陳靖宇，陳鐵龍

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)(杭州 310000)，E-mail：532688835@qq.com；2.浙江省杭州市中醫(yī)院

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黃芪甲苷對(duì)心肌細(xì)胞保護(hù)作用的研究進(jìn)展

陳靖宇1，陳鐵龍2

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)(杭州 310000)，E-mail：532688835@qq.com；2.浙江省杭州市中醫(yī)院

摘要：心血管系統(tǒng)疾病是威脅人們生命的重要疾病，其發(fā)生機(jī)制較復(fù)雜，其中心肌細(xì)胞凋亡機(jī)制是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。對(duì)于心肌細(xì)胞的保護(hù)，黃芪甲苷(As-Ⅳ)起到巨大的作用，它的作用有不同的機(jī)制。本研究就As-Ⅳ對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制方面進(jìn)行相關(guān)論述。

關(guān)鍵詞：心血管系統(tǒng)疾??；黃芪甲苷；心肌細(xì)胞；凋亡；黃芪

黃芪甲苷 (Astragaloside Ⅳ，As-Ⅳ)是中藥材黃芪 (Astragalus membranaceus) 的重要有效化學(xué)成分之一[1]。它的主要藥理作用包括增強(qiáng)免疫力、抗炎[2]、抗氧化[3-4]、抗病毒等[5]。近年來(lái)，該中藥單體對(duì)心血管系統(tǒng)的作用日益受到人們的重視[6]。以As-Ⅳ為主要成分的黃芪注射液主要用于病毒性心肌炎、心力衰竭等[7-8]，提示As-Ⅳ 可能具有類似強(qiáng)心苷類藥物的正性肌力作用。近年來(lái)相繼開(kāi)展了As-Ⅳ在保護(hù)心肌細(xì)胞方面的研究，包括As-Ⅳ對(duì)相關(guān)心血管方面疾病的保護(hù)作用以及作用的機(jī)制，本研究就相關(guān)內(nèi)容作一綜述。

1As-Ⅳ對(duì)維持心肌細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)起作用

龔?qiáng)W娣等[9]探討As-Ⅳ對(duì)心肌缺血心律失常模型大鼠心肌細(xì)胞 Ca2+濃度的影響，將心肌缺血再灌注模型大鼠隨機(jī)分為模型組和假手術(shù)組，各組給藥7 d后開(kāi)始造模。將 Fura- 2/AM 熒光探針負(fù)栽于大鼠心肌細(xì)胞，采用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)Ca2+濃度。結(jié)果顯示模型組心肌細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與As-Ⅳ的低劑量組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與As-Ⅳ的中、高劑量組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；As-Ⅳ的中、高劑量組與普羅帕酮組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本實(shí)驗(yàn)證明As-Ⅳ可降低心肌細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度，從而減少心律失常的發(fā)生，起到抗心律失常的作用。趙美瞇等[10]研究As-Ⅳ對(duì)豚鼠心室肌細(xì)胞 L型鈣電流和細(xì)胞內(nèi)鈣的影響，分離單個(gè)豚鼠心室肌細(xì)胞，應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)測(cè)定鈣電流，并采用熒光顯微鏡CCD成像系統(tǒng)動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞內(nèi)鈣變化。結(jié)果：1×10-6mmol/L As-Ⅳ可明顯抑制L-型鈣通道電流(ICa-L)，使最大電流峰值降低32.6%。As-Ⅳ對(duì)60 mmol/L的KCl誘導(dǎo)的[Ca2+]i升高有抑制作用，最大熒光密度變化值從1.17±0.30降至0.26±0.16(P<0.05)。并且As-Ⅳ可直接促進(jìn)鈣池內(nèi)鈣釋放，使[Ca2+]i從0.08±0.02升高到0.23±0.07(P<0.05)。從而得出結(jié)論：As-Ⅳ抑制 L型鈣通道，可減少細(xì)胞外鈣內(nèi)流；同時(shí)它促進(jìn)內(nèi)鈣釋放，對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)表現(xiàn)為雙向調(diào)節(jié)作用。王秋寧等[11]探討As-Ⅳ對(duì)異丙腎上腺素(Iso)誘導(dǎo)的乳大鼠心肌細(xì)胞肥大的保護(hù)作用和機(jī)制。實(shí)驗(yàn)方法：將體外培養(yǎng)的乳大鼠心肌細(xì)胞分別加入As-Ⅳ3 μmol/L、10 μmol/L、30 μmol/L和90 μmol/L孵育30 min后，再加入Iso10 μmol/L作用48 h。另設(shè)As-Ⅳ30 μmol/L和Iso30 μmol/L模型對(duì)照組。用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定心肌細(xì)胞總蛋白含量；消化分離法及計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)測(cè)量細(xì)胞體積；MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率；以Fura-2/AM為熒光探針，采用Till陽(yáng)離子測(cè)定系統(tǒng)，觀察胞內(nèi)[Ca2+]i瞬間變化。結(jié)果與正常對(duì)照組相比，As-Ⅳ30 μmol/L對(duì)心肌細(xì)胞無(wú)影響；Iso 30 μmol/L可使心肌細(xì)胞總蛋白含量明顯增加，體積明顯增大，心肌細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i瞬間峰值增大，同時(shí)使心肌細(xì)胞存活率降低了48.1%(P<0.01)。與Iso模型組相比，預(yù)加入As-Ⅳ10 μmol/L和30 μmol/L的心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)含量明顯降低，As-Ⅳ30 μmol/L組可以恢復(fù)達(dá)到正常對(duì)照組水平；As-Ⅳ 3 μmol/L～90 μmol/L可以拮抗Iso對(duì)正常心肌細(xì)胞體積增大、細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i瞬間變化幅度增大的作用；As-Ⅳ 3 μmol/L、10 μmol/L和30 μmol/L可顯著升高細(xì)胞存活率(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)證明As-Ⅳ對(duì)Iso誘導(dǎo)的乳大鼠心肌細(xì)胞肥大有良好的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與降低細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i有關(guān)。

