張　旭,丁　隆

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院普外二科,黑龍江 佳木斯154003)

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低分子肝素和肝素鈉對大鼠切除術后肝再生情況影響①

張旭,丁隆

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院普外二科,黑龍江 佳木斯154003)

摘要：目的：觀察低分子肝素和肝素鈉對于肝再生情況及肝再生終止因子TGF-β1在大鼠肝再生的表達及其與肝再生的關系。方法:選取正常的清潔級雄性Wistar大鼠50只，隨機分成5組，每組10只。5組均為切除50%肝葉的大鼠，肝切除術后3h，A組為對照組(生理鹽水注射)，B組為給予肝素鈉(1000U/kg)，C組為皮下注射肝素(1000U/kg)，D組為給予肝素+TGF-β抑制劑，E組為給予肝素+TGF-β激動劑。于術后3d、5d、7d各組分別隨機選擇7只解剖，取其肝臟并秤取肝臟重量并計算肝再生速率，采用流式細胞儀方法分析計算肝細胞再生指數(shù)，術后免疫組織化學檢測各組增殖細胞核抗原PCNA，RT-PCR檢測TGF-β的表達。結果: 5組大鼠于術后第3天、5天、7天后肝再生速率和肝細胞再生指數(shù)比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，通過比較分析顯示，B組、C組和D組均高于A組(P<0.05)，A組和E組無差異(P>0.05)。結論:肝素鈉和低分子肝素均可促進大鼠50%肝切除術后肝再生，通過抑制HGF信號通路細胞進展期TGF-β的作用，影響肝再生，提高肝細胞再生指數(shù)，兩者促進肝再生有待于進一步研究。

關鍵詞：低分子肝素;肝素鈉;肝再生;TGF-β

在臨床治療上，肝素鈉和低分子肝素廣泛用于預防血栓形成和栓塞性疾病及各種原因引起的彌散性血管內凝血的治療，也用于其他操作的處理，如血液標本和器械的抗凝處理，血液透析、體外循環(huán)、導管術等操作的應用。既往研究證實，低分子肝素和肝素鈉能夠促進肝再生，本文對其是否能夠促進肝再生進行了研究。肝再生涉及細胞結構功能重建等一系列生理生化活動，其中包括細胞激活、增殖及其調控。在肝再生中起到重要作用的是肝臟的主要實質細胞—肝細胞，大約占肝臟細胞總數(shù)的65%、總肝量的70%~80%。本次試驗研究肝素鈉和低分子肝素對大鼠切除術后肝再生率，探討肝素鈉和低分子肝素對肝再生指數(shù)的提高?，F(xiàn)將結果報道如下。

1　材料與方法

1.1動物模型制作及分組

實驗動物選用正常清潔級雄性Wistar大鼠50只，體重為230~290g，由佳木斯大學動物實驗中心提供。大鼠肝切除術前在較恒定的環(huán)境中選用固定食料喂養(yǎng)，自由進食水。手術前禁食不禁水。所有手術動物均在相對無菌條件下，乙醚開放吸入麻醉，盡量在上午8~12點同一個時間手術。按照Higgins法行肝切除術，即切除尾狀葉、左側葉，約占肝臟的50%。在手術后不同時期(3d、5d、7d)三組大鼠各組分別有一定數(shù)量動物被殺死，將Wistar大鼠50只隨機分成5組，即A、B、C、D、E組，每組10只。5組均為切除50%肝葉的大鼠，肝切除術后3h，A組為對照組(生理鹽水注射)，B組為給予肝素鈉(1000U/kg)，C組為皮下注射肝素(1000U/kg)，D組為給予肝素+TGF-β抑制劑，E組為給予肝素+TGF-β激動劑。

1.2實驗指標檢測

于術后3d、5d、7d各組分別隨機選擇7只解剖，獲取標本進行相關指標檢測：

1.2.1肝臟再生速率評估：依據(jù)公式為X=(W2-W1) /W1，計算肝再生速率，其中W1為肝切除術后剩余肝重，W2為處死時肝重。

1.2.2肝細胞再生指數(shù)(PI)：用眼科剪在大鼠處死后立即取左中葉，機械法制作取得肝臟單細胞懸液，在倒置顯微鏡下調整細胞數(shù)為1×105/mL，染色后應用流式細胞儀計算肝細胞再生指數(shù)。

1.2.3免疫組織化學法檢測各組增殖細胞核抗原PCNA。

1.2.4RT-PCR檢測TGF-βmRNA的表達

(1)Trizol法提取肝臟組織總RNA (2)將提取的RNA適當稀釋后,分光光度計260nm測定RNA的濃度、分光光度計測A260/A280比值測定RNA的純度(l.8~2.2),甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳觀察RNA完整性。所有RNA樣品置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

