張苗苗 唐桂佳

（1，湖北生物科技職業(yè)學(xué)院 430070；2，武漢科前動(dòng)物生物制品有限責(zé)任公司 430070）

偽狂犬病毒 （PRV）間接ELISA試驗(yàn)

張苗苗1，2唐桂佳1，2

（1，湖北生物科技職業(yè)學(xué)院 430070；2，武漢科前動(dòng)物生物制品有限責(zé)任公司 430070）

將PRVHB98株接種IB細(xì)胞，通過超聲波破碎后利用蔗糖梯度離心純化病毒作為ELISA抗原，配以HRP標(biāo)記的酶標(biāo)記物、TMB顯色液、終止液組成PRV間接ELISA。對PRV間接ELISA各操作步驟進(jìn)行試驗(yàn)，通過試驗(yàn)數(shù)據(jù)，確定ELISA的最佳操作方法。

豬；PRV；ELISA；蔗糖梯度離心；試驗(yàn)

豬為六畜之首。養(yǎng)豬業(yè)在世界尤其是中國國民經(jīng)濟(jì)中占有重要地位。近年來。豬肉在肉類產(chǎn)品結(jié)構(gòu)中的比重一直保持在三分之一左右。是世界人民喜愛的肉食品之一[1]。但是各種疾病也為養(yǎng)豬業(yè)帶來了不小的損失。其中包括偽狂犬病毒。新生仔豬感染偽狂犬病毒會(huì)引起大量死亡。懷孕母豬可發(fā)生流產(chǎn)、產(chǎn)木乃伊胎兒或死胎[2]。公豬感染偽狂犬病毒（Pseudorabies virus。PRV）后。表現(xiàn)為睪丸腫脹、萎縮[3]。通過鑒別診斷可以確定豬群是否感染有PRV?？梢蕴蕴腥矩i群。最終建立新的無病豬群。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)用病毒毒株

武漢科前動(dòng)物生物制品有限責(zé)任公司生產(chǎn)的HB98株。

1.2 主要試劑

牛血清白蛋白 （BSA）：西德進(jìn)口分裝。

PRV-gB抗體檢測試劑盒：美國IDEXX公司生產(chǎn)。

PRV-gB陽性參考血清：武漢科前動(dòng)物生物制品有限公司提供。

PRV-gB陰性參考血清：武漢科前動(dòng)物生物制品有限公司提供。

TMB顯色液：武漢科前動(dòng)物生物制品有限公司提供。

羊抗豬酶標(biāo)二抗：SBA公司生產(chǎn)。

1.3 主要試驗(yàn)器材

96孔酶標(biāo)板：深圳金燦華有限責(zé)任公司生產(chǎn)。

MK3型酶標(biāo)儀：Thermo生產(chǎn)。

7520型分光光度計(jì)：上海分析儀器廠生產(chǎn)。

1.4 包被抗原的制備

將PRVHB98株 （效價(jià)106.8TCID50/ml）接種IB細(xì)胞。37℃孵育24h后。細(xì)胞病變達(dá)到100%時(shí)。及時(shí)收獲病毒。病毒液經(jīng)三次超聲波裂解1min（20KC/S）后。再于4℃8000r/min離心20min。棄上清。沉淀用原體積的1/20的0.01mol/L。pH7.2PBS懸浮。經(jīng)充分懸浮的病毒液27000r/min超速離心取沉淀用1ml左右TE液懸浮。依次加入60%、45%、35%、20%蔗糖溶液。最上層加入重懸的病毒液27000r/min進(jìn)行蔗糖梯度離心。收集各層之間的液體分別用TE27000r/min離心脫糖后PBS重懸。分裝-70℃凍存。用分光光度計(jì)測量OD260和OD280。運(yùn)用公式蛋白濃度=（1.45×OD280-0.74×OD260）×稀釋倍數(shù)。取含量最高的為ELISA抗原[4]。