2As-Ⅳ的抗氧化反應(yīng)

血漿中血清乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)的活性間接反映心肌細(xì)胞膜的完整性和心肌損傷程度的改變[12-13]，LDH、CK-MB含量越高心肌損傷越明顯。心肌組織超氧化物歧化酶(SOD)是心肌組織中清除自由基的酶，而丙二醛(MDA)是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)生成的活性物質(zhì)，SOD活性的降低以及MDA的生成增加均可導(dǎo)致心肌細(xì)胞的損害。李真真等[14]對(duì)As-Ⅳ對(duì)大劑量異丙腎上腺素 (Iso)誘導(dǎo)的大鼠心肌梗死的保護(hù)作用做了相關(guān)研究。用皮下注射大劑量Iso 建立大鼠心肌梗死動(dòng)物模型，以心電圖ST段抬高值作為心肌缺血指標(biāo)。行心導(dǎo)管檢查，觀察不同劑量As-Ⅳ對(duì)大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的影響；測(cè)定LDH、CK-MB含量，SOD 和MDA水平；并且觀察心肌組織形態(tài)學(xué)改變。實(shí)驗(yàn)完成后與模型組比較，不同劑量As-Ⅳ均能明顯改善大鼠心肌梗死血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)(P<0.05或P<0.01)，降低血清LDH、CK-MB含量(P<0.01)，提高心肌組織中SOD活性(P<0.05或P<0.01)，并可減少M(fèi)DA生成(P<0.01)，減輕心肌細(xì)胞的病理形態(tài)學(xué)改變。證明As-Ⅳ對(duì)Iso 誘導(dǎo)的大鼠心肌梗死有保護(hù)作用，并表明As-Ⅳ對(duì)梗死心肌大鼠具有清除自由基、減輕脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的能力，通過(guò)清除自由基、減輕脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)產(chǎn)生心肌保護(hù)作用。

