文新望

（湖南省益陽市綜合職業(yè)中等專業(yè)學(xué)校，湖南益陽413002）

利用高通量測序技術(shù)篩選地方豬種遺傳特質(zhì)的研究進(jìn)展與啟示

文新望

（湖南省益陽市綜合職業(yè)中等專業(yè)學(xué)校，湖南益陽413002）

摘要：目前，新一代測序技術(shù)已逐漸受到廣大科研工作者的關(guān)注和認(rèn)可，廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物的遺傳研究和關(guān)鍵基因的篩選中，并在篩選我國地方豬種遺傳特質(zhì)的研究中展現(xiàn)出較強(qiáng)的挖掘能力。本文從當(dāng)前研究熱點(diǎn)轉(zhuǎn)錄組和microRNA表達(dá)譜出發(fā)，綜述了利用高通量測序技術(shù)篩選地方豬種遺傳特質(zhì)的研究進(jìn)展，以期為評估地方豬種優(yōu)良種質(zhì)特性和挖掘優(yōu)異基因的工作提供參考。

關(guān)鍵詞：高通量測序技術(shù)；地方豬種；種質(zhì)特性；遺傳；研究

作者介紹：文新望，女，漢族，湖南益陽人，中教一級職稱，主要從事生物和計(jì)算機(jī)的教學(xué)工作

據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國現(xiàn)有88個(gè)地方豬種，是豬種資源最豐富的國家之一。地方豬種根據(jù)體型外貌、生產(chǎn)性能、氣候條件等可大致分為華北、華中、華南、西南、江南和高原六個(gè)類型［1］，它們所具有的耐粗飼、抗逆性強(qiáng)、肌內(nèi)脂肪含量高以及繁殖力強(qiáng)等優(yōu)良種質(zhì)特性，不僅受到國人的廣泛關(guān)注，還對世界豬種改良做出了較大貢獻(xiàn)；同時(shí)，它們也是研究豬的特定遺傳性狀的最佳素材。但在外來豬種生長速度較快、瘦肉率較高的優(yōu)點(diǎn)沖擊下，地方豬種的飼養(yǎng)受到很大影響，其飼養(yǎng)范圍逐步縮小。近年來，地方豬種資源的保護(hù)和利用越來越受到政府和社會(huì)各界的關(guān)注，在健全法律法規(guī)、推進(jìn)開發(fā)利用以及建設(shè)地方豬保種場等方面的工作取得了突出成效，如頒布實(shí)施了《中華人民共和國畜牧法》，建設(shè)保種場，劃定保護(hù)區(qū)，建立基因庫和培育配套系等［2］。與此同時(shí)，在科學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展進(jìn)步的情況下，對地方豬種深入開展系統(tǒng)研究，利用分子生物學(xué)技術(shù)評估優(yōu)良種質(zhì)特性和挖掘優(yōu)異基因也是刻不容緩的一項(xiàng)工作。近年來，新一代測序技術(shù)因測序通量高、速度快及測序成本低等優(yōu)點(diǎn)，逐漸受到廣大科研工作者的關(guān)注和認(rèn)可，廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物的遺傳研究和關(guān)鍵基因的篩選中，并在篩選我國地方豬種遺傳特質(zhì)的研究中展現(xiàn)出較強(qiáng)的挖掘能力。本文從當(dāng)前研究熱點(diǎn)轉(zhuǎn)錄組和microRNA（miRNA）表達(dá)譜出發(fā)，綜述了利用高通量測序技術(shù)篩選地方豬種遺傳特質(zhì)的研究進(jìn)展，以期為評估地方豬種優(yōu)良種質(zhì)特性和挖掘優(yōu)異基因的工作提供參考。

