張方方　劉海元　張曉瓊等

摘要：為高效獲得內(nèi)生真菌U29、U32、U50、U51石杉堿甲生產(chǎn)菌株的原生質(zhì)體和為原生質(zhì)體融合及基因組改組選育高產(chǎn)石杉堿甲菌株提供參考，研究了溶解酶的濃度、加酶量、酶解溫度、穩(wěn)定劑等因子對4株菌原生質(zhì)體制備的影響。通過研究獲得了菌株原生質(zhì)體制備的優(yōu)化條件：溶壁酶濃度為3.0%、加酶量為2.0 mL/100 mg、菌齡為5 d、酶解時間為2.5 h、酶解溫度為30 ℃、0.6 mol/mL氯化鈉為穩(wěn)定劑、CYM培養(yǎng)基為再生培養(yǎng)基。在此優(yōu)化條件下，4株菌的原生質(zhì)體的產(chǎn)量均大于7.0×107 個/mL，再生率可達(dá)20%以上。

關(guān)鍵詞：內(nèi)生真菌；溶解酶；原生質(zhì)體制備；原生質(zhì)體再生

中圖分類號： S336文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2015）11-0085-05

收稿日期：2015-05-14

基金項(xiàng)目：福建省社會發(fā)展引導(dǎo)性項(xiàng)目（編號：2015Y01010244）；福建省財(cái)政廳專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)[編號：閩財(cái)指（2011）1238]；福建省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目（編號：201310393057）。

作者簡介：張方方（1990—），女，碩士研究生，主要從事中藥生物工程研究。E-mail：1170563131@qq.com。

通信作者：吳水生，從事中藥生物工程研究。E-mial：wushuishengwss@163.com。石杉堿甲 （huperzine A，HupA） 是20世紀(jì)80年代，我國學(xué)者從藥用植物蛇足石杉[Huperziaserrata （Thunb.） Trev.]中分離到的一種石松類倍半萜生物堿，具有高效、低毒、可逆性的乙酰膽堿酯酶抑制作用，目前已成為治療阿爾茨海默病最有效的藥物之一[1-3]。

內(nèi)生真菌長期生活在植物體內(nèi)能夠產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的化學(xué)成分[4]。自從1996年Strobel等[5]從短葉紅豆杉中分離到1株產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌，利用內(nèi)生真菌生產(chǎn)化合物被人們廣泛接受[6]。筆者從閩澤馬尾杉中分離到1株產(chǎn)石杉堿甲的內(nèi)生真菌炭團(tuán)菌NX9，但產(chǎn)量僅為1.12 μg/L，經(jīng)紫外誘變得到4株產(chǎn)量較高的石杉堿甲生產(chǎn)菌U29、U32、U50、U51，產(chǎn)量分別為17.10、17.46、19.89、16.85 μg/L，但該產(chǎn)量仍較低無法實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。通過菌種選育獲得產(chǎn)量高、遺傳穩(wěn)定性好的菌種是實(shí)現(xiàn)利用內(nèi)生真菌發(fā)酵生產(chǎn)石杉堿甲的首要前提。

