劉越峰，羅衛(wèi)民，張勇，鐘曉東

(湖北醫(yī)藥學院附屬十堰市太和醫(yī)院，湖北十堰 442000)

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二烯丙基二硫對視網(wǎng)膜母細胞瘤Y79細胞生長、侵襲的影響及機制探討

劉越峰，羅衛(wèi)民，張勇，鐘曉東

(湖北醫(yī)藥學院附屬十堰市太和醫(yī)院，湖北十堰 442000)

摘要：目的觀察二烯丙基二硫(DADS)對視網(wǎng)膜母細胞瘤Y79細胞生長、侵襲的影響，并探討其機制。方法培養(yǎng)人視網(wǎng)膜母細胞瘤Y79細胞，分為miRNA陰性對照組(轉染40 μmol/L scramble)、miR-222M組(轉染40 μmol/L miR-222-mimics)、DADS陰性對照組(加入10 μmol/L DMSO)、DADS組(加入200 μmol/L DADS)、DADS+miR-222I組(轉染40 μmol/L miR-200b-inhibitors和200 μmol/L DADS)。采用qRT-PCR法檢測不同濃度DADS處理的Y79細胞中的miR-222，采用MTT法和Transwell侵襲實驗分別檢測各組細胞增殖和侵襲情況。結果0、25、50、100、200和400 μmol/L不同濃度的DADS處理的Y79細胞中的miR-222相對表達量分別為2.823±0.250、2.343±0.226、1.955±0.267、1.567±0.096、0.875±0.189、0.718±0.126。miRNA陰性對照組、miR-222M組、DADS陰性對照組、DADS組、DADS+miR-222I組Y79細胞OD570值分別為0.727±0.167、0.949±0.070、0.712±0.178、0.497±0.126、0.351±0.102，Transwell穿膜細胞數(shù)分別為128±8、179±16、127±12、76±8、45±14，miR-222M組、DADS組、DADS+miR-222I組分別與miRNA陰性對照組、DADS陰性對照組比較，DADS組與DADS+miR-222I組比較，P均<0.05。結論 DADS通過下調miR-222的表達抑制視網(wǎng)膜母細胞瘤Y79細胞的生長與侵襲。

關鍵詞：視網(wǎng)膜母細胞瘤；微小RNA 222；二烯丙基二硫；細胞增殖；細胞侵襲

二烯丙基二硫(DADS)為一種從大蒜中提取的天然有機硫化物。研究[1～6]表明DADS對多種腫瘤具有明顯的抑制作用，如胃癌、白血病、肺癌、乳腺癌等。DADS具體的抑癌機制與其能夠抑制DNA加合物及活性氧的形成、激活解毒致癌物的代謝酶、誘導腫瘤細胞凋亡、阻滯細胞周期等相關[7]。研究[8,9]發(fā)現(xiàn)，DADS能夠通過上調miR-200b和miR-22的表達，抑制胃癌細胞的增殖及誘導凋亡。miRNA-222在乳腺癌、胰腺癌、結腸癌、膀胱癌和膠質母細胞瘤等多種腫瘤中高表達[10,11]，可能是潛在的致癌因子。本研究觀察了DADS對視網(wǎng)膜母細胞瘤Y79細胞生長與侵襲的影響，并進一步探討其可能的機制。

1材料與方法

1.1材料Lipofectamine2000(Invitrogen公司，美國)；MTT(Sigma公司，美國)；Transwell小室(BD公司，美國)；miR-222 mimics、scramble和miR-222 inhibitor(Exiqon公司，丹麥)；RNA抽提試劑盒(Applied Biosystems公司，美國)。

1.2細胞培養(yǎng)人視網(wǎng)膜母細胞瘤Y79細胞(購自上海細胞研究所)培養(yǎng)于含10%新生胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下傳代培養(yǎng)，每1～2 d更換1次培養(yǎng)基，取對數(shù)生長期的細胞用于本實驗。