1 高通量測序技術(shù)簡介

當(dāng)前的高通量測序技術(shù)是指在雙脫氧核苷酸末端終止法（Sanger法）的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的具有測序通量高、速度快、成本低等優(yōu)點(diǎn)的第二代測序技術(shù)［3］。目前得以廣泛應(yīng)用的測序技術(shù)有三種，即羅氏公司的454技術(shù)、Illumina公司的Solexa技術(shù)和ABI公司的SOLID技術(shù)，三者的原理、數(shù)據(jù)量產(chǎn)出、數(shù)據(jù)質(zhì)量和運(yùn)行成本均有不同，但其測序步驟大致相當(dāng)，依次為模板準(zhǔn)備、測序和成像、序列組裝和比對等［4］。由于目前測序技術(shù)多由各生物信息技術(shù)公司提供，本文僅對這三種測序技術(shù)做如下簡要介紹。454測序技術(shù)是一種依靠生物發(fā)光進(jìn)行cDNA序列分析的技術(shù)，在一系列酶的協(xié)同作用下使得引物的每一個(gè)dNTP聚合與一次熒光信號釋放偶聯(lián)起來，通過檢測熒光信號獲得DNA序列，其主要優(yōu)點(diǎn)為讀段較長，可達(dá)600～1 000 bp，但其通量最低［5，6］。Solexa技術(shù)的主要原理是邊合成邊測序，利用單分子陣列在小型芯片上進(jìn)行橋式PCR反應(yīng)，在采用新的可逆阻斷技術(shù)后，合理實(shí)現(xiàn)每次只合成一個(gè)堿基，其主要優(yōu)點(diǎn)是測序通量大，結(jié)果較為精確，但讀段通常僅為100～200 bp［5，6］。SOLID技術(shù)主要采用雙堿基編碼原理，通過寡核苷酸連接和檢測進(jìn)行測序，盡管其讀段僅為50 bp左右，但測序錯(cuò)誤率大大降低［5，6］。

2 地方豬種的轉(zhuǎn)錄組研究

轉(zhuǎn)錄組是生物體特定組織或細(xì)胞在某一特定時(shí)間（包括發(fā)育狀態(tài)或功能狀態(tài)）轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA集合。高通量測序技術(shù)可將這一RNA集合測序出來以從整體水平研究基因功能，從差異樣品中篩選出差異表達(dá)的基因，結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)分析得到調(diào)控不同表型的關(guān)鍵基因，從而揭示導(dǎo)致不同表型的分子機(jī)理。

骨骼肌是動(dòng)物體內(nèi)最多的組織，約占體重的40%，其在骨和關(guān)節(jié)的配合下，通過收縮和舒張，完成各種軀體活動(dòng)，對其進(jìn)行發(fā)育和種間比較轉(zhuǎn)錄組研究以揭示分子機(jī)理尤為重要。Zhao等［7］采用Solexa測序技術(shù)對藍(lán)塘豬和長白豬35、49、63、77和91胚齡以及2、28、90、120和180日齡的骨骼肌進(jìn)行了發(fā)育和比較轉(zhuǎn)錄組研究，在藍(lán)塘豬肌肉生成早于長白豬卻慢于長白豬的情況下，共計(jì)鑒定出595個(gè)差異表達(dá)的基因，其中：GSK3B、IKBKB、ACVR1、ITGA和STMN1對后期肌肉的形成具有促進(jìn)作用，ID1、ID2、CABIN1、MSTN、SMAD4、CTNNA1、NOTCH2、GPC3和HMOX1高表達(dá)于藍(lán)塘豬的骨骼肌而致使其分化速度減慢。Zhao等［8］采用Illumina Hi-Seq2000對通城豬和大白豬30、40、55、63、70、90和105胚齡及0、7、21和35日齡的骨骼肌進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組研究，在通城豬各發(fā)育階段骨骼肌中共鑒定出4 331個(gè)差異表達(dá)基因，而大白豬中僅有2 259個(gè)，表明通城豬的骨骼肌發(fā)育受到的調(diào)控更為復(fù)雜；此外，發(fā)現(xiàn)CXCL10、EIF2B5、PSMA6和FBXO32在通城豬骨骼肌發(fā)育過程中具有重要的調(diào)控作用。Xu等［9］對梅山豬65胚齡及3、60和120日齡的骨骼肌進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組研究，共計(jì)鑒定出338個(gè)差異表達(dá)的基因，蛋白質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)66個(gè)差異表達(dá)的基因，功能分析顯示其功能主要集中于代謝、肌原纖維細(xì)絲形成、細(xì)胞骨架形成、收縮活動(dòng)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。陳偉［10］比較了280日齡萊蕪豬和大白豬骨骼肌的轉(zhuǎn)錄組，共計(jì)鑒定出10 482個(gè)基因表達(dá)于二者的骨骼肌中，其中739個(gè)基因僅表達(dá)于萊蕪豬，差異表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，98個(gè)基因在萊蕪豬中的表達(dá)上調(diào)，80個(gè)下調(diào)。趙栓平［11］比較研究了長白豬、通城豬和五指山豬33、65和90胚齡骨骼肌的轉(zhuǎn)錄組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)長白豬、通城豬和五指山豬中分別有1 402、912和1 910個(gè)差異表達(dá)基因；三個(gè)品種豬中有190個(gè)共同的差異表達(dá)基因，長白豬和通城豬中有233個(gè)共同的差異表達(dá)基因，長白豬和五指山豬中有230個(gè)共同的差異表達(dá)基因，通城豬和五指山豬中有83個(gè)共同的差異表達(dá)基因。