3As-Ⅳ可以改善心肌能量代謝

線粒體是細(xì)胞能量產(chǎn)生和供應(yīng)的主要場(chǎng)所，其生理功能依賴于內(nèi)膜的化學(xué)電勢(shì)，而這個(gè)化學(xué)電勢(shì)是由線粒體膜電位和pH梯度共同構(gòu)成，其中線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)的穩(wěn)定對(duì)于維持該化學(xué)電勢(shì)起主要作用，因此，MMP可以被單獨(dú)用來(lái)衡量線粒體的產(chǎn)能狀態(tài)。張晶等[15]觀察黃芪甲苷對(duì)大鼠腹主動(dòng)脈縮窄所致心肌肥厚的抑制作用及對(duì)心肌能量代謝的影響。使用腹主動(dòng)脈縮窄法制備大鼠心肌肥厚模型，40只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、黃芪甲苷高劑量組[5 mg/(kg·d)]和低劑量組[1 mg/(kg·d)]，術(shù)后1周開(kāi)始腹腔注射給藥，至12周后處死。檢測(cè)大鼠全心質(zhì)量指數(shù)(HMI)、左心質(zhì)量指數(shù)(LVMI)；取左心室組織進(jìn)行HE染色，測(cè)量細(xì)胞橫徑(TDM)；RT-PCR法檢測(cè)心肌組織心鈉素(atrial natriuretic peptide，ANP)mRNA的表達(dá)。紫外分光光度法檢測(cè)心肌組織中乳酸(IA)和游離脂肪酸(FFA)含有量；激光共聚焦顯微鏡定量檢測(cè)線粒體膜電位。結(jié)果：與假手術(shù)組相比，模型組HMI和LVMI顯著增加，左心室細(xì)胞橫徑增加29%，ANP mRNA的表達(dá)明顯上調(diào)；乳酸與游離脂肪酸含有量顯著升高，MMP下降了39%。與肥厚模型組相比，高劑量黃芪甲苷組大鼠心臟HMI、LVMI下降，TDM明顯降低，明顯下調(diào)ANP mRNA的表達(dá)；心肌組織乳酸與游離脂肪酸含有量顯著降低，心肌細(xì)胞MMP上升了60%。黃芪甲苷低劑量組各項(xiàng)指標(biāo)改變均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？傊?，高劑量的As-Ⅳ具有抑制心肌肥厚，改善心肌能量代謝的作用。

