張蓓蓓 蔡輝

210002南京軍區(qū)南京總醫(yī)院中西醫(yī)結合科

·綜述·

心臟肌成纖維細胞活化的力學調控

張蓓蓓 蔡輝

210002南京軍區(qū)南京總醫(yī)院中西醫(yī)結合科

在心肌修復或纖維化過程中，以成纖維細胞為主的多種前體細胞向心臟肌成纖維細胞(CMFs)活化，合成大量細胞外基質成分，并持續(xù)存在于心肌瘢痕中。CMFs活化除了受促纖維化因子的調控外，還受力學因素的影響。ECM剛度增加及循環(huán)應變的改變能促進CMFs活化推動心肌纖維化持續(xù)進展。通過調控CMFs對機械應力的敏感性來抑制CMFs活化的方法有可能成為心肌纖維化治療的新選擇。

成纖維細胞; 機械應力; 心肌纖維化; 細胞外基質

細胞是人體的基本結構和功能單位，其生物學行為不僅受微環(huán)境中化學信號的影響，還普遍受力學因素的調控。心臟肌成纖維細胞(cardiac myofibroblasts，CMFs)是心肌組織損傷修復和纖維化過程中合成膠原性細胞外基質(extracellular matrix，ECM)最主要的細胞[1-2]。正常心肌組織中一般不存在CMFs，但急性心肌損傷或長期壓力負荷過重可誘導多種前體細胞向CMFs表型活化，這個過程對維持心臟結構和功能具有重要意義。然而，持久而過度的CMFs活化可導致病理性ECM沉積與重構，即心肌纖維化。長期以來，對CMFs調控的機制研究主要集中在化學因素方面，如可溶性因子、細胞因子、基質細胞蛋白和細胞外蛋白等[3-4]。而隨著體外應力加載裝置的出現(xiàn)，力學因素對CMFs活化的作用越來越受重視。對在體心臟來說，由心肌細胞節(jié)律性搏動產(chǎn)生的循環(huán)載荷應力-應變及ECM剛度是最主要的力學因素。本文綜述了CMFs活化的力學調控，以期為以CMFs為靶目標的抗心肌纖維化研究提供新的思路。

1 CMFs的來源、活化及鑒別

1.1 CMFs的來源

參與纖維化和心肌修復的CMFs來源于各種不同的細胞，其中心肌局部來源包括心臟成纖維細胞(cardiac fibroblast，CFs)、血管相關平滑肌細胞和血管周細胞。此外，上皮-間充質細胞轉化、內皮-間充質細胞轉化、纖維細胞和其他髓系祖細胞也是損傷后CMFs的來源[5]。這些前體細胞對纖維化心肌中CMFs的相對貢獻是一個爭論激烈的問題。更復雜的是，CMFs前體細胞的募集似乎與物種、誘發(fā)因素及前體細胞在心臟中的位置均有關[6]?？梢哉J為接收心肌損傷信號的許多細胞均有機會激活為CMFs。

1.2 CMFs的活化

作為正常心肌中數(shù)量最多的細胞類型，CFs是CMFs最主要的來源，也是本文重點關注的前體細胞。CFs和其他CMFs的前體細胞內一般不含應力纖維，但在機械應力的作用下細胞質內肌動蛋白和肌球蛋白可形成應力纖維[7-8]，即發(fā)育成“原-CMFs”。應力纖維終止于細胞膜表面包含整合素受體的黏著斑復合物，后者能感應并傳遞ECM的機械刺激。隨著ECM所受應力和剛度的增加，“原-CMFs”內初始的小黏著斑發(fā)展成大的超成熟黏著斑，并誘導化學信號，如轉化生長因子-β(TGF-β)和纖連蛋白細胞外片段的表達，促使α-平滑肌細胞肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)進入應力纖維。這些具有強收縮力且α-SMA陽性的細胞最初被稱為“分化成熟的CMFs”。如果根據(jù)CMFs是終末細胞的傳統(tǒng)觀念，細胞凋亡應是它們在組織中消失的唯一方式，但最近有研究證明，CMFs可以被逆分化，是一種細胞表型，而不是一種細胞類型[9]。因此，CMFs“活化”似乎比“分化”這個詞更為合適。

