劉廣志　陳炳佑　侍福梅

摘要：以擬南芥野生型、GFP-α-tubulin-6轉(zhuǎn)基因擬南芥及微管結(jié)合蛋白MAP18相關(guān)突變體為材料，利用藥理學(xué)試驗(yàn)及激光掃描共聚焦顯微技術(shù)研究了在脫落酸（ABA）誘導(dǎo)葉片氣孔關(guān)閉過(guò)程中保衛(wèi)細(xì)胞微管骨架的動(dòng)態(tài)變化、根生長(zhǎng)情況及其可能的調(diào)控因子。結(jié)果表明，微管結(jié)合蛋白MAP18過(guò)表達(dá)擬南芥OE的葉片氣孔關(guān)閉現(xiàn)象敏感，MAP18 RNAi沉默株R18現(xiàn)象相對(duì)不敏感。外源ABA抑制擬南芥幼苗初生根的生長(zhǎng)試驗(yàn)中，突變體OE根伸長(zhǎng)減慢的現(xiàn)象顯著，伸長(zhǎng)速率由0.60 cm/d降低至0.12 cm/d，未處理時(shí)WT、map18的伸長(zhǎng)速率都要低于OE的伸長(zhǎng)速率，而用5 μmol/L ABA處理之后，WT、map18的伸長(zhǎng)速率高于OE的伸長(zhǎng)速率。在此基礎(chǔ)上研究了參與其中的作用因子，推測(cè)MAP18通過(guò)影響微管的動(dòng)態(tài)重組參與到ABA誘導(dǎo)擬南芥氣孔關(guān)閉和根伸長(zhǎng)的生理過(guò)程。

關(guān)鍵詞：MAP18；擬南芥；脫落酸；氣孔；幼根；微管結(jié)合蛋白

中圖分類號(hào)： Q945文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）11-0055-03

收稿日期：2014-12-23

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31240035）；山東省自然科學(xué)基金（編號(hào)：ZR2010CQ002）。

作者簡(jiǎn)介：劉廣志（1989—），男，山東聊城人，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)與分子生物學(xué)。 E-mail：liuguangzhi_568@163.com。

通信作者：侍福梅，博士，副教授，從事模式植物及重要農(nóng)作物環(huán)境應(yīng)答的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究。E-mail： shifumei@lcu.edu.cn。脫落酸（abscisic acid，ABA）是一種重要植物激素，有多種生物功能，在氣孔關(guān)閉和開(kāi)放[1]、側(cè)根發(fā)生[2]、初生根伸長(zhǎng)生長(zhǎng)[3]過(guò)程中有重要作用。微管是植物細(xì)胞骨架成分之一，在維持細(xì)胞形態(tài)與結(jié)構(gòu)、參與胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[4-5]上有重要作用?，F(xiàn)在越來(lái)越多的證據(jù)表明微管骨架的組裝與解聚在氣孔運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮著作用[5-9]，并有研究報(bào)道保衛(wèi)細(xì)胞微管骨架直接參與調(diào)節(jié)氣孔運(yùn)動(dòng)[10]，G蛋白作為調(diào)節(jié)因子參與到氣孔運(yùn)動(dòng)中[11]，是否還有其他蛋白也參與其中？

微管是由微管蛋白組成，而微管蛋白在結(jié)合蛋白的影響下，進(jìn)行著微管的組裝與解聚，微管結(jié)合蛋白中的MAP18是一種植物微管的去穩(wěn)定因子，可以影響周質(zhì)微管的排列方式，進(jìn)而影響細(xì)胞的生長(zhǎng)[12]。MAP18在花粉的生長(zhǎng)中起著作用[13]，并且有研究表明ABA可能通過(guò)MAP18共同調(diào)控花粉的生長(zhǎng)[14]。本研究以擬南芥為研究對(duì)象，探討研究微管骨架在ABA誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化、根伸長(zhǎng)情況及MAP18在其中的作用，為進(jìn)一步了解ABA影響氣孔運(yùn)動(dòng)及根生長(zhǎng)發(fā)育的生理過(guò)程提供很多信息。

