吳登攀,李鵬,林天宇，黃金蘭,景鑫,田新,廖冬燕,鐘振國

(1徐州醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，江蘇徐州221004；2韶關(guān)學(xué)院醫(yī)學(xué)院藥理教研室；3廣西中醫(yī)藥大學(xué))

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夜香樹95%乙醇提取物對(duì)小鼠肝癌細(xì)胞株H22增殖的抑制作用

吳登攀1,李鵬2,林天宇1，黃金蘭1,景鑫3,田新3,廖冬燕3,鐘振國3

(1徐州醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，江蘇徐州221004；2韶關(guān)學(xué)院醫(yī)學(xué)院藥理教研室；3廣西中醫(yī)藥大學(xué))

摘要：目的觀察夜香樹(CN)95%乙醇提取物對(duì)小鼠肝癌細(xì)胞株H22增殖的抑制作用。方法采用MTT法檢測(cè)5%、10%和20%濃度的CN 95%乙醇提取物含藥血清對(duì)小鼠肝癌細(xì)胞株H22細(xì)胞增殖的抑制作用,并進(jìn)一步采用集落形成法檢測(cè)20%濃度的CN 95%乙醇提取物含藥血清對(duì)H22細(xì)胞集落形成能力的影響，將CN 95%乙醇提取物按照低、中、高劑量(175、350、700 mg/kg)灌胃荷瘤小鼠,觀測(cè)其對(duì)小鼠瘤質(zhì)量的抑制率。結(jié)果10%和20%濃度的CN 95%乙醇提取物含藥血清較空白血清對(duì)小鼠肝癌細(xì)胞株H22細(xì)胞增殖的抑制作用強(qiáng)(P<0.05或<0.01),其中20%的含藥血清對(duì)細(xì)胞的抑制率為31.93%。加入20%濃度的CN 95%乙醇提取物含藥血清較空白血清的H22細(xì)胞的集落形成率低(P<0.01),加入含藥血清的細(xì)胞集落形成率為45.78%。中高劑量CN 95%乙醇提取物對(duì)荷瘤小鼠有一定抑制腫瘤生長作用,抑制率分別為22.39%和31.19%。結(jié)論 CN 95%乙醇提取物可抑制H22細(xì)胞增殖。

關(guān)鍵詞：夜香樹;抗腫瘤作用;肝癌細(xì)胞；細(xì)胞抑制

肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，以細(xì)胞毒性藥物為主的化療是目前中晚期肝癌主要的治療手段[1]。植物來源抗腫瘤藥物作用機(jī)制獨(dú)特、抗癌療效顯著,目前在臨床上已經(jīng)逐步占據(jù)了主導(dǎo)地位[2]。夜香樹(CN),又名夜來香,為茄科夜香樹屬植物。目前對(duì)CN的藥理學(xué)研究主要集中在局部麻醉、鎮(zhèn)痛、中樞抑制及抗糖尿病方面[3～6]，對(duì)其抗腫瘤作用方面的研究甚少。 本課題組發(fā)現(xiàn),CN花、葉及嫩枝正丁醇提取物具有良好的抗腫瘤活性[7～10]，CN葉和嫩枝的95%和50%乙醇混合提取物可顯著抑制人白血病L1210細(xì)胞增殖和肉瘤S180細(xì)胞荷瘤小鼠瘤體生長[11,12]。然而,CN 95%乙醇提取物對(duì)肝癌的治療作用尚未見相關(guān)報(bào)道。此外,若直接用CN乙醇總提取物進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn),由于給藥制劑較粗糙所致的諸多干擾因素可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性下降。因此,本實(shí)驗(yàn)通過體外實(shí)驗(yàn)探討CN 95%乙醇提取物含藥血清方法對(duì)小鼠肝癌細(xì)胞株H22細(xì)胞增殖的抑制作用,同時(shí)通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探討CN乙醇提取物對(duì)H22荷瘤小鼠瘤體生長的抑制作用。

1材料與方法

1.1材料昆明種健康小鼠共74只,18～22 g,雌雄各半,購自廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證號(hào):SCXK桂2003-0003)。小鼠肝癌細(xì)胞株H22購自廣西中醫(yī)藥研究所。四甲基噻唑藍(lán)(MTT,德國Sigma公司);新生牛血清(FCS,美國Hyclone公司);RPMI1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司);胰蛋白酶(Trypisn,天津市景洋生物制品有限責(zé)任公司);二甲基亞砜(DMSO,天津匯英化學(xué)試劑有限公司);環(huán)磷酰胺(CTX,江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)。CO2培養(yǎng)箱(Thermo Forma,美國,型號(hào):381);倒置熒光顯微鏡(Nikon,日本,型號(hào):TE2000-U);倒置顯微鏡(Olympus,日本,型號(hào):CK40)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)將凍存于液氮中的H22細(xì)胞株取出后迅速放入37 ℃水浴中使其在l min內(nèi)融化,無菌條件下將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)瓶中,同時(shí)加入5 mL含10% FCS的RPMI1640完全培養(yǎng)液,置CO2培養(yǎng)箱(100 mL/L CO2、37 ℃)中培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)時(shí)取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞。