引物設計：

TGF-β1 F 5’-TGG CGT TAC CTT GGT AAC C-3’

R 5’-GGT GTT GAG CCC TTT CCA G-3’

β-actin F 5’-ACC CTT AAG GCC AAC CGT GAA AAG-3’

R 5’-TCA TGA GGT AGT CTG TCA GGT-3’

采用熒光定量PCR儀進行mRNA定量檢測,反應條件為:94℃205,60℃40s,擴增40個循環(huán)。目的基因RNA相對表達量采用2△ct表示,即目的基因△Ct=靶基因Ct-β-actinCt, △△Ct=△Ct—平均△Ct,相對表達量為2-平均△ct 。

1.3統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件包處理，計量資料用“均數(shù)±標準差”表示，組間比較采用方差分析，以α=0.05作為檢驗水準，P<0.05差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1各組大鼠肝再生速率

于術后第3天、5天、7天后三組大鼠肝再生速率比較差異均有統(tǒng)計學意義，通過比較分析顯示，B組、C組和D組均高于A組(P<0.05)，A組和E組無差異(P>0.05)。見表1。

表1　各組大鼠肝再生速率比較±s)

分組3d5d7dA組26.5±4.123.9±3.917.2±4.4B組52.7±3.249.3±4.347.3±3.5C組52.8±3.650.2±3.848.6±3.6D組53.9±3.850.5±3.949.5±4.2E組27.6±3.824.2±5.218.1±3.8t值5.88116.02574.2535P<0.05<0.05<0.05

2.2各組大鼠肝細胞再生指數(shù)

于術后第3天、5天、7天后三組大鼠肝細胞再生指數(shù)比較差異均有統(tǒng)計學意義，通過比較分析顯示，B組、C組和D組均高于A組(P<0.05)，A組和E組無差異(P>0.05)。見表2。

表2　各組大鼠肝細胞再生指數(shù)比較±s)

分組3d5d7dA組35.3±4.241.6±4.549.3±4.3B組59.5±6.968.8±5.384.6±6.2C組61.3±4.871.4±5.586.1±5.9D組61.6±5.472.6±4.986.2±6.0E組36.4±4.441.4±4.848.6±4.6t值5.83296.34094.1199P<0.05<0.05<0.05

2.3免疫組織化學檢測各組增殖細胞核抗原PCNA

各實驗組分別于術后3、5、7天行肝穿肝組織，用10%中性福爾馬林固定, 進行免疫組織化學檢測，檢測方法按照說明書進行。免疫組化陽性結果判定標準：PCNA 以細胞核呈界限清楚的棕色反應為陽性，B、C、D組以細胞漿中出現(xiàn)明顯的棕色反應為陽性。見圖1~3。

圖1對照組

圖2　肝素+TGF-β抑制劑

圖3　免疫組織化學檢測各組增值細胞核抗原PCNA

2.4RT-PCR檢測TGF-β1mRNA的表達

見圖4。

圖4　大鼠肝細胞TGF-β1 PCR產物電泳圖

4　討論

在臨床活體肝移植術中，通常用普通肝素、低分子肝素鈉和低分子肝素鈣等藥物做早期預防及治療肝動脈血栓的形成，本文主要探討體內注射普通肝素對移植肝或供體殘肝肝再生的相關影響,以及肝再生終止因子TGF-β1在肝再生中的表達及其與肝再生的關系。參考國外文獻所述，肝素對肝再生的影響觀點尚不一致，早在1996年，Kunio M[1]等報道，體外培養(yǎng)的細胞，如成纖維細胞、臍靜脈內皮細胞等受到肝素刺激后，能使分泌的肝細胞生長素(HG)升高，高出3~6倍，與劑量有密切關系，而且大鼠血循環(huán)中的HGF水平與以往相比較，亦往高出2~2.5倍，但卻無法促進體外原代培養(yǎng)中肝細胞的DNA合成。基于上述情況，本實驗探討在臨床活體實驗中，肝素是否能夠促進肝再生進行研究。為避免再生節(jié)律對肝再生的影響，保證每天14時以前切除大鼠50%肝臟，建立肝損傷后再生模型。于術后3h給予肝素鈉和低分子肝素，目的是避免肝斷面出血。有學者報道[2,3]腹膜注射給予肝素效果優(yōu)越，而我們?yōu)榱吮苊饬硕啻胃骨蛔⑸鋾p傷腸道及腔靜脈，選擇皮下給藥。我們實驗結果顯示，肝素鈉和低分子肝素在肝切除術后早中期對肝再生有明顯的促進作用。而給予肝素鈉和低分子肝素后大鼠肝再生速率無差異，通過實驗數(shù)據(jù)可以看出給予低分子肝素后肝再生率略高于肝素鈉。

