基于LC-MS技術(shù)修飾核苷作為腫瘤標(biāo)志物的研究進(jìn)展

張劍英，徐笑紅

(浙江省腫瘤醫(yī)院 檢驗科，浙江 杭州 310022)

基于LC-MS技術(shù)修飾核苷作為腫瘤標(biāo)志物的研究進(jìn)展

張劍英Δ，徐笑紅

(浙江省腫瘤醫(yī)院 檢驗科，浙江 杭州 310022)

修飾核苷是RNA的代謝產(chǎn)物，目前認(rèn)為是一種廣譜的潛在腫瘤標(biāo)志物(tumor marker，TM)，在腫瘤患者尿液中排放量較正常人顯著升高。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)技術(shù)結(jié)合了色譜的高分離能力和質(zhì)譜的高選擇性、高靈敏度及能夠提供相對分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)點，已逐漸成為修飾核苷分析的的主要技術(shù)平臺之一。本文綜述了近年來LC-MS 技術(shù)在尿液修飾核苷分析方面的現(xiàn)狀與進(jìn)展，并對其發(fā)展前景進(jìn)行展望。

修飾核苷；腫瘤標(biāo)志物；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用； 綜述

腫瘤標(biāo)志物(tumor marker，TM)對腫瘤的早期診斷、預(yù)后判斷、治療指導(dǎo)及復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的監(jiān)測都有重要作用。 修飾核苷是RNA的代謝產(chǎn)物，屬于內(nèi)源性小分子，利用修飾核苷作為各種惡性腫瘤的潛在標(biāo)記物已成為近年來研究的熱點。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)技術(shù)不需要對樣品進(jìn)行衍生化預(yù)處理，經(jīng)濟(jì)實用，適用于熱不穩(wěn)定，不易揮發(fā)，不易衍生化的物質(zhì)。質(zhì)譜(mass spectrometry，MS)技術(shù)的多通道監(jiān)測功能與液相色譜(liquid chromatography，LC)技術(shù)的卓越分離能力，使LC-MS技術(shù)對檢測樣品的濃度和純度要求都很低，甚至對痕量物質(zhì)，也能通過優(yōu)化MS掃描模式，給出可視化響應(yīng)。因此，已經(jīng)成為尿液修飾核苷的定性定量分析的主要技術(shù)平臺。本文就近年來LC-MS 技術(shù)在尿液修飾核苷分析方面的現(xiàn)狀與進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 修飾核苷的來源和代謝

修飾核苷是機(jī)體RNA的代謝產(chǎn)物，是在轉(zhuǎn)錄后由多種特定的甲基轉(zhuǎn)移酶和連接酶作用于多聚核苷分子而形成的。例如：堿基甲基化，堿基乙基化[1]，碳?xì)滏I重排，尿苷移位等。RNA包含大量的修飾核苷，在已經(jīng)報道的100多種修飾核苷中，其化學(xué)修飾都需要特定的酶來完成的。修飾核苷是在正常核苷的基礎(chǔ)上進(jìn)行甲基化或其它的修飾，修飾的位置可能在糖苷鍵、糖羥基、堿基或者是堿基和糖羥基都被修飾，RNA修飾的位置是固定的，位置不正確的修飾核苷阻礙了細(xì)胞功能的正常的發(fā)揮。修飾核苷的獨特性決定了真核細(xì)胞的修飾需要100多種功能各異的酶來完成，其作用與維系自身結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)功能有關(guān)[2]。

在人和動物體內(nèi)，正常未被修飾的核苷可以在酶的作用下，被磷脂化后再利用形成新的RNA，或降解為尿酸和β-丙氨酸。修飾核苷結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)定，受外界影響因素少，既不能被磷酸酯化再利用也不易代謝，在尿中其排量恒定。在各種RNA中，轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸(tRNA)的含量最多(79種)[3]，因此尿中修飾核苷反映了有機(jī)體中tRNA的降解速率，進(jìn)而提示體內(nèi)細(xì)胞增殖情況。修飾核苷在正常成年人中排放恒定，幾乎不受性別、年齡、飲食的影響。而嬰兒和孕婦的排放水平較不穩(wěn)定，其中嬰兒體內(nèi)修飾核苷的排放量是成年人的6～10倍，可能與組織細(xì)胞的生長速度關(guān)系比較密切。此外，在一些疾病狀態(tài)下，例如炎癥性疾病、免疫性疾病，特別是泌尿系統(tǒng)感染時，尿液中修飾核苷的排放量會發(fā)生變化。