1.2.2CN 95%乙醇提取物的制備CN葉及嫩枝采自廣西境內(nèi),經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室劉壽養(yǎng)教授鑒定為CN，其葉及嫩枝經(jīng)日曬干燥后粉粹,采用滲漉法得浸膏,浸膏用硅膠拌勻后,依次用石油醚、乙酸乙酯及水飽和正丁醇，最后用95%乙醇回流提取后得到浸膏,干燥后即為實(shí)驗(yàn)樣品。

1.2.3含CN 95%乙醇提取物血清的制備將16只小鼠隨機(jī)分為空白血清組、含藥血清組各8只。其中空白血清組灌胃生理鹽水,含藥血清組給予CN 95%乙醇提取物浸膏灌胃,給藥劑量及時(shí)間等根據(jù)王力倩等[13]提出參考公式和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定為600 mg/(kg·次),2次/d,連續(xù)5 d。末次給藥前禁食不禁水12 h,并于給藥后1.5 h摘眼球取血,靜置后離心分離血清,56 ℃滅活30 min,濾膜過濾。

1.2.4細(xì)胞抑制率檢測(cè)采用MTT法。取對(duì)數(shù)生長期的H22細(xì)胞用含10%FCS的完全RPMI1640培養(yǎng)液稀釋制成細(xì)胞懸液(1×105個(gè)/mL),接種于96孔培養(yǎng)板中,每孔加入200 μL,置37 ℃、100 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,離心,小心棄去舊培養(yǎng)液。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,10%濃度的CN含藥血清對(duì)H22細(xì)胞的抑制率為16.3%,且OD值與空白組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,所以本實(shí)驗(yàn)選用5%、10%和20%濃度的CN含藥血清進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)組加入200 μL含藥血清組小鼠血清的完全RPMI1640培養(yǎng)液,使其終濃度分別為20%、10%、5%,對(duì)照組加入200 μL空白血清組小鼠血清的完全RPMI1640培養(yǎng)液,使其終濃度分別為20%、10%、5%。每濃度設(shè)3個(gè)平行孔,置37 ℃、100 mL/L CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d后,棄去上清液,加入200 μL/孔新鮮配置的含0.2 mg/mL MTT的無血清培養(yǎng)液,37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h。4 h后棄上清夜,每孔加入200 μL DMSO,振蕩混勻后,用酶標(biāo)儀(波長為450 nm)測(cè)定OD值。按下列公式計(jì)算藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞生長的抑制率，抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組平均OD值/對(duì)照組平均OD值)×100%。

1.2.5細(xì)胞集落形成能力檢測(cè)采用集落形成法。采用半固體軟瓊脂集落培養(yǎng)法,取對(duì)數(shù)生長期的H22腫瘤細(xì)胞株1瓶,作活細(xì)胞計(jì)數(shù),觀察組在完全RPMI1640培養(yǎng)液中加入20%濃度的CN含藥血清,空白組則加入相應(yīng)濃度的空白血清,配成1 000個(gè)/mL的細(xì)胞懸液,使含藥血清以及空白血清濃度為20%,置37 ℃預(yù)溫。取35 mm培養(yǎng)皿,3個(gè)為一組,取在沸水中融化的5%瓊脂液1份,加入到9份含15% FCS的RPMI1640培養(yǎng)液中,搖勻后迅速加入到培養(yǎng)皿中,每個(gè)1 mL,混勻后,置室溫使瓊脂凝固。取預(yù)溫的細(xì)胞懸液按每9.4 mL加5%的瓊脂液0.6 mL的比例混勻,加到已鋪底層瓊脂的培養(yǎng)皿中,每個(gè)1 mL,置室溫使瓊脂凝固。蓋上培養(yǎng)皿蓋,置37 ℃、100 mL/L CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d,在顯微鏡下計(jì)數(shù)直徑大于75 μm(50個(gè)細(xì)胞以上)的集落。按下列公式計(jì)算集落形成率及抑制率:集落形成率(%)=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%;集落抑制率(%)=(1-觀察組克隆數(shù)/空白組克隆數(shù))×100%。

