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      柱前衍生/高效液相色譜-熒光檢測(cè)器測(cè)定面粉制品中的偶氮甲酰胺

      2016-01-27 02:55:52章建輝歐陽(yáng)麗彭新凱夏立新
      分析測(cè)試學(xué)報(bào) 2015年12期
      關(guān)鍵詞:高效液相色譜

      章建輝,歐陽(yáng)麗,彭新凱,夏立新,李 歡,汪 輝

      (1.長(zhǎng)沙市食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢測(cè)中心,湖南 長(zhǎng)沙 410013;2.湖南澄源檢測(cè)有限公司,湖南 長(zhǎng)沙 410000)

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      柱前衍生/高效液相色譜-熒光檢測(cè)器測(cè)定面粉制品中的偶氮甲酰胺

      章建輝1,2*,歐陽(yáng)麗1,彭新凱1,夏立新1,李歡1,汪輝1

      (1.長(zhǎng)沙市食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢測(cè)中心,湖南長(zhǎng)沙410013;2.湖南澄源檢測(cè)有限公司,湖南長(zhǎng)沙410000)

      摘要:建立了面粉制品中偶氮甲酰胺(ADA)殘留量的丹磺酰氯柱前衍生結(jié)合高效液相色譜-熒光檢測(cè)器的分析方法。面粉制品中的ADA經(jīng)濕熱處理后,轉(zhuǎn)變成氨基脲(SEM),加入丹磺酰氯(DNS-Cl)進(jìn)行衍生。采用Aglient TC C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)對(duì)衍生產(chǎn)物進(jìn)行分離,流動(dòng)相為乙腈-水(65∶35),流速1.0 mL/min,柱溫30 ℃,激發(fā)波長(zhǎng)330 nm,發(fā)射波長(zhǎng)530 nm,高效液相色譜-熒光檢測(cè)器檢測(cè),外標(biāo)法定量。偶氮甲酰胺在0.1~50 mg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(r)大于0.998,檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)分別為0.03 mg/L和0.10 mg/L。在0.1,0.3,1.0 mg/kg 3個(gè)加標(biāo)水平下的平均回收率為78.4%~96.6%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD,n=6)為7.1%~9.4%。該方法具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏等特點(diǎn),可用于面粉制品中偶氮甲酰胺的檢測(cè)。

      關(guān)鍵詞:柱前衍生;高效液相色譜-熒光檢測(cè)器;偶氮甲酰胺;丹磺酰氯

      偶氮甲酰胺(Azodicarbonamide,ADA)又名偶氮二酰胺,為黃至橘紅色結(jié)晶性粉末,具有漂白和氧化雙重作用,是工業(yè)中常用的發(fā)泡劑。偶氮甲酰胺也作為漂白劑和改良劑在面粉中使用,GB 2760-2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定小麥粉中偶氮甲酰胺的最大用量為45 mg/kg[1]。研究表明,偶氮甲酰胺在濕熱條件下分解產(chǎn)生聯(lián)二脲(Biurea,HDC),聯(lián)二脲在高溫條件下又能轉(zhuǎn)變成氨基脲(Semicarbazide,SEM)[2],然而氨基脲具有致突變和致癌作用。近年來(lái),大量研究表明,由于偶氮甲酰胺全部降解生成聯(lián)二脲與氨基脲[3-5],故在面粉制品中不能檢出。因此,有必要建立面粉制品中偶氮甲酰胺的最終代謝產(chǎn)物氨基脲的檢測(cè)方法,并通過(guò)氨基脲的含量來(lái)評(píng)估面粉中偶氮甲酰胺的使用量。

      目前,有關(guān)偶氮甲酰胺及其代謝物聯(lián)二脲和氨基脲的檢測(cè)方法有高效液相色譜法(HPLC)[6-7]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)等[8-11],其中HPLC法具有簡(jiǎn)單、快速等特點(diǎn),但提取困難、操作繁瑣、響應(yīng)低、干擾多;LC-MS/MS法靈敏度高、專一性強(qiáng),但儀器價(jià)格昂貴;因此開發(fā)一種操作簡(jiǎn)單、靈敏度高的檢測(cè)方法非常重要。丹磺酰氯作為液相色譜柱前衍生試劑具有衍生操作簡(jiǎn)單、衍生物穩(wěn)定性好、熒光吸收強(qiáng)、靈敏度高、反應(yīng)范圍寬、基體干擾不明顯等優(yōu)點(diǎn)[12],在胺類化合物分析中應(yīng)用廣泛[13-14],此衍生方法在面粉制品中偶氮甲酰胺的檢測(cè)方面尚未見報(bào)道。本文采用丹磺酰氯與偶氮甲酰胺代謝物氨基脲進(jìn)行衍生反應(yīng),高效液相色譜-熒光檢測(cè)器進(jìn)行分離測(cè)定,對(duì)面粉制品中偶氮甲酰胺代謝物氨基脲進(jìn)行檢測(cè)。該方法簡(jiǎn)單、快速、穩(wěn)定,可進(jìn)行實(shí)際應(yīng)用。