1.5 最佳反應(yīng)條件

1.5.1 抗原和血清稀釋度的確定

用0.05mol/L pH=9.6碳酸鹽緩沖液將PRV抗原按1：1000、 1： 2000、 1： 4000、 1： 8000、 1： 16000、 1： 32000、1：64000、1：128000稀釋。分別加入到96孔酶標(biāo)板左側(cè)第1～12列的第 1～8行。 每孔 100μl。 37℃作用 1h后置 2～8℃過夜[5]。取出棄去孔中溶液后。每孔加入120μl封閉液。37℃作用1h。棄孔內(nèi)封閉液；用血清稀釋液將PRV-gB陽性血清和陰性血清在酶標(biāo)板橫向上1～6行和7～12行作1：10、1：20、 1： 40、 1： 80、 1： 160、 1： 320 倍比稀釋后。 進(jìn)行ELISA檢測。測定各稀釋度OD630nm值。計(jì)算相同稀釋度的陽性血清和陰性血清孔之間的OD630nm值的比值 （P/N值）。選擇P/N值最大孔的稀釋倍數(shù)作為抗原和血清的最佳稀釋度[6]。

1.5.2 酶標(biāo)記物反應(yīng)時(shí)間的確定

將酶標(biāo)記物按1：5000稀釋后。37℃分別作用15min、30min、45min及60min。進(jìn)行ELISA檢測。確定酶標(biāo)抗體的最佳反應(yīng)時(shí)間[7]。

1.5.3 底物的最佳反應(yīng)時(shí)間的確定

加入底物后 37℃分別反應(yīng) 5min、10min、15min及30min。進(jìn)行ELISA檢測。確定底物的最佳反應(yīng)時(shí)間。

2 結(jié)果

2.1 抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度的確定

采取方陣滴定的方法來確定。試驗(yàn)結(jié)果表明抗原最佳包被濃度為1：4000。血清最佳稀釋度為1：40。

2.2 封閉液的確定

（1）含0.1%脫脂乳、0.05%Tween-20的磷酸鹽緩沖液。

（2）含0.5%BSA、0.05%Tween-20的磷酸鹽緩沖液。

（3）含1%脫脂乳、0.05%Tween-20的磷酸鹽緩沖液。

（4）含5%脫脂乳、0.05%Tween-20的磷酸鹽緩沖液作為封閉液。進(jìn)行ELISA檢測。確定最適合的封閉液為含0.5%BSA、0.05%Tween-20的磷酸鹽緩沖液。

2.3 樣品稀釋液的確定

（1）含0.1%脫脂乳、0.05%Tween-20的磷酸鹽緩沖液。

（2）含0.5%BSA、0.05%Tween-20的磷酸鹽緩沖液。

（3）含1%脫脂乳、0.05%Tween-20的磷酸鹽緩沖液。

（4）含5%脫脂乳、0.05%Tween-20的磷酸鹽緩沖液作為血清稀釋液。進(jìn)行ELISA檢測。確定最適合的稀釋液為含0.5%BSA、0.05%Tween-20的磷酸鹽緩沖液。

2.4 血清最佳反應(yīng)條件的確定

加入待檢血清后。分別于 37℃作用 15min、30min、45min、60min。進(jìn)行ELISA檢測。確定血清的最佳反應(yīng)條件為37℃30min。

2.5 酶標(biāo)抗體反應(yīng)條件的確定

將酶標(biāo)抗體作1：5000稀釋后。37℃分別作用15min、30min、45min、60min。進(jìn)行ELISA檢測。確定酶標(biāo)二抗的最佳反應(yīng)條件為37℃30min。

2.6 底物的最佳反應(yīng)條件的確定

加入底物后 37℃分別反應(yīng) 5min、10min、15min及30min。進(jìn)行ELISA檢測。確定底物的最佳反應(yīng)條件為37℃10min。