1材料與方法

1.1材料

供試植物為擬南芥野生型擬南芥WT、GFP-α-tubulin-6轉(zhuǎn)基因擬南芥及微管結(jié)合蛋白MAP18相關(guān)突變體：MAP18過(guò)表達(dá)植株OE、MAP18沉默株R18和MAP18 T-DNA 插入突變株map18。

1.2方法

1.2.1擬南芥的種植用75%乙醇處理野生型擬南芥、GFP-α-tubulin-6 轉(zhuǎn)基因擬南芥和相關(guān)突變型擬南芥種子2 min，0.5 %次氯酸鈉浸泡8 min，無(wú)菌水漂洗4～6次，用移液槍點(diǎn)播在MS培養(yǎng)基上，4 ℃放置3 d，置于溫度為（21±2） ℃、光-暗周期為14 h-10 h的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2微管骨架動(dòng)態(tài)排布的觀察MS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)7 d的GFP-α-tubulin轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗分別在0、1.0、2.5、5.0 μmol/L ABA溶液中浸泡30 min后，每隔15 min在激光共聚焦顯微鏡（奧林巴斯，F(xiàn)luoView FV 1200）下觀察氣孔保衛(wèi)細(xì)胞的微管排布的變化（物鏡60×油鏡；480 nm激發(fā)光激發(fā)）。

1.2.3擬南芥氣孔的觀察將于MS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)7 d的野生型擬南芥和突變體幼苗分別放入0、1.0、2.5、5.0 μmol/L ABA溶液中浸泡90 min后，取葉片觀察下表皮氣孔的關(guān)閉情況。

1.2.4對(duì)擬南芥在ABA誘導(dǎo)下根生長(zhǎng)的分析MS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)7 d的野生型擬南芥和突變體幼苗轉(zhuǎn)移至ABA濃度為0、1.0、2.5、5.0 μmol/L的MS培養(yǎng)基上倒置培養(yǎng)，轉(zhuǎn)移至光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，幼苗生長(zhǎng)4 d后進(jìn)行拍照及長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)。

1.2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析在ABA濃度為0、1.0、2.5、5.0 μmol/L 的MS培養(yǎng)基上倒置培養(yǎng)野生型擬南芥和突變體4 d后，測(cè)量彎根后的長(zhǎng)度，分析數(shù)據(jù)得出伸長(zhǎng)速率。重復(fù)3次，每次重復(fù)20組。平均日伸長(zhǎng)速率（cm/d）=彎根伸長(zhǎng)長(zhǎng)度（cm） /彎根時(shí)間（d）。

2結(jié)果與分析

2.1ABA和微管特異性藥物誘導(dǎo)擬南芥幼苗氣孔關(guān)閉的情況

將于MS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)7 d的野生型擬南芥幼苗分別放入0、1.0、2.5、5.0 μmol/L ABA溶液中浸泡90 min，發(fā)現(xiàn)在5 μmol/L ABA 處理下，氣孔關(guān)閉更顯著，隨ABA濃度的升高，葉片氣孔關(guān)閉越來(lái)越顯著（圖1）。為了探究微管骨架是否主動(dòng)參與到ABA誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉過(guò)程，用氨磺樂(lè)靈和ABA處理擬南芥幼苗葉片表皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在ABA和氨磺樂(lè)靈共同處理下，氣孔關(guān)閉更顯著（圖1-E）。

2.2ABA對(duì)氣孔保衛(wèi)細(xì)胞微管骨架的影響

對(duì)擬南芥葉片未作處理的情況下，通過(guò)激光掃描共聚焦顯微鏡可以清楚地觀察到保衛(wèi)細(xì)胞周質(zhì)微管長(zhǎng)纖維絲由細(xì)胞背壁到腹壁輻射排列（圖2-A）。隨后用5 μmol/L ABA處理擬南芥葉片，隨時(shí)間增長(zhǎng)，越來(lái)越多的微管發(fā)生解聚（圖2-B至圖2-E），90 min后，可見(jiàn)氣孔關(guān)閉，其保衛(wèi)細(xì)胞微管骨架基本解聚，彌散狀熒光隨機(jī)充滿整個(gè)細(xì)胞（圖2-F）。