2 尿液修飾核苷作為腫瘤標(biāo)志物的研究

TM根據(jù)其生化屬性及生理功能大體上可分為蛋白類標(biāo)記物、基因類腫瘤標(biāo)記物和內(nèi)源性小分子類腫瘤標(biāo)志物。內(nèi)源性小分子是一種新型腫瘤標(biāo)志物，它們與機(jī)體代謝密不可分。RNA修飾核苷屬于內(nèi)源性小分子，尿中修飾核苷的排放水平可以反應(yīng)機(jī)體細(xì)胞RNA的代謝速度以及細(xì)胞的增值情況。正常成年人由于細(xì)胞增殖處于相對穩(wěn)定狀態(tài)，每天隨尿液排出的修飾核苷量也相對穩(wěn)定；腫瘤細(xì)胞的增值比正常細(xì)胞快,導(dǎo)致修飾核苷的產(chǎn)生和排出增多。惡性增殖是腫瘤細(xì)胞的共同特點，當(dāng)機(jī)體細(xì)胞發(fā)生癌變時，可以通過檢測尿中修飾核苷的含量，推測體內(nèi)是否存在腫瘤，而不受腫瘤的病理類型及分化程度的影響。腫瘤患者尿液RNA修飾核昔含量高于正常人，原因主要有2個方面：①惡性腫瘤的大量細(xì)胞處于旺盛生長狀態(tài)，核酸代謝及蛋白合成速度加快，RNA代謝加快，修飾核苷產(chǎn)生增多；②有研究認(rèn)為惡性腫瘤細(xì)胞中存在高活性的tRNA修飾酶[4]，可對正常結(jié)構(gòu)的tRNA進(jìn)行高度修飾產(chǎn)生異常tRNA，后者代謝過程中即可產(chǎn)生大量修飾核苷。

近年來的研究結(jié)果表明修飾核苷是一類非常有潛力的TM，在多種常見類型腫瘤患者尿液中排放水平較正常人顯著升高[5-7]。尿液修飾核苷具有其他TM所不具備的特征：①具有穩(wěn)固的分子結(jié)構(gòu)，不容易發(fā)生反應(yīng)和改變形態(tài)；②尿液樣本方便易得，具有無創(chuàng)性，可連續(xù)取樣，便于跟蹤監(jiān)測；③可識別的腫瘤譜系廣；④除了嬰兒和孕婦外，修飾核苷在正常成年人中排放恒定，幾乎不受性別、年齡、飲食的影響[8]。作為腫瘤篩查和診斷的手段，尿液修飾核苷可與蛋白類和基因類TM互補(bǔ)，補(bǔ)充這兩種標(biāo)記物腫瘤譜窄、腫瘤敏感性不高的不足，其臨床應(yīng)用前景廣闊。

3 LC-MS在尿液核苷檢測的應(yīng)用

目前，尿液修飾核苷的分析手段主要有免疫分析法、氣相色譜(gas chromatography，GC)法、高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)法、高效毛細(xì)管電泳(high-performance capillary electrophoresis，HPCE)法、和LC-MS等。免疫分析法尿中核苷組分和其他成分會發(fā)生交叉反應(yīng)，減少了定量分析的準(zhǔn)確度，且該技術(shù)無法一次實現(xiàn)大量核苷組分的測定；GC法由于受揮發(fā)性的限制,雖然經(jīng)過了化學(xué)衍生,也無法檢測到一些高度修飾的核苷；HPLC 法和HPCE法的定量檢測重現(xiàn)性較差。LC-MS技術(shù)不僅具有很高的靈敏度,而且具有廣泛的適應(yīng)性、選擇性和高通量的特點，可以對大量的修飾核苷進(jìn)行定性和定量,已逐漸成為修飾核苷分析的的主要技術(shù)平臺之一。