地方豬種的肌內(nèi)脂肪含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于外來豬種，對二者進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組研究不僅有利于篩選出調(diào)節(jié)肌內(nèi)脂肪含量的關(guān)鍵基因，還能深入了解地方豬種高肌內(nèi)脂肪含量的分子機(jī)理。Yu等［12］研究發(fā)現(xiàn)藍(lán)塘豬背最長肌L*值、肌內(nèi)脂肪含量顯著高于長白豬，pH45分鐘值、pH24小時(shí)值和剪切力值低于長白豬，轉(zhuǎn)錄組研究共鑒定出586個(gè)差異表達(dá)的基因，其中267個(gè)高表達(dá)于藍(lán)塘豬，并鑒定出SCD基因可顯著提高多不飽和脂肪酸比率而降低飽和脂肪酸比率。Wu等［13］比較研究了30、90和150日齡的金華豬和長白豬背最長肌的轉(zhuǎn)錄組，共計(jì)鑒定出2 001個(gè)差異表達(dá)的基因，分析發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)脂肪酸生成相關(guān)基因高表達(dá)于金華豬，其中在90日齡的金華豬背最長肌中高表達(dá)的pFLJ基因與脂肪沉積相關(guān)。此外，脂肪沉積相關(guān)基因的篩選也有助于深入了解地方豬種肌內(nèi)脂肪含量高的分子機(jī)理。Xing等［14］比較研究了不同背膘厚度的松遼黑豬的皮下脂肪轉(zhuǎn)錄組，共計(jì)鑒定出188個(gè)差異表達(dá)的基因，主要富集于脂肪酸合成代謝、脂質(zhì)合成和脂肪酸代謝過程。Li等［15］比較了脂肪型地方豬和瘦肉型外來豬皮下脂肪組織的轉(zhuǎn)錄組，結(jié)果表明1 596個(gè)基因差異表達(dá)，其中84個(gè)僅表達(dá)于地方豬。

此外，包括垂體和乳腺在內(nèi)的一些地方豬種的腺體發(fā)育轉(zhuǎn)錄組也有相關(guān)報(bào)道。Shan等［16］對45、120和180日齡的巴馬香豬和45、120和240日齡的藏豬垂體組織進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組研究，分別有1 382和1 162個(gè)基因僅表達(dá)于巴馬香豬和藏豬垂體組織，巴馬香豬中按日齡依次有1 123、64和172個(gè)基因高表達(dá)，而藏豬依次有1 379、210和132個(gè)基因高表達(dá)，4個(gè)激素基因（GH、PRL、LHB和FSHB）在兩個(gè)豬種的各發(fā)育時(shí)間段均高表達(dá)。Zhao等［17］研究了妊娠80、100和110天的母豬乳腺轉(zhuǎn)錄組，比較鑒定出1 409個(gè)差異表達(dá)的基因，富集于脂肪酸合成代謝、mTOR信號通路等，其中TP53、ARNT2、E2F4和PPARG對妊娠期乳腺的后期發(fā)育具有重要的調(diào)控作用。

3 地方豬miRNA表達(dá)譜研究

microRNA（miRNA）是一系列長約22 nt的非編碼RNA，它們通過靶向mRNA的3’非翻譯區(qū)在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，研究表明細(xì)胞過程中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞循環(huán)、分化和形態(tài)轉(zhuǎn)化中表達(dá)的基因，其中大于60%的基因受miRNA直接調(diào)節(jié)［18］。

在肌肉組織中，Hou等［19］等量混合通城豬18個(gè)發(fā)育時(shí)間點(diǎn)的背最長肌總RNA后，采用Solexa技術(shù)鑒定出275個(gè)已知的miRNA，新預(yù)測出78個(gè)miRNA。Zhao等［20］從通城豬33、65、90胚齡和180日齡的骨骼肌中共計(jì)鑒定出779個(gè)miRNA，差異表達(dá)的miRNA達(dá)214個(gè)。Zhou［21］以90胚齡和120日齡大白豬和二花臉豬雜交后代的骨骼肌中共計(jì)鑒定出47個(gè)miRNA，其中29個(gè)差異表達(dá)。