1.2.6H22細(xì)胞荷瘤模型建立及瘤質(zhì)量檢測(cè)取小鼠8只,在無菌條件下將H22細(xì)胞株與0.9%的生理鹽水以1∶3的比例稀釋后注入每只小鼠腹腔0.2 mL。觀察7～10 d見小鼠腹部漲大按之有波動(dòng)感時(shí)頸椎脫臼處死。小鼠腹部皮膚用碘酊、乙醇消毒后用無菌注射器抽吸腹水，腹水應(yīng)為乳白色的濃稠液體,若為黃色或含有大量紅細(xì)胞時(shí)則棄去不用。將腹水用無菌生理鹽水稀釋3倍制成瘤細(xì)胞懸液。取小鼠50只,將瘤細(xì)胞懸液接種于左前肢腋窩皮下,每只0.2 mL,整個(gè)接種過程應(yīng)在1 h內(nèi)完成。成功接種的荷瘤小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為5組,每組10只。治療組每日按照低、中、高劑量(175、350、700 mg/kg)灌胃給予CN 95%乙醇提取物浸膏,陽性對(duì)照組每日腹腔注射用生理鹽水稀釋的環(huán)磷酰胺20 mg/kg,陰性對(duì)照組每日用0.2 mL/10 g生理鹽水灌胃。連續(xù)給藥10 d,于第11天頸椎脫臼處死小鼠,剝離瘤塊并稱質(zhì)量。按下列公式計(jì)算腫瘤抑制率，瘤質(zhì)量抑制率(%)=[1-各實(shí)驗(yàn)組平均瘤質(zhì)量(g)/陰性對(duì)照組平均瘤質(zhì)量(g)]×100%。

2結(jié)果

5%、10%和20%濃度的CN 95%乙醇提取物含藥血清對(duì)小鼠肝癌細(xì)胞株H22的抑制率分別為7.32%、16.53%、31.93%，各組OD值見表1。觀察組、空白組集落形成率分別為28.50%±0.60%、52.57%±0.55%，兩組比較，P<0.01,觀察組集落抑制率為45.78%。CN 95%乙醇提取物對(duì)H22荷瘤小鼠瘤體生長的影響見表2。

表1　 不同濃度CN含藥血清對(duì)小鼠肝癌細(xì)胞

注：與對(duì)照組相比，aP<0.05,bP<0.01。

注：與陰性對(duì)照組相比，aP<0.05,bP<0.01。

3討論

治療中晚期肝癌的大多數(shù)細(xì)胞毒性藥物會(huì)產(chǎn)生耐藥[14]。因此,研發(fā)治療肝癌的新藥具有重要意義。從天然植物中篩選具有抗腫瘤活性的化合物是一種有效的發(fā)現(xiàn)新藥的方法[15]。然而,在藥物體外抗腫瘤活性篩選過程中,直接將待篩選的藥物加入細(xì)胞,以抑制腫瘤細(xì)胞增殖為活性指標(biāo)雖然是一種快速、經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便的藥物篩選方法,但對(duì)于成分尚不清楚的中藥或粗制劑而言,這種方法將直接降低抗腫瘤藥效篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。1988年日本學(xué)者田代真一首次提出“中藥血清藥理學(xué)”，這在一定程度上解決了這個(gè)問題?！爸兴幯逅幚韺W(xué)”是指將中藥或中藥復(fù)方經(jīng)口給動(dòng)物灌服一定時(shí)間后采集動(dòng)物血液,分離血清,用此含有藥物成分的血清進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)的一種實(shí)驗(yàn)方法[16]。該種方法可提高中藥藥效實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性[17]。

本實(shí)驗(yàn)采用血清藥理學(xué)的方法,按王力倩等[13]提出參考公式計(jì)算給予動(dòng)物的劑量,分離動(dòng)物血清,將不同濃度的含藥血清加入H22細(xì)胞,采用MTT法檢測(cè)CN 95%乙醇提取物含藥血清對(duì)細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明,CN含藥血清對(duì)H22細(xì)胞的增殖有抑制作用。隨后,采用集落形成法進(jìn)一步驗(yàn)證CN含藥血清對(duì)H22細(xì)胞增殖的抑制作用,觀察組集落形成率較空白組顯著降低,這說明CN含藥血清可抑制H22細(xì)胞集落形成。

為進(jìn)一步驗(yàn)證CN 95%乙醇提取物對(duì)H22細(xì)胞生長的抑制作用,我們進(jìn)行了荷瘤小鼠實(shí)驗(yàn)。一般來說,在實(shí)體瘤實(shí)驗(yàn)療效評(píng)價(jià)中,當(dāng)天然藥物對(duì)瘤體抑瘤率大于30%,并經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理有明顯差異,且連續(xù)3次療效穩(wěn)定,則說明藥物有一定的療效。本研究中高劑量CN 95%乙醇提取物浸膏對(duì)H22實(shí)體瘤的抑制率高達(dá)30%以上,且與陰性對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,這表明CN 95%乙醇提取物具有一定的抗腫瘤效果。

本實(shí)驗(yàn)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)均表明，CN 95%乙醇提取物對(duì)小鼠肝癌H22細(xì)胞增殖有抑制作用,但究竟CN 95%乙醇提取物中何種成分產(chǎn)生抗腫瘤作用以及機(jī)制是什么還需進(jìn)一步研究。

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收稿日期：(2015-09-02)

通信作者：鐘振國

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30160095);廣西科學(xué) (桂科青0991037)。

中圖分類號(hào)：R73

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2015)47-0028-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.47.010