3.1 樣品采集和預(yù)處理 尿液標(biāo)本由于采集容易,對患者無創(chuàng)傷性,也不會產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，實驗中得到的數(shù)據(jù)比較可靠。首先需要采集足夠數(shù)量的樣本，從而有效減少源于尿液樣本個體差異對分析結(jié)果的影響，得到有統(tǒng)計學(xué)意義的分析數(shù)據(jù)。早期研究尿中修飾核苷需要收集24h尿液，現(xiàn)有的研究表明用“隨機(jī)尿樣”檢測，以核苷含量(nmol)/肌酐(μmol)作為標(biāo)準(zhǔn)可取得與24h尿樣一樣的結(jié)果，大大方便了核苷的檢測。當(dāng)分析的化合物在紫外線下不穩(wěn)定時，需要在尿液中加入抗氧化劑。此外，需要長期保持的標(biāo)本還需加入防腐劑。Rodriguez-Gonzalo等發(fā)現(xiàn)修飾核苷在長期的凍融循環(huán)條件下仍能保持穩(wěn)定性[9]。由于尿中多達(dá)上萬種化學(xué)物質(zhì), 核苷的含量很低,其他成分的干擾太多,無法直接對樣品進(jìn)行分析，需要對樣本進(jìn)行預(yù)處理。除了簡單的離心除去沉淀，最常用固相萃取(solid phase extraction，SPE)技術(shù)除去蛋白和鹽類。SPE技術(shù)具有污染小、回收率高、溶劑量小的優(yōu)點，目前已廣泛用于尿液核苷的分析。

在影響SPE效率的因素中，吸附劑的選擇是至關(guān)重要的影響因素。早期最常用PBA作為吸附劑來分離提取尿中核苷成分[10]，該材料為一種硅膠型吸附劑，含有苯硼酸官能團(tuán), 對順式二醇類化合物具有高的選擇性和分離富集功能,最大的缺點是對尿液中其他結(jié)構(gòu)核苷的提取有很大局限性。陽離子交換固相萃取能彌補(bǔ)這一缺陷，吸附劑含有硫酸官能團(tuán)，能萃取所有酸性含氮核苷。有研究發(fā)現(xiàn)，與PBA萃取小柱比較，利用 Oasis HLB(二乙烯基苯-N-乙烯基吡咯烷酮共聚物)萃取小柱能獲得更多種類的核苷，該類型吸附劑為適合于酸性，中性和堿性化合物的通用型吸附劑，已成為核苷提取的最重要的萃取吸附劑之一。除了上述離線萃取技術(shù)，在線樣品萃取技術(shù)結(jié)合高效液相色譜聯(lián)用的方法結(jié)合了二者的優(yōu)勢, 目前在修飾核苷的分析中得到了廣泛的應(yīng)用。Rodriguez-Gonzalo等利用N-乙烯基乙酰胺共聚物萃取小柱在線萃取，ZIC-HILIC 親水色譜串聯(lián)質(zhì)譜的方法檢測了核苷和脫氧核苷[9]。Tuytten等[11]同樣利用硼酸親和柱在線萃取、HILIC 親水色譜串聯(lián)質(zhì)譜的方法檢測了修飾核苷。在線SPE技術(shù)將萃取凈化和HPLC 和MS 分析結(jié)合用于樣品的直接分析，可以提高方法的重現(xiàn)性和靈敏度,減少人為干預(yù), 分析數(shù)據(jù)的質(zhì)量也會顯著提高。