      1實(shí)驗(yàn)部分

      1.1儀器與試劑

      LC-20AT高效液相色譜儀,配自動(dòng)進(jìn)樣器和熒光檢測(cè)器(日本島津公司);CT14D型臺(tái)式高速離心機(jī)(上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司);SK-1型快速混勻器(江蘇金壇醫(yī)療儀器廠);A10型超純水處理器(美國(guó)Millipore公司)。

      乙腈(色譜純,德國(guó)Merck公司);正己烷、碳酸氫鈉、氫氧化鈉、氯化氫、冰醋酸(分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);偶氮甲酰胺(含量>97.0%,上海沃凱化學(xué)試劑有限公司);丹磺酰氯(含量>98.0%,日本東京化成工業(yè));實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

      1.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

      稱取10 mg(精確至0.001 mg)偶氮甲酰胺,用25 mL 0.5 mol/L 鹽酸于60 ℃水解4 h,冷卻后用 0.5 mol/L氫氧化鈉調(diào)至中性,加水定容至100 mL配成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,于4 ℃冷藏保存;使用時(shí)用水逐級(jí)稀釋成所需濃度的工作液。

      1.3樣品的提取與凈化

      精確稱取1.0 g樣品于15 mL塑料離心管中,加4 mL 0.5 mol/L鹽酸渦旋混勻,60 ℃水浴水解4 h,冷卻后用0.5 mol/L氫氧化鈉調(diào)至近中性,分別加入1 mL亞鐵氰化鉀和乙酸鋅溶液,定容至10 mL后加1 mL正己烷渦旋混勻。5 000 r/min離心5 min,棄去正己烷層,取1 mL上清液衍生。

      1.4樣品衍生

      取1 mL待衍生液置于15 mL塑料離心管中,加入1 mL 0.1 mol/L碳酸氫鈉緩沖溶液(pH 9.5)與1 mL 3.0 mg/mL丹磺酰氯乙腈溶液,渦旋混勻,避光下50 ℃水浴衍生45 min。5 000 r/min離心3 min,將上清液過(guò)0.45 μm有機(jī)相濾膜后上液相色譜-熒光檢測(cè)器檢測(cè)。

      1.5色譜條件

      色譜柱:Agilent TC C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫:30 ℃;流速:1.0 mL/min;流動(dòng)相:水-乙腈溶液(35∶65),進(jìn)樣量10 μL;激發(fā)波長(zhǎng)330 nm,發(fā)射波長(zhǎng)530 nm。

      2結(jié)果與討論

      2.1樣品的提取與凈化

      面粉制品中添加的偶氮甲酰胺經(jīng)過(guò)高溫、高濕環(huán)境后,將分解為聯(lián)二脲和氨基脲,采用純水提取時(shí),只能得到基質(zhì)中的氨基脲[3]。本實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)方法[9,11],采用4 mL 0.5 mol/L鹽酸于60 ℃水浴4 h對(duì)樣品進(jìn)行水解,該條件下面粉制品中的偶氮甲酰胺和聯(lián)二脲全部轉(zhuǎn)化為氨基脲。為保證檢測(cè)靈敏度和檢測(cè)結(jié)果的可靠性,需去除水解后面粉制品中含有的脂肪和蛋白成分。面粉制品經(jīng)鹽酸水解后,以0.5 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液至中性,再加入亞鐵氰化鉀和乙酸鋅沉淀蛋白;然后加入正己烷脫脂,5 000 r/min離心5 min后棄去正己烷層。