4As-Ⅳ可以抑制細(xì)胞凋亡

鐘飛等[16]探討黃芪甲苷對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的心肌損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制，雄性SD大鼠分3組：正常組、模型組和黃芪甲苷處理組；除正常組外，其余各組尾靜脈注射阿霉素2.5 mg/kg，隔天1次，共6次，黃芪甲苷處理組同時(shí)給予黃芪甲苷30 mg/kg，連續(xù)2周。2周后用BL-420E生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)采集心內(nèi)壓并分析心功能，檢測(cè)心肌組織MDA、SOD和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPX)活性。常規(guī)病理切片，光鏡觀察，western-blot檢測(cè)心肌組織死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白(Daxx)的表達(dá)。結(jié)果與正常組相比，模型組左室收縮壓(LVSP)、左室內(nèi)壓最大上升/下降速率(±dp/dtmax)、SOD和GPX活性下降，MDA含量和Daxx表達(dá)升高，病理結(jié)果顯示：模型組心肌細(xì)胞水腫，排列紊亂．纖維斷裂，呈灶性壞死。與模型組相比，黃芪甲苷處理組左室收縮壓(LVSP)、左室內(nèi)壓最大上升/下降速率、SOD和GPX活性升高，MDA含量和Daxx表達(dá)降低，病理結(jié)果顯示心肌組織變性壞死顯著減少。結(jié)論：黃芪甲苷能改善阿霉素心肌損傷大鼠的心功能，減輕其病理改變，其機(jī)制與其清除氧自由基、抑制細(xì)胞凋亡等作用有關(guān)。近期研究表明As-Ⅳ通過(guò)線粒體凋亡通路上PI3K/Akt信號(hào)通路的活化對(duì)心肌細(xì)胞凋亡起抑制作用。多柔比星(DOX)具有心臟毒性，線粒體介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡在DOX引導(dǎo)的心臟毒性中起決定性作用。DOX對(duì)心肌細(xì)胞的毒性可以通過(guò)增加Bax(促凋亡信號(hào))表達(dá)或抑制Bcl-2(抗凋亡信號(hào))表達(dá)來(lái)激活MAP[由于細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)過(guò)量和三磷酸腺苷(ATP)耗盡使Bax從細(xì)胞液移位至線粒體，激活而成]，這減少了Bcl-2與Bax的比例，導(dǎo)致了細(xì)胞色素(CytC)的釋放及隨后的Caspase-9與Caspase-3的激活。Jia等[17]研究黃芪甲苷對(duì)DOX引導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的作用，作用對(duì)象是原代培養(yǎng)的乳鼠。 免疫細(xì)胞化學(xué)和MTT分析：黃芪甲苷顯著改善DOX引導(dǎo)的心肌細(xì)胞的減少，并通過(guò)恢復(fù)搏動(dòng)細(xì)胞的比例和心肌細(xì)胞的搏動(dòng)頻率改善心功能。本質(zhì)上減少了線粒體ROS的產(chǎn)生及LDH、CK-MB、CytC的釋放。恢復(fù)了三磷酸腺苷ATP水平及SDH、ATP合酶活性(DOX引導(dǎo))。這些表明了黃芪甲苷顯著抑制了DOX引導(dǎo)的線粒體及其功能的破壞。進(jìn)一步研究表明：通過(guò)Hoechst 33258染色的定性分析和流式細(xì)胞術(shù)的定量分析，黃芪甲苷顯著減少了DOX引導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡率。 Western Blot分析表明：黃芪甲苷通過(guò)引導(dǎo)Akt和Bad的磷酸化顯著抑制線粒體凋亡通路的活性，從而恢復(fù)Bcl-2與Bax的比率，從而大大減少CytC的釋放及Caspase-9與Caspase-3的激活。而PI3K的抑制劑LY294002顯著抑制黃芪甲苷的抗凋亡作用。因此黃芪甲苷改善DOX引導(dǎo)的心臟毒性的作用必須依靠PI3K/Akt的活化。近期研究表明，As-Ⅳ通過(guò)暴露于低氧組織的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞上的PI3K/Akt通路，成為低氧誘導(dǎo)因子-1a(HIF-1a)和血管生成的一個(gè)新的調(diào)節(jié)器[18]。而As-Ⅳ通過(guò)上調(diào)HIF-1a對(duì)心肌細(xì)胞的凋亡起到抑制作用[19]。

5As-Ⅳ具有抗細(xì)胞毒性作用

心肌細(xì)胞閏盤超微結(jié)構(gòu)和連接蛋白43對(duì)心肌細(xì)胞有毒性損傷。姚志勇等[20]通過(guò)觀察急性染鎘對(duì)大鼠心肌細(xì)胞潤(rùn)盤超微結(jié)構(gòu)和連接蛋白43(Cx43)表達(dá)的影響，探討As-Ⅳ的保護(hù)機(jī)制。將SD大鼠隨機(jī)分為正常組、鎘處理組、鎘加As-Ⅳ處理組，取心室肌組織，分別作光鏡、透射電鏡觀察和免疫組化檢測(cè)。結(jié)果顯示與正常組相比，鎘組心肌細(xì)胞連接蛋白43的表達(dá)量明顯降低，心肌纖維和閏盤超微結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重；而鎘加As-Ⅳ組心肌細(xì)胞連接蛋白43的表達(dá)量較鎘組明顯增加，心肌纖維和閏盤超微結(jié)構(gòu)的損傷也明顯減輕。實(shí)驗(yàn)表明鎘能破壞心肌細(xì)胞閏盤超微結(jié)構(gòu)，影響連接蛋白43的表達(dá)及分布，而As-Ⅳ能在一定程度上拮抗心肌細(xì)胞閏盤超微結(jié)構(gòu)和連接蛋白43的毒性損傷。

綜上所述，As-Ⅳ在保護(hù)心肌細(xì)胞上起到明顯作用，且機(jī)制廣泛。對(duì)于As-Ⅳ的作用機(jī)制，可能還會(huì)有更多，對(duì)于As-Ⅳ抗細(xì)胞凋亡機(jī)制方面是近期研究的熱點(diǎn)。

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(本文編輯郭懷印)

(收稿日期：2015-11-19)

中圖分類號(hào)：R965R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

doi：10.3969/j.issn.1672-1349.2016.09.018

文章編號(hào)：1672-1349(2016)09-0980-04