3.2 基于LC-MS的數(shù)據(jù)采集 LC-MS 聯(lián)用技術(shù)由液相色譜、接口裝置、質(zhì)譜3大系統(tǒng)組成。要想實現(xiàn)LC 和MS 的聯(lián)用，接口裝置是關(guān)鍵。LC-MS離子源主要起到使化合物離子化的作用并作為液相和質(zhì)譜聯(lián)用的接口，主要有大氣壓離子源(atmospheric pressure ionization，API)、快原子轟擊源(fast atomic bombardment，F(xiàn)AB)和基質(zhì)輔助激光解析電離源(matrix assisted laser ionization source，MALDI)3種電離方式。其中API包括電噴霧電離(electrospray ionization，ESI)、大氣壓化學(xué)電離(atmospheric pressure chemical ionization，APCI)和大氣壓光電離(atmospheric-pressure Photoionization，APPI)3種離子源，這3種模式的樣品離子化都可以在大氣壓下的離子化室內(nèi)完成，離子化效率高，大大增強(qiáng)了分析的靈敏度和穩(wěn)定性[12]。在目前報道的尿液核苷的相關(guān)研究中，主要有FAB、MALDI和ESI 3種離子源，均為軟電離方式。其中ESI適用于從中等極性化合物到高極性化合物的大分子物質(zhì),是目前報道的核苷定量分析利用最多的離子化方式,可以很方便地與其他分離技術(shù)聯(lián)接，如液相色譜、毛細(xì)管電泳等，可方便地純化樣品用于質(zhì)譜分析。其主要優(yōu)點是：離子化效率高；離子化模式多，正負(fù)離子模式均可以分析；可與大流量的液相聯(lián)機(jī)使用；通過調(diào)節(jié)離子源電壓可以控制離子的斷裂，給出結(jié)構(gòu)信息。在修飾核苷的分析過程中，大多數(shù)報道都利用ESI正離子模式, ESI源的正離子模式產(chǎn)生的離子信號強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于負(fù)離子模式[13]。

質(zhì)量分析器是質(zhì)譜儀中最核心最重要的部分，按采集離子的原理可分為連續(xù)檢測離子的質(zhì)譜儀和脈沖式質(zhì)譜儀。所謂的連續(xù)檢測離子的質(zhì)譜儀則主要是通過掃描的方法去檢測連續(xù)生成的離子主要包括三重四級桿質(zhì)譜(triple quadrupole mass spectrometry，QqQ-MS)、磁質(zhì)譜等；脈沖式質(zhì)譜儀即是一類需要利用脈沖或門控形成離子,或者是采用離子注入等方式來檢測離子主要包括飛行時間質(zhì)譜(time of flight mass spectrometry，TOF-MS)、傅里葉變換回旋共振質(zhì)譜(fourier transform cyclotron resonance mass spectrometry，F(xiàn)TICR-MS)、離子阱質(zhì)譜(ion trap mass spectrometry，IT-MS)等。在修飾核苷的LC-MS分析中，常見的質(zhì)量分析器是QqQ-MS、TOF-MS以及IT-MS。最初，離子源的類型與分析儀的類型必須是匹配的，比如MALDI離子源只能與TOF分析儀連接。隨著分析技術(shù)的不斷發(fā)展，各種類型的離子源可以與不同類型的分析儀連接。Bond等[1]利用3種不同的方法分析尿液中修飾核苷：氣相色譜質(zhì)譜連用儀(GC/MS)、高效液相色譜離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀(HPLC/IT-MS)和毛細(xì)管液相色譜三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(CAPLC/QqQ-MS)。經(jīng)過比較發(fā)現(xiàn), GC/MS的靈敏度比HPLC/ITMS要低1個數(shù)量級。HPLC/IT-MS和CAPLC/QqQ-MS適合檢測脫氧、甲基化、乙?；男揎椇塑战M分,而且檢測到的核普種類也更多, CAPLC/QqQ-MS在測定某些特定的修飾核苷和定量分析尿液核苷的差異表達(dá)時靈敏度高于HPLC/IT-MS。Zhao等[10]利用在線的PBA聯(lián)用HPLC/TOF-MS與UPLC/TOF- MS分別對核苷進(jìn)行廓形分析，發(fā)現(xiàn)UPLC/TOF/MS分析儀的速度和色譜的準(zhǔn)確度都優(yōu)于HPLC/TOF/MS。