肝再生大體可分為三個階段，啟動階段：G0-G1期；增殖階段：G1-S期；終止階段：G1-G0期。肝細胞再生不同于各種干細胞增殖，當干細胞受到增殖信號刺激時可直接進行DNA合成和細胞分裂，而肝細胞增殖需要已成熟分化的肝細胞重新活化，才能啟動后續(xù)的增殖過程，即肝細胞由細胞周期的G0期轉化至G1期。TGF-β1可以抑制肝細胞進入G1期，血清TGF--β1濃度可以影響HGF調節(jié)肝再生，維持肝切除后的內環(huán)境穩(wěn)定。TGF-β1被認為是肝再生過程從增生階段進入終止階段的重要因子[5]。阻斷TGF-β1表達的作用可以促進肝細胞增殖。本實驗研究低分子肝素和肝素鈉是通過阻斷TGF-β1的表達，TGF-β1mRNA的表達下降，從而促進肝再生。而使用TGF-β1激動劑后，TGF-β1對肝再生有抑制作用，因此可以推測肝素和肝素鈉是通過抑制TGF-β因子影響肝再生的。香港Li等[6]發(fā)現(xiàn)對切除70%肝臟的大鼠，肝素對其肝再生無明顯影響，且對肝功能恢復亦無促進作用。原因可能是切除70%肝臟的大鼠創(chuàng)傷太大，影響大鼠的肝再生，本次研究發(fā)現(xiàn)，肝素鈉和低分子肝素均可促進大鼠50%肝切除術后肝再生，通過抑制HGF信號通路細胞進展期TGF-β的作用，影響肝再生，提高肝細胞再生指數(shù)， 肝素和肝素鈉是通過抑制TGF-β因子影響肝再生的。

綜上，本實驗初步結果顯示肝素鈉和低分子肝素均可促進大鼠50%肝切除術后肝再生，通過抑制HGF信號通路細胞進展期TGF-β1的作用，影響肝再生，增加肝細胞再生指數(shù)，兩者促進肝再生效果有待于進一步研究。

參考文獻:

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[6]張玉萍, 侯霞, 江清林, 等. Surviv in基因在肝組織、肝硬化和肝癌中的表達及其臨床意義 [ J]. 黑龍江醫(yī)藥科學, 2011, 34(4): 1-2

Low molecular heparin and heparin
on liver regeneration after resection of rats

ZHANGXu,DINGLong

(The Second General Surgery Department,the First Affiliated Hospital to Jiamusi University,Jiamusi 154003,China)

Abstract:Objective:To Oobserveation of low molecular heparin and sodium heparin for liver regeneration and liver regeneration termination factor TGF - beta 1 expression in rat liver regeneration and its relations with liver regeneration. Methods: 50 Select normal grade clean male Wistar rats provided by jiamusi university center for animal experiment were selected, with only 50 rats weight is 230~290 grams, provided by jiamusi university center for animal experiment. They were Rrandomly divided into 5 groups, namely, A, B, C, D, E group, with 10 in each group. 5 groups were resected 50% lobe of rats, and 3 h after liver resection, to give physiological saline group A, group B to give (1000 U/kg), heparin sodium for subcutaneous injection heparin group C (1000U/kg), group D to give heparin + TGF - beta inhibitor, to give heparin group E + TGF - beta agonist. In three days, five days, 7 days each group were randomly selected 7 anatomy, only take the liver and scale take liver weight and liver regeneration rate was calculated by adopting the method of flow cytometry instrument analysis and calculation of liver cell regeneration index, postoperative PCNA PCNA immunohistochemical detection of each group, rt-pcr to detect the expression of TGF - beta. Results:5 groups of rats in 3 days, five days, 7 days after liver regeneration rate and index of liver cell regeneration comparative differences are statistically significant (P<0.05). Through the comparative analysis showsed that group B, C and D group were higher than group A (P<0.05). There was no difference between group A and group E no difference (P>0.05). Conclusion:Heparin and low molecular heparin can promote rat liver regeneration after liver resection, 50% by inhibiting HGF signaling pathways progress TGF - the role of beta cells, which affect the liver regeneration, improve the index of liver cell regeneration., bBoth promote liver regeneration and remains to be further research.

Key words:low molecular heparin； heparin sodium;liver regeneration

中圖分類號：R657.3

文獻標識碼：B

文章編號：1008-0104(2015)06-0143-03

作者簡介：①張旭(1987~)女，黑龍江鶴崗人，在讀碩士研究生。

通訊作者：丁隆(1978~)女，黑龍江佳木斯人，博士,副主任醫(yī)師。E-mail：398746446@qq.com。

(收稿日期：2015-03-02)