2.7 包被程序

用pH值9.6的0.05mo1/L碳酸鹽緩沖液稀釋抗原至工作濃度 （1： 80）。 100μl/孔包被酶標(biāo)板。 2～8℃包被過夜 （14～18h）。甩干。加入含0.5%BSA、0.05%Tween-20的磷酸鹽緩沖液封閉37℃1h。甩干。加入保護(hù)劑37℃2h。2～8℃保存。

2.8 ELISA操作程序

（1）用pH值9.6的0.05mo1/L碳酸鹽緩沖液稀釋抗原至工作濃度。100μl/孔包被板。37℃作用1h后。2～8℃包被過夜。甩干。

（2）加封閉液。120μl/孔。37℃作用1h。甩干。

（3） 加入保護(hù)劑。 120μl/孔。 37℃作用 1h 后。 2～8℃過夜。甩干。37℃烘干2h。

（4） 加入 1： 40稀釋的待檢血清。 100μl/孔。 37℃。30min。洗滌液洗板3次。每次3min。

（5）加入1：5000稀釋的酶標(biāo)抗體。100μl/孔。37℃。30min。洗滌液洗板5次。每次3min。

（6）加入底物液A、B。各加50μl/孔。室溫避光顯色10min。

（7）加終止液50μl/孔終止反應(yīng)。酶聯(lián)免疫檢測儀測OD450。

3 小結(jié)

本病尚無特效治療藥物。緊急情況下。用高免血清治療。可降低死亡率。疫苗免疫接種是預(yù)防和控制偽狂犬病的根本措施。目前國內(nèi)外已研制成功偽狂犬的常規(guī)弱毒疫苗、滅活疫苗以及基因缺失疫苗 （包括基因缺失弱毒苗和滅活苗）。這些疫苗都能有效地減輕或防止偽狂犬病的臨診癥狀。從而減少該病造成的經(jīng)濟(jì)損失。消滅牧場中的鼠類。對預(yù)防本病有重要意義[8]。同時(shí)。還要嚴(yán)格控制犬、貓、鳥類和其他禽類進(jìn)入豬場。嚴(yán)格控制人員來往。并做好消毒工作及血清學(xué)監(jiān)測等。這樣對本病的防制也可起到積極的推動(dòng)作用。

[1]程晶,陳艷紅,蔭碩焱,等.2006～2008年我國部分地區(qū)規(guī)?；i場PRV血清流行病學(xué)調(diào)查[J].中國動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào),2009,17（1）:67-71.

[2]劉有昌,金萍,康立平,等.種豬群偽狂犬病野毒感染的監(jiān)測[J].中國獸藥雜志,2007(2):14-18.

[3]趙東升,劉有昌,安福生,等.近年來我國豬偽狂犬病的流行狀況和分析[J].今日養(yǎng)豬業(yè),2008(6):26-28.

[4]曹斌,謝獻(xiàn)勝,等.間接ELISA快速檢測豬PRV抗體方法的建立[J].畜牧與獸醫(yī),2007,39（2）:46-47.

[5]劉文興.布魯氏菌標(biāo)記疫苗(M5-90-26)的鑒別診斷及其bp26蛋白的免疫原性分析.《南京農(nóng)業(yè)大學(xué)博士論文》,2011.

[6]邱德新,陳煥春,何啟蓋,等.間接ELISA檢測豬偽狂犬病血清抗體[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào),2002（2）:149-151.

[7]張德明,莊向生,許盛武,等.用VN、ELISA檢測斷乳后仔豬偽狂犬病毒抗體的動(dòng)態(tài)變化[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2002,17（3）:172-173.

[8]陳煥春,金梅林,何啟蓋,等.豬偽狂犬病毒油乳劑滅火苗的制備及其安全性的和免疫原性的試驗(yàn)[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2001,32（1）:44-51.

張苗苗 （1983-），女，漢族，湖北省武漢市人，碩士研究生，講師，藥理與毒理學(xué)專業(yè)，從事世界主要發(fā)達(dá)國家和國際組織獸藥耐藥性管理研究工作。