過檢測體外擴增少量的PrPSc以反映朊病毒感染的滴度。此方法也能檢測血液及尿液中的朊病毒。動物實驗發(fā)現(xiàn)在癥狀出現(xiàn)前PMCA法可檢測到朊病毒感染[7]，而且對vCJD的診斷[8]和sCJD的診斷[9]都具有很高的敏感性。

1.2 生物標記物檢測 腦脊液檢測被廣泛用于診斷神經(jīng)系統(tǒng)疾病，14-3-3蛋白是目前診斷CJD廣泛采用的生物標記物。WHO 1998年的診斷標準將腦脊液14-3-3蛋白作為診斷CJD的標準之一[2]，基于臨床特征、DWI結果以及腦脊液中的替代標記物如14-3-3蛋白及總tau蛋白(total tau，t-tau)等作出CJD的診斷。14-3-3蛋白為一組具有調節(jié)功能的胞質多肽，它在細胞凋亡、細胞內(nèi)轉運、細胞周期調節(jié)以及信號轉導方面都具有非常重要的作用。在神經(jīng)受損時，14-3-3蛋白釋放入腦脊液。有研究對420例CJD患者進行活組織檢查14-3-3蛋白，證實其敏感性及特異性分別為95%和28%[10]。Gmitterová等[11]采用一種改良的ELISA技術檢測sCJD腦脊液中的14-3-3蛋白，發(fā)現(xiàn)對MM1、VV1、VV2 3種亞型檢測的敏感性均達100%，對MM2、MV1、MV2 3種亞型檢測的敏感性分別為75%、89%、89%，而采用免疫印跡法檢測時僅MM2亞型獲得陽性結果。Satoh等[12]采用半定量Western blot技術，使用各種抗體特異地檢測14-3-3蛋白的不同亞型，發(fā)現(xiàn)γ-亞型能增加檢測的特異性，如果病例同時有陽性MRI結果和/或腦脊液排除炎性改變能夠明顯提高診斷的特異性。

除14-3-3蛋白外，tau蛋白包括t-tau及磷酸化tau蛋白(phosphorylated tau，p-tau)同樣是診斷CJD的重要的生物標記物，甚至較14-3-3蛋白具有更高的敏感性及特異性。P-tau/t-tau為診斷sCJD最為準確的單一標記物，其敏感性及特異性分別為86%和90%[13]。結合檢測一種以上腦脊液內(nèi)蛋白標記物能夠提高sCJD與其他神經(jīng)精神狀況(如癡呆等)鑒別的準確性[13]。14-3-3蛋白及t-tau蛋白能明顯提高sCJD MM1/MV1的診斷率，其診斷敏感性約91%～100%[11，14-15]。

近幾年，學者們對其他的一些神經(jīng)損傷標記物包括神經(jīng)元特異性烯醇化酶、S-100B、乳酸脫氫酶等也進行研究，但在14-3-3蛋白及tau蛋白檢測的基礎上，并未提高診斷的敏感性。為與其他神經(jīng)變性疾病性癡呆相鑒別，特別是最容易導致14-3-3蛋白及tau蛋白假陽性的非朊蛋白神經(jīng)變性疾病性癡呆(如阿爾茨海默病)，檢測p-tau/t-tau及β淀粉樣蛋白(Aβ)具有重要意義[16]。Aβ與朊蛋白相同，以不同大小(從低聚物到纖絲樣淀粉蛋白聚集物)沉積于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，導致神經(jīng)退行性病變。因此找到更好的腦脊液標記物進行聯(lián)合診斷可提高其診斷的敏感性及特異性。

實時振動誘導轉化(real-time quaking-induced conversion，RT-QUIC)技術通過在體外擴增腦脊液樣本中的PrPSc，診斷sCJD的敏感性及特異性分別達到84%及100%[17]。也有研究將RT-QUIC應用于鼻部嗅上皮組織刷取標本[18]，將少量錯誤折疊蛋白“種子”通過外來能量擴增成較大的淀粉樣蛋白或蛋白酶抗性蛋白聚合物，特異性達100%，敏感性也達97%。這種方法的優(yōu)缺點還需要進一步證實，但根據(jù)以上數(shù)據(jù)，結果令人鼓舞，尤其是上述方法可檢測出低至40～100個/mL的錯誤折疊蛋白聚合物[19]。