腫瘤患者體內(nèi)腫瘤特異性的tRNA高度修飾, 尿液修飾核苷的種類千變?nèi)f化,尿液中修飾核苷的結(jié)構(gòu)鑒定總是很困難，其中部分原因之一在于部分產(chǎn)物化學(xué)分子式相同而結(jié)構(gòu)不同，比如尿嘧啶和它的異構(gòu)體假尿嘧啶。隨著LC-MS聯(lián)用技術(shù)的不斷發(fā)展，至今已能準(zhǔn)確對部分核苷進(jìn)行鑒定。對有標(biāo)樣的修飾核苷，可通過比較測定核苷與標(biāo)樣核苷峰的保留時間、核苷的精確分子量以及MS/MS分析等進(jìn)行鑒定；對沒有標(biāo)樣的修飾核苷，可通過高分辨質(zhì)譜、二級質(zhì)譜的分析以及比較標(biāo)樣核苷裂解的規(guī)律等進(jìn)行鑒定。Bullinger等[14]利用LC/ESI-IT-MS分別在MS3及MS6中利用掃描監(jiān)測模式推導(dǎo)出了核苷代謝物的裂解方式，有4個修飾核苷首次得到了鑒定，它們是2-methylthio-N6-threonyl-carbamoyladenosine,5-methoxycarbonylomethyl-2-thiouridine,2-methylthio-N6-(cis-hydroxyisopentenyl)-adenosine and N6-methyl-N6-threonylcarbamoylo-adenosine。 Kammerer等[15]利用MALDI-TOFMS定性出多種核苷，利用LC/IT-MS得到16種核苷的碎片信息，并以此推導(dǎo)裂解方式。李華雨等[16]利用HPLC-ESI-Q-TOFMS技術(shù)準(zhǔn)確鑒定了9種有標(biāo)樣和17種無標(biāo)樣的修飾核苷。雖然各種聯(lián)用技術(shù)在使用過程中存在耗時的缺點，由于解決了修飾核苷的鑒定困難的難題，非常有利用價值。

4 LC-MS在修飾核苷作為TM的應(yīng)用研究

早在l960年，Adams等[17]在研究白血病患者嘌呤和嘧啶分泌水平時發(fā)現(xiàn)白血病患者尿中Pseu和m22G水平較正常人增高，認(rèn)為患者尿中的這兩項指標(biāo)可以作為白血病的腫瘤標(biāo)記物。此項研究激發(fā)了將修飾核苷作為TM的探索，修飾核苷作為具有潛力的TM近年來在代謝組學(xué)方面發(fā)展迅速，已發(fā)現(xiàn)對多種常見腫瘤的診斷、病情監(jiān)測以及了解療效和預(yù)后起到積極作用[13]，基于LC-MS技術(shù)在修飾核苷研究方面的獨特優(yōu)勢,已成為修飾核苷作為TM研究的主流技術(shù)。Hsu等[6]利用HPLC-ESI-Q-IT-MS技術(shù)發(fā)現(xiàn), 乳腺癌患者尿液中胞苷、3-甲基胞苷和次黃苷的排放水平較正常人顯著升高，discriminative power分別為58%，58%，62%，認(rèn)為上述3項核苷是乳腺癌的潛在TM，并建議聯(lián)合應(yīng)用多項的修飾核苷標(biāo)志物以提高乳腺癌的檢出率。Struck等[18 ]利用HPLC-ESI-QqQ-MS技術(shù)對泌尿生殖器腫瘤患者尿液中的12種修飾核苷進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)其中5種核苷(6-甲基腺苷、次黃嘌呤核苷、 2-甲基鳥苷、3-甲基尿苷和N2，N2-二甲基鳥苷)和健康人相比具有顯著性差異(P<0.05)。同樣，Daghir等[19]利用LC-MS/MS技術(shù)對12個修飾核苷進(jìn)行了定量分析，認(rèn)為2-甲基鳥苷和N2，N2-二甲基鳥苷可能是泌尿生殖器腫瘤的潛在TM。Hsu等[20]利用HPLC-MS/MS技術(shù)發(fā)現(xiàn)腺嘌呤核苷, 胞嘧啶核苷、 3-甲基嘧啶核苷、1-甲基腺苷、 次黃嘌呤核苷 和2-脫氧鳥嘌呤核苷是胃癌和結(jié)腸癌診斷的有用標(biāo)志物，聯(lián)合檢測有助于提高腫瘤的診斷率。Zhang等[21]利用HPLC/ESI-Q-TOF-MS技術(shù)在膀胱癌患者尿液中發(fā)現(xiàn)1-甲基腺苷和1-甲基次黃嘌呤核苷聯(lián)合檢測時敏感性和特異性分別為92.45%和87.50%?；颊咝g(shù)后尿液中2種核苷排放量較術(shù)前均顯著降低(P<0.01)；同時術(shù)后1年復(fù)發(fā)患者尿液中2種核苷排放量較未復(fù)發(fā)者顯著升高(P<0.01)，認(rèn)為1-甲基腺苷和1-甲基次黃嘌呤核苷可能是膀胱癌潛在的重要TM，在膀胱癌的診斷、治療以及預(yù)后過程中都具有一定意義。在結(jié)、直腸癌也有報道2種修飾核苷濃度與腫瘤患者預(yù)后相關(guān)。Seidel[5]等研究發(fā)現(xiàn)尿液修飾核苷可作為肺癌高危人群的篩查分子標(biāo)志物。另有學(xué)者報道部分尿液修飾核苷的排放水平可作為預(yù)測肺癌患者生存期的指標(biāo)。