原生質(zhì)體育種能夠快速、有效地提高菌株中代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，包括原生質(zhì)體再生育種、原生質(zhì)體誘變育種、原生質(zhì)體融合育種等方法[7]。Jin等以10株產(chǎn)量較高的多殺菌素產(chǎn)生菌（Saccharopolyspora spinosa）為出發(fā)菌株，進(jìn)行原生質(zhì)體融合后獲得的融合菌株S. spinosa 4～7，其多殺菌素產(chǎn)量比出發(fā)菌株提高了200.55%以上[8]。2002年出現(xiàn)的基因組改組技術(shù)則是在原生質(zhì)體融合的基礎(chǔ)上通過對正向突變株庫進(jìn)行多親本的原生質(zhì)體遞推式融合而實(shí)現(xiàn)高效的定向育種，極大地加快了獲得高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的菌株的速度[9]。制備大量有活性的原生質(zhì)體是原生質(zhì)體融合及基因組改組育種的前提[7]。有效的原生質(zhì)體制備和再生方法是保證原主質(zhì)體產(chǎn)量和活性的主要途徑，原生質(zhì)體的制備和再生主要受酶的種類與濃度、酶解時間與溫度、菌齡、滲透壓穩(wěn)定劑、培養(yǎng)基成分等因素[10-11]的影響，且由于菌株間存在的差異性，導(dǎo)致原生質(zhì)體制備和再生的方法存在差異[12]。優(yōu)化原生質(zhì)體制備及再生的最優(yōu)條件是原生質(zhì)體育種的重要方法。為此，本試驗(yàn)研究了溶解酶的濃度、加酶量、酶解溫度、穩(wěn)定劑、再生條件等對內(nèi)生真菌U29、U32、U50、U51石杉堿甲生產(chǎn)菌株的原生質(zhì)體制備效率的影響，旨在篩選出適合產(chǎn)石杉堿甲內(nèi)生真菌的原生質(zhì)體制備與再生的最優(yōu)條件，為原生質(zhì)體育種及基因組改組育種奠定基礎(chǔ)，最終為微生物發(fā)酵法生產(chǎn)石杉堿甲且早日實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)，從根本上解決石杉堿甲藥源不足的問題。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種石杉堿甲產(chǎn)生菌U29、U32、U50、U51：由石杉堿甲產(chǎn)生菌NX9誘變所得，實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2培養(yǎng)基的配制（1） PDA液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L；葡萄糖20 g/L。（2） PDA固體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L；葡萄糖20 g/L；瓊脂15～20 g/L。（3）查氏培養(yǎng)基：蔗糖30 g/L；硝酸鈉3 g/L；磷酸二氫鉀1 g/L；氯化鉀0.5 g/L；硫酸鎂0.5 g/L；硫酸亞鐵0.001 g/L；瓊脂16 g/L。（4）CYM培養(yǎng)基：蛋白胨2 g/L；葡萄糖20 g/L；酵母膏2 g/L；硫酸鎂5 g/L；磷酸二氫鉀0.46 g/L；磷酸氫二鉀1 g/L；瓊脂16 g/L。（5） MYG培養(yǎng)基：麥芽糖5 g/L；酵母膏5 g/L；葡萄糖10 g/L。（6）酵母膏培養(yǎng)基：酵母膏5 g/L；蔗糖10 g/L。（7）再生固體培養(yǎng)基：以0.6 mol/L NaCl配制的PDA培養(yǎng)基、馬丁培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基、CYM培養(yǎng)基和酵母膏培養(yǎng)基。（8）再生半固體培養(yǎng)基：再生培養(yǎng)基中瓊脂減半。所有培養(yǎng)基均以121 ℃，滅菌20 min。

1.1.3試劑溶壁酶（美國sigma公司）；氯化鈉、蔗糖、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氯化鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、硝酸鈉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；酵母膏 （廣東江門生物技術(shù)開發(fā)中心有限公司）；蛋白胨 （廣西環(huán)凱微生物科技有限公司）。

滲透壓穩(wěn)定劑：采用0.6 mol/L的NaCl溶液。HupA標(biāo)準(zhǔn)品（純度>98%，長沙中仁生物技術(shù)有限公司，批號：2012120301）。

1.1.4儀器與設(shè)備MJP-250型霉菌培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），BSC-1360ⅡA2超凈工作臺（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司），超高效液相質(zhì)譜儀（Waters，Milford，MA，USA），ACQUITY UPLC BEH C18反相柱（Waters，100 mm×2.1 mm，1.7 μm）。

1.2方法

1.2.1菌絲體培養(yǎng)將菌株U29、U32、U50、U51孢子液以10%（體積比）的接種量接種于含80 mL PDA液體培養(yǎng)基的250 mL三角搖瓶中，于28 ℃恒溫箱中靜置培養(yǎng)5 d，6層高級擦鏡紙過濾，0.6 mol/L NaCl溶液淋洗3次，將菌絲體轉(zhuǎn)移到直徑為6 cm培養(yǎng)皿中，稱質(zhì)量待用。