1.3 PrP 基因篩查 傳染性海綿狀腦病的致病機制為非正常的錯誤折疊蛋白(PrPSc)聚集影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)。人類的致病病原體由位于染色體20p13的朊蛋白基因(PRNP)編碼。朊蛋白病是由于PRNP基因的突變或多態(tài)性致其在人體及動物體內(nèi)潛伏。朊蛋白的病原體基因突變導致遺傳性朊蛋白病，如fCJD，占發(fā)病原因的10%～15%[19]。PRNP基因的突變在散發(fā)及遺傳型CJD中更容易發(fā)生。密碼子129位為蛋氨酸及纈氨酸的遺傳密碼子，是CJD分子診斷的作用靶點[20]。這一密碼子頻繁的出現(xiàn)在所有類型的CJD中，編碼多態(tài)性蛋氨酸純合子最普遍。PRNP突變導致CJD不同表型變化，密碼子129的多態(tài)性對突變體及野生等位基因進行更進一步的調控。遺傳型CJD最為常見的形式為E200K(賴氨酸[K]替代谷氨酸[E])突變[21]。其次為V210I(異亮氨酸[I]替代纈氨酸[V])突變，但這種突變并沒有一個明確的模式[21]。在臨床實踐中，需要詳細詢問患者及家屬情況，并能提供是否需要進行PRNP基因檢測的信息。對于任何有人傳染性海綿狀腦病家族史的患者均推薦進行基因檢測及分析[12]。到目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了40多種PRNP基因突變與遺傳性人朊蛋白病相關。隨著對疾病認識的提高以及更多分子工具的完善，越來越多的突變也將被發(fā)現(xiàn)并用于臨床篩查。

2 電生理診斷

最早使用腦電圖(EEG)診斷CJD是從1954年開始，并在1979年正式公布EEG為CJD的診斷標準之一。在14-3-3蛋白檢測前，周期性腦波記錄被認為是sCJD非侵入性方法中最為可靠的一種診斷依據(jù)[22]。周期性尖-慢復合波(periodic sharp and slow wave complexes)是sCJD的典型EEG改變。一般在sCJD早期表現(xiàn)為雙側α波活躍，伴有不規(guī)則的θ波及δ波，間歇性出現(xiàn)有節(jié)律的δ波，這些變化多數(shù)為彌漫異常，無特異性。隨病情進展，慢波逐漸增多，可出現(xiàn)特征性的周期性同步放電(periodic synchronous discharge)，表現(xiàn)為廣泛性、左右同步或不同步的爆發(fā)性異常波。但這種改變也可出現(xiàn)在其他疾病中，如中毒代謝性障礙、Hashimoto腦病(HE)，阿爾茨海默病及路易體癡呆等，因此嚴密、反復多次監(jiān)測EEG對鑒別診斷CJD的各亞型非常重要。

3 影像學診斷

很多CJD患者的MRI影像中可出現(xiàn)CJD的特征性改變，MRI能夠很好地區(qū)分CJD亞型。CJD特異的神經(jīng)病理改變，包括空泡形成、朊蛋白沉積以及星形膠質細胞增生等與DWI檢查的灰質改變相關[23]。DWI和FLAIR診斷CJD的敏感性和特異性分別為91%～92.3%和93.8%～95%[24-25]。二者不僅可檢測到皮層下灰質(尾狀核及丘腦)改變，還可檢測到皮層改變(稱之為“花邊征”)，疾病初期異常高信號可能為單側性，隨疾病進展可發(fā)展至雙側，而疾病終末期異常信號可能減少甚至消失。此外MRI可幫助鑒別vCJD及sCJD，通常sCJD的改變發(fā)生在尾狀核，而大多數(shù)vCJD的異常出現(xiàn)在后丘腦部位[26]。sCJD的DWI高信號改變更明顯、更典型，比FLAIR影像中的改變出現(xiàn)的更早[27]。Caverzasi等[28]使用DTI來度量sCJD，指出量化方法能夠更加精確地識別腦組織受損模式，系統(tǒng)追蹤MRI影像改變有助于更深刻地認識人類朊蛋白病潛在的組織病理學改變機制，并指導臨床實踐；平均彌散系數(shù)(mean diffusivity)表現(xiàn)為最初有降低趨勢，隨后逐漸趨近正常，且平均彌散系數(shù)增加程度與患者的臨床功能惡化密切相關。雖然WHO的sCJD診斷標準并沒有將MRI結果列入其中，但是美國疾病控制和預防中心及ECDC基于最近修訂的標準將MRI列入sCJD的診斷標準中[3]。

MRI診斷CJD的一個缺點在于其結果與臨床醫(yī)生的能力有關，特別是在疾病早期階段臨床醫(yī)生或放射科醫(yī)生識別CJD的MRI改變較難，易導致漏診、誤診。因此建議即使處于疾病早期MRI顯示“正?！保嘈柙俅巫屑毣仡櫽^察。

[1]Aguzzi A，Montrasio F，Kaeser PS.Prions：health scare and biological challenge[J].Nat Rev Mol Cell Bio，2001，2(2)：118-126.

[2]WHO.Human transmissible spongiform encephalopathies[J].Wkly Epidemiol Rec，1998，73：361-365.

[3]Zerr I，Kallenberg K，Summers DM，et al.Updated clinical diagnostic criteria for sporadic Creutzfeldt-Jakob disease[J].Brain，2009，132(Pt10)：2659-2668.

[4]Sakudo A，Ikuta K.Prion protein functions and dysfunction in prion diseases[J].Curr Med Chem，2009，16(3)：380-389.

[5]Hill AF，Butterworth RJ，Joiner S，et al.Investigation of variant Creutzfeldt-Jakob disease and other human prion diseases with tonsil biopsy samples[J].Lancet，1999，353(9148)：183-189.

[6]Castilla J，Saa P，Hetz，C.In vitro generation of infectious scrapie prions[J].Cell，2005，121(2)：195-206.