在脂肪組織的研究中，通過比較不同發(fā)育階段以及不同品種的miRNA表達(dá)譜，鑒定出大量新的miRNA。Li等［22］采用Solexa技術(shù)對7和240日齡的榮昌豬背部皮下脂肪組織進(jìn)行了miRNA表達(dá)譜研究，鑒定出227個(gè)miRNA，新預(yù)測出59個(gè)，其中有126個(gè)miRNA差異表達(dá)。Chen等［23］比較研究了150日齡大白豬和梅山豬背部皮下脂肪組織miRNA表達(dá)譜，鑒定出215個(gè)差異miRNA，新預(yù)測出140個(gè)，其中142個(gè)差異表達(dá)。Li等［24］通過比較藍(lán)塘豬和長白豬脂肪組織鑒定出171個(gè)miRNA，差異表達(dá)的miRNA達(dá)48個(gè)。

在生殖器官或組織中，Li等［25］采用Solexa技術(shù)比較了210日齡藏豬睪丸組織和卵巢組織miRNA表達(dá)譜，鑒定出732個(gè)miRNA，其中336個(gè)共表達(dá)于兩個(gè)組織，分別有115和222個(gè)miRNA僅表達(dá)于卵巢和睪丸組織，且24個(gè)位于X染色體上miRNA在卵巢中的表達(dá)量顯著高于睪丸組織。Liu等［26］比較研究20和210日齡藏豬睪丸組織的miRNA表達(dá)譜，鑒定出461個(gè)miRNA，新預(yù)測出121個(gè)miRNA，差異表達(dá)的miRNA數(shù)量達(dá)303個(gè)。Lian等［27］采用Solexa技術(shù)對30和180日齡軍牧-1豬睪丸組織miRNA表達(dá)譜進(jìn)行了研究，共鑒定出469個(gè)miRNA，新預(yù)測56個(gè)，且有15個(gè)miRNA為豬特有，差異表達(dá)的數(shù)量達(dá)122個(gè)。

4 篩選地方豬種遺傳特質(zhì)的方向與啟示

綜上所述，近年來隨著分子遺傳學(xué)的迅速發(fā)展，地方豬種的種質(zhì)特性不斷被挖掘。高通量測序技術(shù)出現(xiàn)后，使得從整體水平全面解析地方豬種的這些種質(zhì)特性成為可能，這不僅有利于評估優(yōu)良種質(zhì)特性和挖掘優(yōu)異基因，還能為深入研究基因功能提供理論依據(jù)。但是，僅從轉(zhuǎn)錄組學(xué)和miRNA表達(dá)譜進(jìn)行研究，相比于復(fù)雜的生理過程，其結(jié)果顯得較為單一，且現(xiàn)有數(shù)據(jù)仍可挖掘出很多有價(jià)值的信息，因此，在利用高通量技術(shù)挖掘種質(zhì)特性的遺傳信息時(shí)，可以引入蛋白組學(xué)和GWAS（全基因組關(guān)聯(lián)分析）進(jìn)行多組學(xué)研究，達(dá)到相互印證的效果，采用多種生物信息學(xué)方法深入挖掘現(xiàn)有數(shù)據(jù)以獲得更多有價(jià)值的遺傳信息；此外，對已挖掘出的優(yōu)異基因進(jìn)行深入的功能研究也是很有必要的；高通量測序技術(shù)這種從整體水平到單個(gè)基因功能的研究模式，為其進(jìn)一步應(yīng)用于豬遺傳改良、指導(dǎo)輔助育種工作、提高選擇的效率和準(zhǔn)確度提供了理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

［1］農(nóng)業(yè)部畜牧業(yè)司.全國畜禽遺傳資源保護(hù)和利用“十二五”規(guī)劃［J］.中國豬業(yè)，2012，7（2）：19-22.

［2］于福清.我國地方豬種資源最新狀況與保護(hù)利用建議［J］.中國豬業(yè)，2012，7（3）：21-23.

［3］閆紹鵬，楊瑞華，冷淑嬌，等.高通量測序技術(shù)及其在農(nóng)業(yè)科學(xué)研究中的應(yīng)用［J］.中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012，28（30）：171-176.

［4］岳桂東，高強(qiáng)，羅龍海，等.高通量測序技術(shù)在動(dòng)植物研究領(lǐng)域中的應(yīng)用［J］.中國科學(xué)：生命科學(xué)，2012，42（2）：107-124.

［5］張全芳，李軍，范仲學(xué)，等.高通量測序技術(shù)在農(nóng)業(yè)研究中的應(yīng)用［J］.山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，45（1）：137-140.

［6］杜玲，劉剛，陸健，等.高通量測序技術(shù)的發(fā)展及其在生命科學(xué)中的應(yīng)用［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2014，41（12）：109-115.

［7］Zhao X，Mo D，Li A，et al. Comparative Analyses by Sequencing of Transcriptomes during Skeletal Muscle Development between Pig Breeds Differing in Muscle Growth Rate and Fatness ［J］. PloS One，2011，6（5）：e19774.