1.2.2原生質(zhì)體的制備、純化與再生每100 mg菌絲體加 2 mL 酶解液，于適宜溫度的恒溫?fù)u床中振蕩酶解。每30 min吸取一定量的酶解液觀察，計(jì)算原生質(zhì)體數(shù)。酶解完畢后，酶解液用無菌棉花過濾，于3 700 r/min離心10 min，倒掉上清液，用滲透壓穩(wěn)定劑離心洗滌2次，收集原生質(zhì)體重懸于滲透壓穩(wěn)定劑中，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。用滲透壓穩(wěn)定劑稀釋原生質(zhì)體，使之達(dá)到一定濃度，然后吸取0.3 mL加入含有4.7 mL再生半固體培養(yǎng)基的具塞試管中，搖勻后倒入再生固體培養(yǎng)基平板內(nèi)，于28 ℃下培養(yǎng)7 d；同時，再吸取0.3 mL原生質(zhì)體懸液加入已含有4.7 mL低滲半固體培養(yǎng)基的具塞試管中，搖勻后倒入PDA固體培養(yǎng)基平板，作為對照。觀察菌落生長情況，用以下公式計(jì)算再生率：再生率=（再生固體培養(yǎng)基上菌落數(shù)-低滲固體培養(yǎng)基上菌落數(shù)）/原生質(zhì)體數(shù)×100%。分別考察不同的溶解酶濃度、加酶量、菌齡、酶解時間、酶解溫度、滲透壓穩(wěn)定劑及濃度、再生培養(yǎng)基對原生質(zhì)體制備與再生的影響。每個影響因素均平行考察3份，結(jié)果取平均值，獲得石杉堿甲生產(chǎn)菌原生質(zhì)體形成和再生的最佳條件。

2結(jié)果與分析

2.1酶濃度的選擇

分別采用2.0%、2.5%、3.0%、3.5%的溶壁酶酶解菌株U29、U32、U50、U51的菌絲體，在其他條件一致的情況下通過計(jì)算其原生質(zhì)體的產(chǎn)量與再生率，考察原生質(zhì)體制備與再生的最適酶濃度。發(fā)現(xiàn)溶壁酶濃度由2.0%至3.0%時石杉堿甲生產(chǎn)菌的原生質(zhì)體產(chǎn)量及再生率均增大，雖然溶解酶濃度為35%時4株菌的原生質(zhì)體產(chǎn)量均較大，但是原生質(zhì)體的再生率卻比3.0%時低，因此確定溶解酶的濃度為3.0%（表1）。

2.2加酶量的選擇

分別將100 mg新鮮菌絲體加入1.0、2.0、3.0、3.5、4.0 mL 的酶液，溶解酶濃度為3.0%，研究加酶量對4株菌的原生質(zhì)體產(chǎn)量及再生率的影響。加入的酶液過多或過少都難以得到最大量的原生質(zhì)體，當(dāng)加酶量為2.0 mL/100 mg時，4株菌的原生質(zhì)體產(chǎn)量及再生率均達(dá)到最大（表2），因此確定最適宜的加酶量為2.0 mL/100 mg。

2.3菌齡的選擇

將3.0%溶壁酶分別加入靜止培養(yǎng)3、4、5、6、7 d的U29、U32、U50、U51菌絲體，加酶量2.0 mL/100 mg，考察菌齡對原表2加酶量對菌U29、U32、U50、U51原生質(zhì)體產(chǎn)量及再生率的影響生質(zhì)體產(chǎn)量和再生率的影響。發(fā)現(xiàn)隨著菌齡的增加，4株菌的原生質(zhì)體產(chǎn)量及再生率均增大，但培養(yǎng)時間過長原生質(zhì)體產(chǎn)量及再生率均下降。當(dāng)培養(yǎng)時間為5 d時，原生質(zhì)體的產(chǎn)量及再生率均最大（表3），因此確定最佳菌齡為5 d。

2.4酶解時間的研究

在確定的最佳酶濃度、加酶量及菌齡條件下，分別研究了酶解1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h后的原生質(zhì)體產(chǎn)量及再生情況。發(fā)現(xiàn)酶解時間過短會導(dǎo)致細(xì)胞壁水解不充分，原生質(zhì)體不能充分釋放，產(chǎn)量較低，但原生質(zhì)體活性較高，再生率較高；而酶解時間過長導(dǎo)致了原生質(zhì)體皺縮，損害細(xì)胞質(zhì)膜導(dǎo)致再生率急劇下降[13]。其中酶解2.5 h時4株菌的原生質(zhì)體產(chǎn)量及再生率均達(dá)最大（表4）。因此，確定2.5 h為最佳酶解時間。

2.5酶解溫度的選擇

在上述最佳條件下，分別將U29、U32、U50、U51菌絲體置于26、28、30、32、34 ℃的恒溫?fù)u床中，在70 r/min條件下酶解2.5 h后對原生質(zhì)體產(chǎn)量和再生率進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)當(dāng)酶解溫度為28～30 ℃時，原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率隨溫度升高而增大，溫度高于30 ℃后，4株菌的原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率均明顯下降（表5）。

