何文姬　孫幫燕　張　楨*．昆明市兒童醫(yī)院心臟功能科，云南　昆明　65008．昆明醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院/昆明市兒童醫(yī)院中心實驗室，云南　昆明　65008

超高效液相法測定卡馬西平和苯妥英鈉血藥濃度及其臨床應用

何文姬1孫幫燕2張楨2*
1．昆明市兒童醫(yī)院心臟功能科，云南昆明650028
2．昆明醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院/昆明市兒童醫(yī)院中心實驗室，云南昆明650028

【摘要】目的:在兒科臨床上建立一種快速、準確測定癲癇患兒血漿中卡馬西平(Carbamazepine，CBZ)和苯妥英鈉(Phenytoin，PT)濃度超高液相(Ultra performance liquid chromatography，UPLC)方法，并觀察藥物濃度與不良反應。方法:收集癲癇患兒的超聲肝臟檢查和實驗室檢查資料。UPLC方法:取患兒血漿200μl，加入乙酸乙酯1.0 ml，渦旋1 min，室溫高速離心7 min(12 000×g)，取上清液700 μl吹干后，100 μl甲醇復溶進樣分析;色譜條件為BEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm，1.7μm; Waters公司)，0.3 ml·min－1的流速，甲醇－1%三氟乙酸水溶液(45∶55，v/v)，30℃的柱溫，2 μl的進樣量，254 nm檢測波長。結果:血漿中CBZ和PT色譜峰分離良好，無干擾，曲線為y =39589x +15280，R2=0.9991(CBZ); y =3739.5x +3073.5，R2= 0.9996(PT)，回收率均在90%～117%;超聲檢查和實驗室檢查顯示正常，無造血及消化系統(tǒng)不良反應。結論:本法操作簡便，適用于臨床工作中，患兒血漿的CBZ、PT濃度快速監(jiān)測。

【關鍵詞】卡馬西平;苯妥英鈉; UPLC;血藥濃度

通讀作者:張楨

癲癇是中國神經系統(tǒng)疾病中僅次于腦血管疾病的第二大頑癥，也是一種由多種原因引起的慢性、反復發(fā)作神經系統(tǒng)常見疾病，藥物控制仍是當前主要的治療手段[1]。CBZ是一種優(yōu)秀的抗癲癇藥物; PT是治療癲癇大發(fā)作和局限性發(fā)作的首選藥物。但由于二者具有自身誘導作用，體內處置過程復雜，治療劑量范圍窄(CBZ和PT有效濃度范圍分別為4～12和10～20μg/mL)，療效及毒性與血藥濃度關系密切，且患者間個體差異很大，長期服用不良反應較多，易產生耐藥性，因此對其體內血藥濃度進行監(jiān)測十分必要[2]。監(jiān)測方法有高效液相法、熒光偏免疫法及酶增強免疫法。免疫法操作簡單，但試劑價格昂貴，專一性差。HPLC準確、專屬性強、重現性好，可同時測定多種藥物及其代謝產物[3]。本文建立了UPLC法測定CBZ和PT血藥濃度方法，并調查統(tǒng)計其在兒科臨床應用情況，觀察藥物對兒童是否產生不良反應。

1　UPLC法測定藥物濃度含量方法建立

1.1儀器、試劑和色譜條件

1.1.1儀器、試劑Waters－ACQUITY－UPLC超高效液相色譜儀(Waters，美國); Empower數據處理系統(tǒng); Sartorius BT125D電子天平(德國賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司); MULTIFUGE X1R超高速離心機(Thermo公司，美國); XW－80A渦旋混合器(上海醫(yī)科大學儀器廠); CBZ對照品(美國sigma公司，批號: 344360050); PT(中國藥品生物制品檢定所，批號: 100138－200603);甲醇:色譜純(美國Fisher公司);水:自制超純水(水機，英國PURELAB ELGA公司)。

1.1.2色譜條件色譜柱為BEH C18柱(50 mm×2.1 mm，1.7μm; Waters公司);流速為0.3 ml·min－1;流動相為甲醇－1%三氟乙酸水溶液(45∶55，v/v);柱溫為30℃;進樣量: 2 μl;檢測波長為254 nm。

1.2樣品測定

1.2.1儲備液的配制取CBZ對照品2.5 mg和PT5.0 mg，精密稱定，置5ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得濃度為500(CBZ)和1000(PT)mg·L－1的儲備液。

1.2.2血樣預處理取血漿200μl，加入乙酸乙酯1.0 ml，渦旋1 min，高速離心7 min(12000×g)，取上清液700 μl，吹干后，100 μl甲醇復溶，2μl進樣分析。

1.3線性關系和線性范圍取空白血漿160 μl共10份，分別加入40 μl不同濃度CBZ和PT，配成濃度為0.5、2.5、5、10、20、40μg/ml和1、5、10、20、40、80μg/mL溶液，按“3.2血樣預處理”操作，以濃度與峰面積作線性回歸，得標準曲線方程(CBZ為y = 39589x + 15280，R2= 0.9991; PT為y =3739.5x +3073.5，R2=0.9996)。CBZ在0.5～40μg/ml濃度線性關系良好，PT在1～40μg/ml線性關系良好。CBZ和PT最低檢出限分別為0.1、0.21μg/ml。

1.4方法專屬性CBZ和PT色譜峰不受血漿中內源性物質的干擾，見圖1－2。

圖2　標準品經“3.2”處理后濃度為8μg/ml CBZ(保留時間為3.940min)和6μg/ml PT(保留時間為3.328min)色譜圖。

1.5回收率實驗標本加入0.5～2倍標準品后，按3.2處理，計算回收率，結果見表1。實驗室數據與正常兒童參考值比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，詳見表2。