[7]Saa P，Castilla J，Soto C.Presymptomatic detection of prions in blood[J].Science，2006，313(5783)：92-94.

[8]Jones M，Peden AH，Prowse CV，et al.In vitro amplification and detection of variant Creutzfeldt-Jakob disease PrPSc[J].J Pathol，2007，213(1)：21-26.

[9]Soto C，Anderes L，Suardi S，et al.Pre-symptomatic detection of prions by cyclic amplification of protein misfolding[J].FEBS Lett，2005，579(3)：638-642.

[10]Hamlin C，Puoti G，Berri S，et al.A comparison of tau and 14-3-3 protein in the diagnosis of Creutzfeldt-Jakob disease[J].Neurology，2012，79(6)：547-552.

[11]Gmitterová K，Heinemann U，Bodemer M，et al.14-3-3 CSF levels in sporadic Creutzfeldt-Jakob disease differ across molecular subtypes[J].Neurobiol Aging，2009，30(11)：1842-1850.

[12]Satoh K，Tobiume M，Matsui Y，et al.Establishment of a standard 14-3-3 protein assay of cerebrospinal fluid as a diagnostic tool for Creutzfeldt-Jakob disease[J].Lab Invest，2010，90(11)：1637-1644.

[13]Bahl JM，Heegaard NH，F(xiàn)alkenhorst G，et al.The diagnostic efficiency of biomarkers in sporadic Creutzfeldt-Jakob disease compared to Alzheimer’s disease[J].Neurobiol Aging，2009，30(11)：1834-1841.

[14]Castellani RJ，Colucci M，Xie Z，et al.Sensitivity of 14-3-3 protein test varies in subtypes of sporadic Creutzfeldt-Jakob disease[J].Neurology，2004，63(3)：436-442.

[15]Collins SJ，Sanchez-Juan P，Masters CL，et al.Determinants of diagnostic investigation sensitivities across the clinical spectrum of sporadic Creutzfeldt-Jakob disease[J].Brain，2006，129(Pt 9)：2278-2287.

[16]Zanusso G，F(xiàn)iorini M，F(xiàn)errari S，et al.Cerebrospinal fluid markers in sporadic Creutzfeldt-Jakob disease[J].Int J Mol Sci，2011，12(9)：6281-6292.

[17] Sano K，Satoh K，Atarashi R，et al.Early detection of abnormal prion protein in genetic human prion diseases now possible using real-time QUIC assay[J].PLoS One，2013，8(1)：e54915.

[18]Orrú CD，Bongianni M，Tonoli G，et al.A test for Creutzfeldt-Jakob disease using nasal brushings[J].N Engl J，2014，371(6)：519-529.

[19]Panegyres PK，Goh JG，Goldblatt J.Codon 200 mutation of the prion gene：genotype-phenotype correlations[J].J Neurol，2012，259(12)：2579-2584.

[20]Puoti G，Bizzi A，F(xiàn)orloni G，et al.Sporadic human prion diseases：molecular insights and diagnosis[J].Lancet Neurol，2012，11(7)：618-628.

[21]Schelzke G，Kretzschmar HA，Zerr I.Clinical aspects of common genetic Creutzfeldt-Jakob disease[J].Eur J Epidemiol，2012，27(2)：147-149.

[22]Brown P，Brunk C，Budka H，et al.WHO Manual for Surveillance of Human Transmissible Spongiform Encephalopathies，including Variant Creutzfeldt-Jakob Disease[R].Geneva：World Health Organization，Communicable Disease Surveillance and Response，2003.

[23]Geschwind MD，Potter CA，Sattavat M，et al.Correlating DWI MRI with pathologic and other features of Creutzfeldt-Jakob disease[J].Alzheimer Dis Assoc，2009，23(1)：82-87.

[24]Young GS，Geschwind MD，F(xiàn)ischbein NJ，et al.Diffusion-weighted and fluid-attenuated inversion recovery imaging in Creutzfeldt-Jakob disease：high sensitivity and specificity for diagnosis[J].AJNR Am J Neuroradiol，2005，26：1551-1562.

[25]Shiga Y，Miyazawa K，Sato S，et al.Diffusion-weighted MRI abnormalities as an early diagnostic marker for Creutzfeldt-Jakob disease[J].Neurology，2004，63：443-449.

[26]Zeidler M，Sellar RJ，Collie DA，et al.The pulvinar sign on magnetic resonance imaging in variant Creutzfeldt-Jakob disease[J].Lancet，2000，355(9213)：1412-1418.

[27]Vitali P，Maccagnano E，Caverzasi E，et al.Diffusion-weighted MRI hyperintensity patterns differentiate CJD from other rapid dementias[J].Neurology，2011，76(20)：1711-1719.

[28]Caverzasi E，Henry RG，Vitali P，et al.Application of quantitative DTI metrics in sporadic CJD[J].Neuroimage Clin，2014，4：426-435.

(本文編輯：時秋寬)

10.3969/j.issn.1006-2963.2016.04.013

430000 武漢大學人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

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A

1006-2963(2016)04-0283-04

2015-11-16)