5 展望

隨著LC-MS技術(shù)的發(fā)展，無論在核苷代謝產(chǎn)物的定性方面，還是差異代謝物的定量分析方面，LC-MS都有著顯著的優(yōu)勢和鮮明的特點，但其本身仍然具有很大的發(fā)展空間，且面臨著挑戰(zhàn)。首先，LC-MS技術(shù)雖然檢測靈敏度較高，但對痕量物質(zhì)的鑒定和精確定量,仍還存在不少困難；生物樣本間的個體差異導(dǎo)致了不同的基質(zhì)效應(yīng)，如何在復(fù)雜生物基質(zhì)條件下對核苷代謝物進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析也是面臨的挑戰(zhàn)之一；此外，目前LC-MS技術(shù)可供搜索用于確定化合物結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)庫尚有限，不能滿足所有復(fù)雜多樣核苷代謝物研究大的需要。未來將會有更多的新技術(shù)、新方法出現(xiàn)，相信LC-MS技術(shù)在修飾核苷作為TM的研究領(lǐng)域會不斷深入。

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[21] Zhang YR,Shi L,Tang DD,et al. Urinary modified nucleosides as novel biomarkers for diagnosis and prognostic monitoring of urothelial bladder cancer[J].Tumori,2014,100(6):660-666.

(編校：王冬梅)

Research progress of urinary modified nucleosides as tumor markers by LC/MSZ

HANG Jian-yingΔ, XU Xiao-hong

(Department of Clinical Laboratory, Zhejiang Cancer Hospital, Hangzhou 310022, China)

Modified nucleosides are the RNA metabolites,and are well known as potential marker in various types of cancer. They are mainly detected in urine wherein thier concertrations were found elevated in cancer patients. Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS) technique has been widely used in the field of modified nucleosides analysis, which can not only reach the point of high separating capacity of chromatography but also be provided with high selectivity, sensitivity, and relative molecular mass and structure information of mass spectrum.This review deals with the current status and future trends in the analysis of urinary modified nucleosides as tumor markers by LC-MS technique.

modified nucleosides; tumor marker; liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS); review

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃(2016KYA034)

張劍英，通信作者，女，碩士，主管技師，研究方向：腫瘤免疫，E-mail:951094@163.com。

R979.1

A

1005-1678(2016)02-0182-04