1.3細胞的DADS處理與分組將Y79細胞按1×104/孔的密度接種于6孔板。同時將相應miRNA分別與Lipofectamine2000結合后，轉染Y79細胞。轉染48 h后，收集細胞。實驗共分為miRNA陰性對照組(轉染40 μmol/L scramble)、miR-222M組(轉染40 μmol/L miR-222-mimics)、DADS陰性對照組(加入10 μmol/L DMSO)、DADS組(加入200 μmol/L DADS)、DADS+miR-222I組(轉染40 μmol/L miR-200b-inhibitors和200 μmol/L DADS)5組。

1.4細胞miR-222檢測方法采用qRT-PCR方法。用0、25、50、100、200和400 μmol/L不同濃度的DADS分別處理Y79細胞48 h。首先提取總RNA，逆轉錄cDNA，PCR反應體系擴增。20 μL反應體系中包括Taq DNA polymerase 0.2 μL(5 U/μL)，MiR-PCR primers 0.4 μL (5 μmol/L)，2×SYBR Mix 10 μL，miRNA RT product 2.0 μL和滅菌蒸餾水7.4 μL。其循環(huán)體系為95 ℃、3 min，95 ℃、12 s，62 ℃、35 s以及72 ℃、30 s，共35個循環(huán)。反應體系以U6作為內參，采用2-ΔΔCT法分析miR-222相對表達量。

1.5細胞增殖情況觀察采用MTT法。取1×103/孔對數(shù)生長期的各組細胞，用0.25%胰酶-EDTA消化，接種于96孔培養(yǎng)板，每組設5個復孔。細胞培養(yǎng)臨近飽和時，在每個時間點每孔加入5 g/L的MTT液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸出孔內培養(yǎng)液后，每孔加入150 μL DMSO液，酶標儀檢測各孔OD570值，以OD值表示細胞增殖情況，每組實驗重復3次，取平均值。

1.6細胞侵襲檢測方法采用Transwell小室法。細胞分組同1.3，鋪加適量的基質膠稀釋液在Transwell小室中，過夜成膜后，取出100 μL(1×105cells/mL)的細胞稀釋液接種到Transwell小室的上腔，在下腔中加入500 μL含10% FBS(胎牛血清)的RPMI1640培養(yǎng)液，放置到37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h后取出，將小室上層的細胞用棉簽擦棄，PBS緩沖液清洗，4%多聚甲醛固定，并用結晶祡染色，隨后PBS緩沖液清洗，倒置并晾干。在光學顯微鏡下觀察并攝像，隨機選取4個高倍視野來進行細胞計數(shù)，取平均值，每組實驗重復3次。

2結果

0、25、50、100、200和400 μmol/L不同濃度的DADS處理的Y79細胞中的miR-222相對表達量分別為2.823±0.250、2.343±0.226、1.955±0.267、1.567±0.096、0.875±0.189、0.718±0.126，后四種濃度與0 μmol/L的DADS比較，P<0.05或<0.01。各組Y79細胞增殖、細胞侵襲情況比較見表1。

表1　各組Y79細胞增殖、細胞侵襲情況比較±s)

注：與miRNA陰性對照組和DADS陰性對照組相比，*P<0.05，ΔP<0.01；與DADS組相比，#P<0.05。

3討論

視網(wǎng)膜母細胞瘤是常發(fā)病于兒童的眼部腫瘤，由于患兒年齡小，大多患者就診時已經發(fā)生了侵襲或者轉移，而視網(wǎng)膜母細胞瘤發(fā)生轉移或侵襲時治療效果不佳[12,13]。傳統(tǒng)的治療方法包括眼球摘除手術、冷凍或溫熱治療、放射或化學治療、光動力學治療、光凝固治療等。傳統(tǒng)的治療方法存在較大的不良反應，治療效果有限，且眼球摘除手術會永久性失去視力。因此，開發(fā)安全高效低毒便捷的抗癌藥物成為當務之急。