1.3 CMFs的鑒別

α-SMA在應力纖維的表達是目前運用最廣泛的鑒別MFs的方法，但血管平滑肌細胞和周細胞也表達α-SMA，因此為了區(qū)別這些不同的細胞類別需要尋找新的標記方法。例如，聯(lián)合結蛋白(表達于平滑肌細胞和心肌細胞)和內皮細胞標記物(如CD31或VE-鈣粘素)的檢測方法能更可靠地將小血管與MFs區(qū)別開來。除了根據(jù)細胞骨架標記識別MFs外，轉基因小鼠模型也被用于識別和錨定纖維化組織中的MFs及其前體細胞?，F(xiàn)已實現(xiàn)利用Ⅰ型膠原-綠色熒光轉基因小鼠來追蹤觀察肝中MFs的來源[10]。血小板源性生長因子受體β(platelet-derived growth factor β，PDGFRβ)表達升高是多個器官MFs活化的早期標志。PDGFRβ-Cre重組酶作用下αv基因的條件性缺失可阻止纖維化的肝、肺和腎臟中的周細胞向MFs活化[11]，但這種方法在心臟中是否有效仍需論證。雖然PDGFRβ陽性的周細胞是肝[12]和腎纖維化組織中MFs的主要來源，但它們在心臟中的功能尚不清楚。事實上，PDGFRβ陽性且表達轉錄因子Gli1的周細胞亞群具有間充質干細胞的特征，在實驗性心肌纖維化過程中起主要作用[13]。PDGFRα則表達于平滑肌祖細胞，由于其表達水平在多器官纖維化和損傷修復過程中均上調，PDGFRα 啟動子驅動也被用于追蹤CMFs的發(fā)育過程[14]。

2 CMFs的力學調控

心肌組織的ECM是由CFs分泌的Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白、原纖維蛋白、彈性蛋白、蛋白聚糖和糖蛋白等物質在心肌細胞附近組建的網(wǎng)架結構。CFs調控ECM平衡能為心肌細胞電傳導提供穩(wěn)定的介質，以保障心臟快速、協(xié)調的舒縮活動。CFs除了在TGF-β依賴和非依賴信號、血管緊張素Ⅱ[15]、內皮素-1、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、PDGF和β-連環(huán)素/ Wnt[16]等可溶性細胞因子的調控下會活化為CMFs，機械載荷及ECM應力的改變[17-18]對CMFs活化也有重要影響。大量學者利用體外細胞培養(yǎng)系統(tǒng)及應力加載裝置對CMFs的力學調控進行了研究。

2.1 心肌ECM的力學性能

若將心肌組織當作一種彈性材料，則可以從拉伸強度、斷裂伸長率、硬度、彈性模量、沖擊強度等指標評估其力學性能。楊氏模量又稱拉伸模量是單位面積彈性材料產(chǎn)生應變所需要的應力，是彈性模量中最常見的一種，可用來衡量材料的剛度。使用原子力顯微鏡測量正常心肌的楊氏模量為10～15 kPa，而纖維化心肌組織由于正常的ECM結構被順應性低的膠原瘢痕所替代，測得的楊氏模量增加了2～10倍(20～100 kPa)，則心肌細胞收縮的載荷明顯加重。而未得到有效控制高血壓有可能會進一步加重心肌載荷，這種力學性能的改變能激活TGF-β從而活化MFs[19]。ECM力學性能的改變除了調控CMFs活化外，也能干擾其他心肌組織細胞，例如阻礙正常的心肌祖細胞分化成熟，影響心肌細胞收縮[20]。