［8］Zhao Y，Li J，Liu H，et al. Dynamic transcriptome profiles of skeletal muscle tissue across 11 developmental stages for both Tongcheng and Yorkshire pigs［J］. Bmc Genomics，2015，16：e377.

［9］Xu Y，Qian H，F(xiàn)eng X，et al. Differential proteome and transcriptome analysis of porcine skeletal muscle during development.［J］. Journal of Proteomics，2012，75（7）：2093-2108.

［10］陳偉.萊蕪豬和大白豬背最長肌miRNA與mRNA轉(zhuǎn)錄組測序及特征分析［D］.泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

［11］趙栓平.豬骨骼肌生長發(fā)育相關(guān)基因和microRNA鑒定及其網(wǎng)絡(luò)互作分析［D］.楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2012.

［12］Yu K，Shu G，Yuan F，et al. Fatty Acid and Transcriptome Profiling of Longissimus Dorsi Muscles between Pig Breeds Differing in Meat Quality［J］. International Journal of Biological Sciences，2013，9（1）：108-118.

［13］Wu T，Zhang Z，Yuan Z，et al. Distinctive Genes Determine Different Intramuscular Fat and Muscle Fiber Ratios of the longissimus dorsi Muscles in Jinhua and Landrace Pigs［J］. PLoS One. 2013，8（1）：e53181.

［14］Xing K，Zhu F，Zhai L，et al. Integration of Transcriptome and Whole Genomic Resequencing Data to Identify Key Genes Affecting Swine Fat Deposition［J］. PloS One，2014，10（4）：e0122396.

［15］Li XJ，Yang H，Li GX，et al. Transcriptome profile analysis of porcine adipose tissue by high-throughput sequencing.［J］. Animal Genetics，2012，43（2）：144-152.

［16］Shan L，Wu Q，Li Y，et al. transcriptome profiling identifies differentially expressed genes in postnatal developing pituitary gland of miniature pig［J］. DNA Research，2013：1-10.

［17］Zhao W，Shahzad K，Jiang M，et al. Bioinformatics and Gene Network Analyses of the Swine Mammary Gland Transcriptome during Late Gestation［J］. Bioinformatics & Biology Insights，2013，7（7）：193-216.

［18］冉茂良，陳斌，尹杰，等.豬microRNA組學(xué)研究進(jìn)展［J］.遺傳，2014，36（10）：974-984.

［19］Hou XH，Tang ZL，Liu HL，et al. Discovery of microRNAs associated with myogenesis by deep sequencing of serial developmental skeletal muscles in pigs［J］. PloS One，2012，7（12）：e52123.

［20］Zhao SH，Cao JH，F(xiàn)eng Y，et al. Identification of novel regulators in porcine skeletal muscle growth by integrated analysis of miRNA and mRNA expression［A］. In：Plant and Animal Genome XX Conference［C］. 2012. 14-18.

［21］Zhou B，Liu HL，Shi FX，et al. MicroRNA expression profiles of porcine skeletal muscle［J］. Animal Genetics，2010，41（5）：499-508.

［22］Li GX，Li YJ，Li XJ，et al. MicroRNA identity and abundance in developing swine adipose tissue as determined by solexa sequencing［J］. Journal of Cellular Biochemistry，2011，112 （5）：1318-1328.

［23］Chen C，Deng B，Qiao M，et al. Solexa sequencing identification of conserved and novel microRNAs in backfat of large white and Chinese meishan pigs［J］. PloS One，2012，7（2）：e31426.

［24］Li HY，Xi QY，Xiong YY，et al. Identification and comparison of microRNAs from skeletal muscle and adipose tissues from two porcine breeds［J］. Anim Genet，2012，43（6）：704-713.

［25］Li MZ，Liu YK，Wang T，et al. Repertoire of porcine microRNAs in adult ovary and testis by deep sequencing［J］. International Journal of Biological Macromolecules，2011，7（7）：1045-1055.

［26］Liu YH，Ma JD，Chen L，et al. Comparison of microRNA transcriptomes between immature and mature porcine testes［J］. Journal of Animal and Veterinary Advances［J］，2014，13（3）：132-138.

［27］Lian CJ，Sun BX，Niu SL，et al.A comparative profile of the microRNA transcriptome in immature and mature porcine testes using solexa deep sequencing［J］. FEBS Journal，2012，279（6）：964-975.

中圖分類號：S813.9

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B

文章編號：1673-4645（2016）05-0067-04

收稿日期：2016-03-31