miRNA是一類長度為19～25個核苷酸的內源性單鏈非編碼RNA分子，miRNA通過與其靶基因的3′-非編碼區(qū)完全或不完全配對，使翻譯抑制或靶mRNA降解，在轉錄后水平對靶基因的表達進行調控[8]。通過這種方式，miRNA可以對細胞的增殖、分裂、分化和調亡等進行調控，在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用。據(jù)報道，DADS可呈時間和劑量依賴性地抑制胃癌細胞的增殖和侵襲，通過miRNA芯片技術，篩選出DADS處理后的人胃癌細胞中差異表達的miRNA，分別經DADS處理較經DMSO對照處理的胃癌細胞中miR-222的表達下調[9]。本研究從miRNA層面來探討DADS的抑瘤機制，我們用不同濃度的DADS處理Y79細胞，提取總RNA后檢測miR-222的表達量，結果顯示隨著DADS劑量的增加，視網(wǎng)膜母細胞瘤Y79細胞中miR-222的表達量逐漸降低，即DADS可下調Y79細胞中miR-222的表達水平，并且呈劑量依賴性關系。且本研究結果顯示，DADS處理的細胞的增殖能力明顯降低，miR-222抑制劑和DADS共同處理的細胞的增殖能力降低最為顯著，即DADS能夠通過下調miR-222抑制Y79細胞增殖。且DADS處理的細胞穿膜數(shù)明顯減少，miR-22抑制劑和DADS共同處理的細胞穿膜數(shù)減少最為顯著，即DADS能夠通過下調miR-222抑制Y79細胞侵襲。提示DADS可通過下調miR-222的表達水平來抑制視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞的生長與侵襲。

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Effects of diallyl disulfide on proliferation and invasion of

retinoblastoma cells Y79 and the mechanism

LIUYue-feng,LUOWei-min,ZHANGYong,ZHONGXiao-dong

(1TaiheHospitalofShiyanAffiliatedtoHubeiUniversityofMedicine,Shiyan442000,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of diallyl disulfide (DADS) on proliferation and invasion of retinoblastoma cells Y79 and to investigate the mechanism. MethodsThe retinoblastoma cells Y79 were cultured and divided into the miRNA negative control group (tansfected by 40 μmol/L scramble), miR-222 group (tansfected by 40 μmol/L miR-222-mimics), DADS negative control group (added with 10 μmol/L DMSO) and DADS group (added with 200 μmol/L DADS) and DADS +miR-222I group (transfected by 40 μmol/L miR-200b-inhibitors+200 μmol/L DADS).

十堰市科學技術研究與開發(fā)項目計劃(14Y40)。

The expression of miR-222 treated by different concentrations of DADS in Y79 cells was detected by qRT-PCR. The proliferation and invasion of retinoblastoma cells Y79 in vitro were determined with MTT and Transwell invasion assay. ResultsThe miR-222 expression of Y79 cells treated with 0, 25, 50, 100, 200 and 400 μmol/L DADS was 2.823±0.250, 2.343±0.226, 1.955±0.267, 1.567±0.096, 0.875±0.189 and 0.718±0.126, respectively. The OD570of miR-222 was respectively 0.727±0.167, 0.949±0.070, 0.712±0.178, 0.497±0.126 and 0.351±0.102 in the miRNA negative control group, miR-222M group, DADS negative control group, DADS group and DADS+miR-222I group. Transwell invasion assay results showed that the number of cells permeating the matrigel significantly decreased to 128±8, 179±16, 127±12, 76±8 and 45±14. Significant difference was respectively found between the miR-222M group, DADS group, DADS+miR-222I group and the miRNA negative control group and DADS negative control group (allP<0. 05).ConclusionDADS can inhibit the proliferation and invasion of retinoblastoma cells Y79 by down-regulating the expression of miR-222.

Key words:retinoblastoma; microRNA-222; diallyl disulfide; cell proliferation; cell invasion

收稿日期：(2015-09-06)

通信作者：羅衛(wèi)民

基金項目：湖北省教育廳科學研究計劃指導性項目(B2015477)；

中圖分類號：R739.7

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2015)47-0033-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.47.012