2.6滲透壓緩沖劑的選擇

在上述最佳條件下，分別研究了氯化鉀、氯化鈉、蔗糖、甘露醇、硫酸鎂、氯化鈣等滲透壓緩沖劑對菌U29、U32、U50、U51原生質(zhì)體產(chǎn)量及再生率的影響。發(fā)現(xiàn)當(dāng)酶濃度為30%、菌齡為5 d、酶解時間為2.5 h、酶解溫度為30 ℃時，以氯化鈉作為滲透壓穩(wěn)定劑制備4株菌的原生質(zhì)體時，原生質(zhì)體產(chǎn)量及再生率均最大，故選用氯化鈉為最佳的滲透壓穩(wěn)定劑（表6）。此外，研究了不同濃度氯化鈉對菌U29、U32、U50、U51原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響，發(fā)現(xiàn)氯化鈉濃度在0.4～0.6 mol/L時，4株菌的原生質(zhì)體產(chǎn)量及再生率隨濃度的增大而增大，當(dāng)濃度大于0.6 mol/L時，產(chǎn)量及再生率均下降（表7）。

2.7再生培養(yǎng)基的選擇

采用上面研究所得最優(yōu)條件制備4株菌的原生質(zhì)體，然后分別將其接種到PDA、CYM、MYG、沙氏、酵母膏等再生培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。發(fā)現(xiàn)不同培養(yǎng)基其再生率明顯不同，以CYM再生培養(yǎng)基培養(yǎng)U29、U32、U50、U51原生質(zhì)體時，再生率最高（圖1）。因此，確定最佳的再生培養(yǎng)基為CYM培養(yǎng)基。

2.8原生質(zhì)體的觀察

4株菌菌絲體經(jīng)溶壁酶在30 ℃作用下，恒溫振蕩處理約30 min后開始釋放出原生質(zhì)體，原生質(zhì)體形狀基本一致，多呈球形、透亮，同時可觀察到大量菌絲片段（圖2）。

3討論

3.1酶濃度及加酶量對原生質(zhì)體產(chǎn)量及再生率的影響

真菌細(xì)胞壁組分復(fù)雜，不同培養(yǎng)條件和不同菌齡細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和成分差異很大，而且酶解真菌細(xì)胞壁的過程還涉及到多個影響因素，本研究通過研究溶壁酶濃度、加酶量、菌齡、培養(yǎng)時間等因子對4株石杉堿甲生產(chǎn)菌原生質(zhì)體制備的影響，獲得了制備4株菌原生質(zhì)體的最優(yōu)條件。

真菌細(xì)胞壁的主要成分包括幾丁質(zhì)、糖原、蛋白質(zhì)、半纖維素等。在形成原生質(zhì)體的過程中，細(xì)胞壁被溶解酶酶解出孔洞，原生質(zhì)體從這些孔洞中溢到周圍的穩(wěn)滲劑中。因此，細(xì)胞壁溶解酶在真菌制備原生質(zhì)體的反應(yīng)系統(tǒng)中起直接作用[14]。吳正鋼等研究發(fā)現(xiàn)采用單一酶制備原生質(zhì)體，消除細(xì)胞壁不完全只能形成少量的原生質(zhì)體[15]，但本研究通過考察單一溶壁酶不同濃度對4株菌原生質(zhì)體形成與再生的影響，研究發(fā)現(xiàn)溶壁酶的濃度應(yīng)適當(dāng)，過低或過高的酶濃度都不利于原生質(zhì)體的形成與再生。低濃度的溶壁酶酶解作用不徹底，不利于原生質(zhì)體的生成，過高濃度降低了原生質(zhì)體的數(shù)量和活性，致使形成量與再生率都有明顯下降。當(dāng)酶濃度為30%時，原生質(zhì)體的產(chǎn)量均大于6.0×107個/mL，再生率均大于16%，比采用復(fù)合酶系制備原生質(zhì)體的產(chǎn)量及再生率高[14-15]，不僅簡化了試驗(yàn)步驟而且節(jié)約成本。

加酶量對提高原生質(zhì)體的產(chǎn)量及再生率的影響也較大，過大或過小都難以得到最大量的原生質(zhì)體。加酶量過少酶解不徹底，菌絲中的原生質(zhì)體無法得到充分的釋放，且影響原生質(zhì)體的活性，降低再生率。