表1　方法回收率統(tǒng)計表

表2　實驗室數據與正常兒童參考值比較(±s)

表2　實驗室數據與正常兒童參考值比較(±s)

CBZ正常組　CBZ小于有效濃度下限組CBZ大于有效上限組　PT正常組　PT小于有效濃度下限組PT大于有效上限組正常兒童參考值總膽紅素(μmol/mL)　10.7±2.5　11.0±2.0　12.2±1.5　10.1±2.1　11.0±2.3　12.2±1.5　3.4～17.7直接膽紅素(μmol/mL)　2.0±0.5　1.7±0.4　1.5±0.27　2.1±0.4　1.9±0.45　1.6±0.3　0～3.4血小板(109/L)　217±70　202±60　230±50　217±71　202±62　230±55　100～300白細胞數(109/L)　7.0±1.5　6.2±1.7　6.2±1.7　5.3±0.9　6.5±1.7　6.7±2.3　4～10

1.6穩(wěn)定性實驗

1.6.1儲備液穩(wěn)定性考察儲備液4℃冷藏保存，分別在1、3、5、7、60d后，配制標準使用液4、50μg/ml直接進樣測定，峰面積RSD低于7%，表明儲備液至少在60d穩(wěn)定。

1.6.2血樣穩(wěn)定性考察分別配制高中低濃度的標本，－20℃冷凍保存，分別在0、12、24、36h測定，峰面積RSD均低于10%。

2　臨床應用與結果統(tǒng)計

2.1標本收集收集昆明醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院(昆明市兒童醫(yī)院)2011.4～2013.4癲癇患兒1667例癲癇患兒，有150例服用CBZ(包括與丙戊酸聯(lián)合用藥31例)，PT為37例?；純貉帩舛冗_穩(wěn)態(tài)濃度后，采集樣本，按3.2測定。

2.2統(tǒng)計學方法采用SPSS12.0軟件對數據進行處理。收集白細胞數、血小板、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、和膽紅素[2]數據，部分結果以(±s)表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2.3結果血漿中藥物濃度: CBZ在1～17.0μg/ml，PT 在3～24.0μg/ml;各組實驗室指標中谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶值均在正常范圍，其它各項實驗室指標與正常兒童參考值P均大于0.05(表1);超聲波檢查，患兒肝臟形態(tài)大小正常，包膜完整，肝實質回聲均勻，肝血管清晰可見，其內未見異?；芈?患兒也未出現血液系統(tǒng)及消化系統(tǒng)不良反應。

3　討論

3.1UPLC方法色譜條件參考抗癲癇藥物HPLC[2－5]的色譜條件，都不能得到滿意的UPLC色譜圖，減小流動相的極性(減少甲醇比例)，二者分離度增加，但PT的色譜峰拖尾，在流動相水中加入酸后，色譜峰有所改善，最終確定流動相為甲醇－1%三氟乙酸水溶液(45∶55)。在本文中，UPLC色譜條件與文獻報道的HPLC色譜條件不大一致可能的原因是二者C18色譜柱填料顆粒粒徑大小不同。

3.2單個樣本采集量因兒童采血較成人困難，最終確定單個樣本量(血漿)為200 μl，可以獲得理想色譜峰，且采血量易被家長接受，可長期配合醫(yī)生開展治療藥物濃度監(jiān)測。

3.3癲癇藥物臨床應用統(tǒng)計收集1667例癲癇患兒樣本中，只有150例服用CBZ(包括與丙戊酸聯(lián)合用藥31例)，PT為37例?？赡芘c下面因素有關:①與治療藥物有效血藥度范圍寬窄和藥物副作用有關，如CBZ和PT比丙戊酸范圍要窄得多，故大部分醫(yī)生和家長選擇丙戊酸，以便于更好控制患兒服藥劑量;②類似藥物心理效應[6]，“家長藥物心理效應”影響癲癇患兒長期用藥的種類，如在家長配合醫(yī)生治療孩子癲癇疾病時，給孩子用藥易受到外界暗示(受到醫(yī)生、網絡、廣告和書籍等)，相對于CBZ和PT，家長對丙戊酸治療癲癇更有藥物認同感和更愿意選擇丙戊酸治療孩子疾病。

3.4實驗室檢查和超聲檢查均未見報道不良反應[2]，可能與樣本量小有關。

參考文獻

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[2]印曉星．治療藥物監(jiān)測[M]．北京:人民軍醫(yī)出版社，2011: 170 －201．

[3]程振田，郭瑞臣，王本杰，等．HPLC測定人血清苯巴比妥卡馬西平、苯妥英鈉濃度及其與FPIA法測定結果的比較[J]．中國藥學雜志，2008，43(12): 950－954．

[4]樊鵬程，馬駿，賈正平，等．在線柱切換RP－HPLC測定人血清中卡馬西平濃度[J]．藥物分析雜志，2008，28(12): 2033－2035．

[5]Steins LSW，Bouw J，Weide J．Evaluation of fluorescence polarization assays for measuring valproic acid，phenytoin，carbamazepine and Phenobarbital in serum [J]．The Drug Moit，2002，24(3): 432－435．

[6]趙蘭民，楊春．藥物的心理效應與臨床應用[J]．臨床身心疾病雜志，2007，13(1): 69－70．

收稿日期:( 2014.11.12)

基金項目:云南省高層次衛(wèi)生技術人才培養(yǎng)(計劃編號: D－201254)。

【文章編號】1007－8517(2015)03－0025－03

【文獻標志碼】A

【中圖分類號】R748