2.2 培養(yǎng)基剛度對CMFs活化的作用

目前大多采用二維細胞培養(yǎng)系統(tǒng)觀察研究成纖維細胞，由于其具有易操作、適用多種分析技術和利于細胞繁殖的特點，明顯優(yōu)于復雜的三維細胞培養(yǎng)、動物實驗和臨床研究，但并不能很好地模擬生理條件。其一，傳統(tǒng)聚苯乙烯平板培養(yǎng)基的剛度(GPa)比正常甚至纖維化心肌高約十萬倍[21]。其二，成纖維細胞培養(yǎng)液成分之一的血清(濃度為5 %～10%)在不同批次和廠家間可能有很大差異，且血清中bFGF的相對含量決定了培養(yǎng)液對CMFs活化有促進還是抑制作用，已證實后者能抑制MFs和潛在的TGF-β1活化[22]。其三，成纖維細胞培養(yǎng)的氧濃度明顯高于通常較低的組織氧含量，在人體外科手術和動物實驗中檢測到的心肌組織氧分壓為19～22 mmHg，僅相當于1%～5%氧濃度。在體外培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)基剛度、血清濃度、氧分壓均是促使MFs活化的重要驅動因素，且CFs可能與其他器官成纖維細胞表現(xiàn)出不同的反應閾值。除非嚴格控制培養(yǎng)條件，否則原代培養(yǎng)的成纖維細胞中很可能部分活化為MFs，造成體外和體內實驗結果不一致。因此，聯(lián)合使用二維和三維培養(yǎng)系統(tǒng)，而不是只選擇其中一種有助于提供更多有價值的信息。

高彈性聚合物水凝膠的出現(xiàn)使得培養(yǎng)基剛度對MFs活化的影響大大減弱。這種主要由聚丙烯酰胺、聚乙烯醇或硅橡膠等彈性材料做成的二維柔性培養(yǎng)基剛度與組織非常相近，且光學性能與塑料培養(yǎng)基一致。楊氏模量1～3 kPa為聚丙烯酰胺凝膠可以抑制成纖維細胞應力纖維發(fā)育及“原-MFs”形成。在剛度稍大一點的培養(yǎng)基上，成纖維細胞內出現(xiàn)不含α-SMA的應力纖維。剛度更大的凝膠或硅橡膠培養(yǎng)基(楊氏模量≈20 kPa)則可引起進一步的MFs活化，特征為α-SMA進入應力纖維[23]。最近，具有剛度各向異性的光控水凝膠被加入到細胞培養(yǎng)基行列中[24]。通過輻照降低光降解水凝膠局部的剛度可以逆轉心臟瓣膜間質細胞(valvular interstitial cells，VICs，其本質上是一種成纖維細胞)向CMFs的活化[25]。需要注意的是，同樣是彈性模量為1～3 mPa的傳統(tǒng)聚二甲基硅氧烷硅膠膜雖然可以發(fā)生變形，但對成纖維細胞來說屬于剛性基質。總的來說，膠原蛋白或纖維蛋白凝膠是柔性還是剛性基質一般取決于其中生物聚合物的濃度(通常為1～5 mg/ml)，但還受到成纖維細胞重構的強烈影響，后者可造成力學性能的各向異性分布[26]。在一種新的模擬梗死后心肌不同部位力學改變的體外模型中，剛度相對大的部位更容易發(fā)生CMFs活化[27]。

2.3 循環(huán)應變對CMFs活化的作用

由于心肌規(guī)律性的收縮和舒張運動，成纖維細胞和CMFs不論是在柔性還是剛性ECM中均受循環(huán)應變的影響。在體外實驗中，將循環(huán)應變加載至培養(yǎng)成纖維細胞的二維硅膠膜或在三維生物聚合物凝膠通常能促進Ⅰ型膠原和纖維蛋白合成[28]。應變速率(范圍從1%～20 %)和應變周期是造成循環(huán)應變對CMFs效應不同的最主要原因。此外，CFs內α-SMA基礎水平對應變作用的結果也有影響。在一個借助膠原包被磁珠為CFs提供恒定拉力的模型中，新生大鼠CFs培養(yǎng)1 d后α-SMA表達水平極低，給細胞加壓4 h后α-SMA表達增加了1.5～2.0倍；在剛性基底上培養(yǎng)3 d后CFs內α-SMA表達水平明顯升高，而此時細胞加壓4 h后α-SMA表達下降了32 %[29]。Husse等[30]研究發(fā)現(xiàn)，循環(huán)應變可能通過蛋白激酶和酪氨酸激酶信號介導成纖維細胞合成ECM成分。Song等[31]報道，核因子-κB和活化蛋白-1能以pellino-1依賴性方式參與循環(huán)應變對CFs的作用。