2.3ABA誘導(dǎo)微管結(jié)合蛋白MAP18相關(guān)突變體氣孔關(guān)閉情況

為了研究MAP18是否參與調(diào)控ABA誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉，分別用5 μmol/L ABA處理野生型擬南芥和突變體的葉片90 min，發(fā)現(xiàn)在ABA誘導(dǎo)擬南芥葉片氣孔關(guān)閉過(guò)程中，野生型葉片氣孔很少完全關(guān)閉，75%的OE葉片氣孔完全關(guān)閉，R18相對(duì)來(lái)說(shuō)現(xiàn)象不顯著（圖3），處于半關(guān)閉狀態(tài)。2.4ABA誘導(dǎo)擬南芥幼苗的彎根生長(zhǎng)

將生長(zhǎng)7 d的野生型和突變體幼苗轉(zhuǎn)移至含不同濃度ABA的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行彎根培養(yǎng)。如圖4-A所示，野生型及突變體在ABA濃度升高后，OE的根伸長(zhǎng)明顯減慢，R18在ABA濃度5 μmol/L的MS培養(yǎng)基上根伸長(zhǎng)幾乎停止。對(duì)根的伸長(zhǎng)做數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)（圖4-B），在未加ABA時(shí)OE的根伸長(zhǎng)速率為0.60 cm/d，比WT、R18、map18的伸長(zhǎng)速率都要高。隨著ABA的濃度升高，OE的伸長(zhǎng)速率降低至0.12 cm/d，比WT、map18的伸長(zhǎng)速率小。

3討論

3.1ABA誘導(dǎo)的葉片保衛(wèi)細(xì)胞微管骨架的解聚與重組

ABA誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉作為一個(gè)經(jīng)典體系， 被廣泛關(guān)注并應(yīng)用到很多試驗(yàn)，并且很多證據(jù)表明，在氣孔開(kāi)關(guān)運(yùn)動(dòng)中保衛(wèi)細(xì)胞的微管骨架組裝發(fā)生了解聚與重組[7-8，15]。ABA與微管在氣孔關(guān)閉運(yùn)動(dòng)中是否存在聯(lián)系尚不清楚。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，正常氣孔保衛(wèi)細(xì)胞中微管骨架呈纖維狀從腹壁到背壁輻射狀排列，這與Yu等的研究結(jié)果[15]相一致。進(jìn)一步用外源ABA處

理GFP-α-tubulin-6轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)ABA處理引起微管骨架的排布發(fā)生變化，整齊的輻射狀排列逐步散亂，推測(cè)微管排布的動(dòng)態(tài)變化可能參與了ABA誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的過(guò)程。

3.2MAP18參與ABA誘導(dǎo)的葉片保衛(wèi)細(xì)胞微管骨架降解、根伸長(zhǎng)減慢的過(guò)程

微管是植物細(xì)胞的骨架，在植物生理方面有許多重要作用，周質(zhì)微管排列的變化顯著影響細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)方向，在快速伸長(zhǎng)的細(xì)胞中，周質(zhì)微管以橫向排列為主，而在伸長(zhǎng)比較緩慢或停止伸長(zhǎng)的細(xì)胞中，周質(zhì)微管以斜向或縱向排列為主[16-18]。當(dāng)用ABA處理擬南芥幼苗初生根時(shí)，根生長(zhǎng)減緩，其微管骨架也會(huì)隨之發(fā)生變化，且微管結(jié)合蛋白MAP18過(guò)表達(dá)植株OE的生長(zhǎng)速率降低顯著，WT和突變株map18沒(méi)有OE敏感，由此推測(cè)，MAP18在ABA抑制根伸長(zhǎng)中起著一定的促進(jìn)作用。在ABA誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉的試驗(yàn)中，OE更敏感，MAP18 RNAi沉默株R18相對(duì)來(lái)說(shuō)不敏感，推測(cè)ABA在誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉中，MAP18促進(jìn)ABA降解氣孔保衛(wèi)細(xì)胞微管骨架。

本研究深入探討了ABA在誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉中的作用和可能的作用機(jī)制，為微管骨架參與氣孔運(yùn)動(dòng)提供了又一新思路；但是在ABA誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉和抑制根生長(zhǎng)過(guò)程中，MAP18如何與ABA相互作用的機(jī)制等一系列問(wèn)題尚需進(jìn)一步研究。

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