3.2菌齡對原生質(zhì)體制備及再生率的影響

真菌生理狀態(tài)是決定原生質(zhì)體產(chǎn)量及再生率的主要因素之一，不同的生長時期，真菌生理狀態(tài)不同，細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)、菌體活力及代謝水平也不相同。因此，菌齡是明顯影響原生質(zhì)體釋放頻率的主要因素。絲狀真菌以年輕的菌絲用來分離原生質(zhì)體最佳，尤其是生長對數(shù)期的菌體。本研究通過繪制4株菌的生長曲線，發(fā)現(xiàn)4株菌的對數(shù)生長期均為3～7 d，幼齡菌絲和老齡菌絲均不利于酶解。菌齡過長，細(xì)胞壁發(fā)生老化增厚，不易釋放原生質(zhì)體，菌齡過短則菌絲體易破裂[16]。研究還發(fā)現(xiàn)3～5 d的菌體隨著培養(yǎng)時間的增加，原生質(zhì)體產(chǎn)量及再生率均提高，當(dāng)菌齡為5 d時，原生質(zhì)體產(chǎn)量及再生率均達(dá)最大值，隨后逐漸降低。

3.3酶解溫度對原生質(zhì)體制備及再生率的影響

不同的酶具有不同的最適溫度，酶解溫度直接影響酶的活性。只有在最適的酶解溫度下，酶的活性才最高，酶促反應(yīng)速率才最大。此外，酶解溫度還影響真菌的生理狀態(tài)、菌絲體細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)性疏散及原生質(zhì)體的活力。通常，真菌的最適酶解溫度為25～35 ℃，當(dāng)溫度在30 ℃時，4株菌原生質(zhì)體的產(chǎn)量及再生率均達(dá)最大值，表明30 ℃為溶壁酶作用4株菌細(xì)胞壁的最適溫度。

3.4不同滲透壓穩(wěn)定劑對原生質(zhì)體制備及再生的影響

滲透壓穩(wěn)定劑既能維持原生質(zhì)體內(nèi)外滲透壓的平衡，維持原生質(zhì)體的形態(tài)，防止破裂或皺縮，影響原生質(zhì)體活力，對酶的活性也有一定的促進(jìn)作用，是影響原生質(zhì)體制備與再生的重要因素。研究發(fā)現(xiàn)6種常用穩(wěn)定劑中，以0.6 mol/L氯化鈉為滲透壓穩(wěn)定劑時，4株菌的原生質(zhì)體制備效果最好，可能由于氯化鈉等有助于酶與底物結(jié)合，對酶反應(yīng)起促進(jìn)作用[17]。

3.5不同再生培養(yǎng)基對原生質(zhì)體再生的影響

再生培養(yǎng)基的選擇直接影響原生質(zhì)體的再生率。本研究比較了PDA、CYM、MYG、酵母等5種再生培養(yǎng)基對4株菌原生質(zhì)體再生率的影響，發(fā)現(xiàn)CYM再生培養(yǎng)基效果最好?？赡苡捎诮湍父?、蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類等營養(yǎng)物質(zhì)可能是細(xì)胞壁合成的前體物質(zhì)，或經(jīng)過代謝轉(zhuǎn)化成細(xì)胞壁的前體物質(zhì)，或促進(jìn)細(xì)胞代謝，參與細(xì)胞壁的加速合成。CYM培養(yǎng)基中同時含有酵母膏、蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類，豐富的營養(yǎng)物質(zhì)更有利于細(xì)胞壁再生。

4結(jié)論

本試驗(yàn)研究了4株石杉堿甲生產(chǎn)菌原生質(zhì)體制備及再生的條件，獲得了原生質(zhì)體制備及再生的最優(yōu)體系：溶壁酶濃度為3.0%、加酶量為2.0 mL/100 mg、菌齡為5 d、酶解時間為2.5 h、酶解溫度為30 ℃、0.6 mol/L氯化鈉為穩(wěn)定劑、CYM培養(yǎng)基為再生培養(yǎng)基。在此體系下，4株菌原生質(zhì)體的產(chǎn)量均大于7.0×107個/mL，再生率均超過20%。本研究為原生質(zhì)體融合及基因組改組選育高產(chǎn)石杉堿甲菌株奠定了重要基礎(chǔ)。

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