許多研究報告了采用特定實驗裝置加載循環(huán)應變對CMFs活化的負性作用。在三維凝膠培養(yǎng)VICs的條件下，循環(huán)等軸應變(20%、1 Hz)能促進成纖維細胞表型表達，明顯降低α-SMA表達，而增強所加載應變的各向異性則能夠提高α-SMA的表達促進CMFs活化[32]。也有報道，循環(huán)等雙軸應變(15%、1 Hz)的加載更有利于同樣條件下二尖瓣VICs表達成纖維細胞表型，而額外添加活性TGF-β能夠拮抗循環(huán)等雙軸應變的作用誘導CMFs活化和α-SMA表達[33]。在另一項結合流體剪切應力觀察循環(huán)應變作用的研究中，循環(huán)應變(5%，1 Hz)通過改變Smad2磷酸化狀態(tài)降低α-SMA的表達，而流體剪切應力能誘導TGF-β和血管緊張素Ⅱ1型受體(AT1R)信號發(fā)揮相反的作用[34]。這些研究表明，在一定條件下的循環(huán)應變能抑制CMFs活化。乍一看這些研究結果與CMFs活化需要機械應力的背景知識不符，然而這些結果與CFs能自適應正常心動周期中的循環(huán)應變而不發(fā)生CMFs活化的事實是一致的。

2.4 循環(huán)應變與基質剛度對CMFs活化的共同作用

在不同彈性模量培養(yǎng)基上加載循環(huán)應變的研究顯示，基質剛度對成纖維細胞行為的作用是短暫的，而循環(huán)應變的作用是持久的[35]。有趣的是，在柔性基底上接受循環(huán)應變的細胞行為與剛性基底上的細胞行為相似，這表明循環(huán)應變在刺激成纖維細胞鋪展、應力纖維形成和生長方面的作用可以代替剛性基底[36]。在應力松弛的粘彈性基底上培養(yǎng)的成纖維細胞也有類似的應力纖維形成與細胞增殖行為[37]。隨著時間的推移，在粘彈性基底上細胞保持相同形變需要的力會逐漸變小，這一特性使粘彈性基底較用聚丙烯酰胺或硅膠制成的彈性基底能更好地模擬成纖維細胞的生物力學微環(huán)境。

3 CMFs對力學刺激的應答

3.1 力學刺激對CMFs的影響

ECM剛度和循環(huán)應變對CMFs的影響是多方面的：(1)高應力是α-SMA進入應力纖維和細胞收縮性增強所必需的；(2)應力直接調節(jié)α-SMA啟動子的活性和蛋白表達；(3)基質順應性通過調節(jié)胞質Ca2+信號控制CMFs收縮[38]；(4)應變和機械載荷能調節(jié)TGF-β1的生物活性，后者是一種重要的促CMFs分化因子。因此，減小ECM剛度產(chǎn)生的應力及改變應變狀態(tài)或許可以抑制CMFs活化防治心肌纖維化，但由于人體內心肌ECM的力學條件很難被改變，在實際工作中可以考慮通過調控CFs對力學刺激的敏感性以達到抑制CMFs活化的目標。

3.2 CMFs對力學刺激的感應

CFs能感知并響應微環(huán)境中的力學信號，并將此信號轉化為化學信號。整合素是重要的力學感受器，能夠將具有收縮功能的肌動蛋白/肌球蛋白細胞骨架與ECM相連接，方便細胞捕捉周圍環(huán)境中的力學信號[39]。CFs和CMFs表達多種不同的整合素，包括膠原受體整合素α1β1、α2β1、α11β1、和α1β3和纖連蛋白結合整合素α5β1、α8β1、αvβ1、αvβ 3和αvβ5。除了構成黏著斑連接細胞與ECM外，整合可以特異性結合纖連蛋白配體隱藏結構域，后者在應變的作用下才會暴露出來[40]。整合素參與的ECM收縮還可以促進TGF-β1活化，這為復雜的“間接力學感應”機制增添了新內容[41]。細胞膜機械敏感性通道與整合素結合是CFs感應力學刺激的另一個主要機制和治療目標。例如，瞬時受體電位香草酸亞型4(TRPV4)是一種機械敏感性離子通道，能夠介導剛性基底上肝、肺和心臟MFs活化和纖維化。TRPV4能調節(jié)CFs胞質鈣濃度，對TGF-β1誘導的CMFs活化也是必需的[42]。