      2.2流動(dòng)相的選擇

      根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)研究[15],考察了乙腈-水和乙腈-0.01 mol/L乙酸鈉(乙酸調(diào)至pH 4.2)分別作為流動(dòng)相時(shí)衍生產(chǎn)物與雜質(zhì)峰色譜分離的情況。結(jié)果顯示,提高流動(dòng)相中乙腈的比例可以加快分離過(guò)程,但乙腈比例過(guò)高時(shí),目標(biāo)峰與雜質(zhì)峰無(wú)法基線分離,干擾檢測(cè)。當(dāng)流動(dòng)相中乙腈和水的體積比為65∶35時(shí),目標(biāo)峰與雜質(zhì)峰的分離度為1.8,保留時(shí)間為8.354 min,分析時(shí)間較短。當(dāng)流動(dòng)相中乙腈和0.01 mol/L乙酸鈉的體積比為65∶35時(shí),目標(biāo)峰與雜質(zhì)峰也能得到良好分離,但保留時(shí)間變長(zhǎng)(10.50 min)。此外,乙腈-0.01 mol/L乙酸鈉流動(dòng)相的配制繁瑣,因此本實(shí)驗(yàn)采用乙腈-水(65∶35)作為流動(dòng)相。

      圖1 pH值對(duì)偶氮甲酰胺峰面積的影響Fig.1 Effect of reaction pH value on peak area of ADA(50 mg/L)

      圖2 衍生反應(yīng)溫度和時(shí)間對(duì)偶氮甲酰胺峰面積的影響Fig.2 Effect of derivative reaction temperature and time on peak area of ADA(50 mg/L)

      2.3衍生條件的優(yōu)化

      2.3.1衍生溶劑的pH值反應(yīng)介質(zhì)的pH值對(duì)氨基脲衍生反應(yīng)的影響很大。實(shí)驗(yàn)考察了0.1 mol/L 碳酸氫鈉緩沖溶液的pH值分別為8.5,9.0,9.2,9.5,10.0,10.5,11.0時(shí)衍生產(chǎn)物的峰面積,結(jié)果見圖1。由圖可知:隨著pH值的逐漸增大,衍生產(chǎn)物丹磺酰-氨基脲產(chǎn)量先增加后減小,在pH值為9.5時(shí),衍生物的生成量最大。因此實(shí)驗(yàn)選取pH 9.5的 0.1 mol/L 碳酸氫鈉緩沖溶液作為反應(yīng)介質(zhì)。

      2.3.2衍生溶劑的濃度根據(jù)衍生反應(yīng)的比例關(guān)系及衍生劑需適當(dāng)過(guò)量的原則,在系列15 mL離心管中加入1 mL 50 mg/L標(biāo)準(zhǔn)品后,再加入1 mL濃度為1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 mg/mL的丹磺酰氯乙腈溶液進(jìn)行衍生反應(yīng)。結(jié)果顯示:隨著丹磺酰氯濃度的增大,其衍生物產(chǎn)量增多,當(dāng)加入3.0 mg/mL丹磺酰氯時(shí),衍生物產(chǎn)量達(dá)到穩(wěn)定值;但丹磺酰氯的濃度大于3.0 mg/mL時(shí),衍生反應(yīng)溶液會(huì)出現(xiàn)渾濁,產(chǎn)生不溶性的黃色物質(zhì)。為節(jié)約成本,實(shí)驗(yàn)選取3.0 mg/mL丹磺酰氯乙腈溶液為衍生溶劑。

      2.3.3衍生反應(yīng)溫度與時(shí)間的選擇考察了不同溫度和時(shí)間對(duì)衍生物產(chǎn)率的影響(見圖2)。結(jié)果表明:衍生溫度為50 ℃,時(shí)間為 45 min時(shí)衍生物的生成量最大。對(duì)比考察了室溫避光過(guò)夜衍生和50 ℃衍生 45 min的結(jié)果,2種衍生條件下衍生物的生成量未見明顯增加。由于溫度過(guò)高或衍生時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí),均會(huì)導(dǎo)致衍生副反應(yīng)過(guò)多,而室溫避光隔夜的衍生時(shí)間過(guò)長(zhǎng),因此實(shí)驗(yàn)選取50 ℃水浴45 min作為衍生條件。

      2.4穩(wěn)定性考察

      取相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品加標(biāo)溶液,分別放置0,5,10,15,24,36 h后進(jìn)行測(cè)定,待測(cè)組分峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為3.3%和4.1%,表明衍生物在36 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

      2.5線性范圍、檢出限與定量下限

      分別吸取一定體積的偶氮甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液,配制成質(zhì)量濃度為0,0.1,0.5,1.0,10.0,20.0,50.0 mg/L的系列偶氮甲酰胺工作液,取1 mL按照“1.4”方法進(jìn)行衍生,“1.5”方法進(jìn)行色譜分析。以質(zhì)量濃度(X,mg/L)為橫坐標(biāo),峰面積(Y)為縱坐標(biāo)求得線性回歸方程為Y=1 659.8X+3 691.7,相關(guān)系數(shù)(r)大于0.998。以信噪比S/N≥3及S/N≥10分別確定方法的檢出限為0.03 mg/L,定量下限為0.10 mg/L。

      2.6回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

      選取不含偶氮甲酰胺的面粉制品作為基質(zhì),進(jìn)行0.1,0.3,1.0 mg/kg 3 個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),同一加標(biāo)水平平行測(cè)定6次,其平均回收率分別為78.4%,85.7%,96.6%,RSD分別為9.4%,7.1%及7.5%。相關(guān)色譜圖見圖3。

      2.7與其他方法的比較

      與相關(guān)文獻(xiàn)方法進(jìn)行比較,本方法的定量下限(LOQ=0.10 mg/L)介于HPLC(LOQ=1.0 mg/kg)[6]和HPLC-MS/MS(LOQ=0.000 5 mg/kg)[11]兩者之間,說(shuō)明本方法靈敏度高,具有很高的準(zhǔn)確性。

      2.8實(shí)際樣品的檢測(cè)

      應(yīng)用本方法對(duì)市購(gòu)10個(gè)不同類型面粉制品進(jìn)行分析。結(jié)果顯示,4個(gè)樣品中檢出偶氮甲酰胺,其含量為1.06~18.4 mg/kg,該含量小于國(guó)家規(guī)定的偶氮甲酰胺在面粉中的最大殘留限量。

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      Determination of Azodicarbonamide in Flour Products by High Performance Liquid Chromatography-Fluorescence Detector Coupled with Precolumn DerivatizationZHANG Jian-hui1,2*,OUYANG Li1,PENG Xin-kai1,XIA Li-xin1,LI Huan1,WANG Hui1

      (1.Changsha Center of Supervision & Inspection on Food Quality Safety,Changsha410013,China;2.Hunan

      Chengyuan Testing Corporation Limited,Changsha410000,China)

      Abstract:A method was developed for the determination of azodicarbonamide(ADA) in flour products using dansyl chloride(DNS-Cl) precolumn derivatization combined with high performance liquid chromatography-fluorescence detector.ADA in flour products was hydrolyzed by wet heat processing and formed semicarbazide(SEM) finally.SEM was derivatized with DNS-Cl.The derivatization product was separated on an Aglient TC C18column(250 mm× 4.6 mm,5 μm) using acetonitrile-water(65∶35) as mobile phase at a flow rate of 1.0 mL/min.The oven temperature was set at 30 ℃,the excitation wavelength was 330 nm and the detection wavelength was 530 nm.Under the optimal conditions,the linear range for ADA was in the range of 0.1-50 mg/L with correlation coefficient(r) higher than 0.998.The limits of detection(LOD)and limits of quantitation(LOQ) for the method were 0.03 mg/L and 0.10 mg/L,respectively.The spiked recoveries of ADA at three levels of 0.1,0.3,1.0 mg/kg ranged from 78.4%to 96.6%with RSDs of 7.1%-9.4%.With advantages of simplicity,rapidness and sensitivivity,the method was successfully applied in the analysis of ADA in flour products.

      Key words:precolumn derivatization;high performance liquid chromatography-fluorescence detector;azodicarbonamide(ADA);dansyl chloride

      中圖分類號(hào):O657.72;TQ314.259

      文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

      文章編號(hào):1004-4957(2015)12-1430-04

      doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2015.12.018

      通訊作者:*章建輝,碩士,工程師,研究方向:食品與環(huán)境分析,Tel:0731-88635360,E-mail:zhangjianhui2012@163.com

      基金項(xiàng)目:國(guó)家公益性行業(yè)科研專項(xiàng)項(xiàng)目(201310130)

      收稿日期:2015-05-11;修回日期:2015-06-02

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