3.3 CMFs對力學刺激的傳導

力學信號傳導有賴于細胞內肌動蛋白/肌球蛋白的收縮。因此，抑制肌球蛋白運動(如使用肌球蛋白輕鏈抑制劑)和破壞肌動蛋白微絲(如使用細胞松弛素D或jasplakinolide)可以阻礙力學信號的傳導。這些化合物由于缺乏細胞特異性，能徹底阻止心肌收縮和肌動蛋白絲形成，用于人體造成的治療相關損傷可想而知。而抑制RhoA/Rho相關激酶(ROCK)活性，一條主要參與非肌細胞內應力纖維形成的信號轉導途徑，能夠在不引起嚴重不良反應的情況下阻礙CMFs對力學刺激的感應和活化[43]。在心臟和肺纖維化實驗模型中，ROCK抑制劑被認為是非常有前景的抗纖維化藥物。另外長時間應用能直接、特異性地抑制α-SMA的多肽由于能夠減小細胞內應力，也有望取得良好的療效。因此，以CMFs收縮為靶目標的抗纖維化治療具有雙重作用，一方面抑制組織攣縮，另一方面干擾促使CMFs活化的力學信號傳導。

最近，有人提出了干擾與轉錄因子Yorkie同源的Yes相關蛋白(YAP)和PDZ結合域轉錄共激活蛋白(TAZ)的治療方案。YAP和TAZ對機械應力的感應至關重要，ECM力學線索、細胞黏附位點、細胞形狀和肌動球蛋白骨架等信號都被整合到細胞核YAP/ TAZ復合體，后者向核仁轉位從而調節(jié)基因表達[44]。YAP / TAZ活性升高被證明能促進多種細胞向CMFs活化。另一個參與力學信號傳導的因子是巨核細胞白血病因子1，也叫心肌素相關轉錄因子(myocardinrelated transcription factor，MRTF)，通過肌動蛋白的聚合狀態(tài)將機械應力與各種CMFs祖細胞內α-SMA基因的轉錄活性相關聯(lián)。MRTF在剛性基底上以RhoA/ROCK依賴的方式易位到細胞核，加速纖維化進程[45]。MRTF-A基因敲除可使成纖維細胞耐受剛性基底誘導的CMFs活化，而MRTF-A基因過表達或持續(xù)性活化可使成纖維細胞在柔性基底上發(fā)生CMFs活化[46]。

4 小結

前面主要綜述了力學刺激活化CMFs的機制，也討論了不同基質剛度和外界載荷對體外培養(yǎng)的CFs向CMFs活化的影響，但通過改變心肌ECM剛度和循環(huán)應變以抑制CMFs活化的方法在心肌纖維化的臨床治療中很難實踐。雖然成纖維細胞對力學刺激的感應易受藥物干預，但許多涉及該過程的信號途徑和蛋白質也參與了細胞收縮的調節(jié)，所以靶向作用于CMFs的抗心肌纖維化藥物將是不妨礙心肌細胞正常功能的關鍵。隨著能夠產(chǎn)生特定力學條件的小型化系統(tǒng)的開發(fā)，具有更高效率且更接近生理條件的裝置將使CFs的研究更為方便。

利益沖突：無

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(本文編輯：周白瑜)

Mechanical regulation of cardiac myofibroblast activation

ZhangBeibei，CaiHui

DepartmentofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine，NanjingGeneralHospitalofNanjingMilitaryCommand，Nanjing210002，China

CaiHui，Email：njzy_caihui@163.com

In the process of myocardial repair or fibrosis，cardiac myofibroblasts (CMFs) based precursor cells are activated.CMFs synthesize large amounts of extracellular matrix (ECM) components and persist staying in the myocardial scar.CMFs activation is regulated by pro-fibrogenic cytokines and mechanical factors.The increased stiffness of ECM and change of cyclic strain can aggravate myocardial fibrosis by maintaining CMFs activation.Inhibition of CMFs activation by regulating sensitivity of CMFs to mechanical stress may be a new choice of myocardial fibrosis treatment.

Fibroblasts； Mechanical force； Cardiac fibrosis； Extracellular matrix

蔡輝，電子信箱：njzy_caihui@163.com

10.3969/j.issn.1007-5410.2016.06.017

2016-03- 07)