王鳳璐（山東省臨沂市河東區(qū)畜牧獸醫(yī)局 276000）

綿羊綠膿桿菌分離鑒定及藥物敏感性試驗

王鳳璐（山東省臨沂市河東區(qū)畜牧獸醫(yī)局 276000）

1 試驗材料與儀器

1.1 試驗材料

1.1.1 病料來源

臨沂市河東區(qū)某綿羊飼養(yǎng)場，飼養(yǎng)500余只兩月齡左右的綿山羊突然發(fā)病死亡。病羊以咳嗽，呼吸困難，流膿性鼻液，部分羊腹瀉。以急性死亡為主，2d之內(nèi)死亡12只。發(fā)病率高達20%，死亡率在16%以上。病死羊腹部膨大，剖檢可見肝臟腫大質脆，有局灶性灰白色纖維素性膜，肺水腫，內(nèi)有泡沫，尖葉、心葉肉變，間質增寬；脾腫大，包膜增厚；膽囊腫大，膽汁稀??；腎包膜增厚，有的發(fā)黃，有出血點；腸系膜渾濁，腸系膜淋巴結腫脹呈索狀，切面灰白色，小腸內(nèi)有稀薄的黃綠色內(nèi)容物；氣管喉頭充血，內(nèi)有泡沫樣黏液；有的皮下有膠凍樣滲出物；膀胱內(nèi)有黃色尿液：腹股溝淋巴結水腫。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑

普通營養(yǎng)瓊脂（購自青島高科園海博技術有限公司）、肉湯培養(yǎng)液（購自北京奧博星生物技術有限公司）、SS瓊脂培養(yǎng)基（購自北京中海生物科技有限公司）、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（購自北京陸橋生物科技有限公司）、三糖鐵培養(yǎng)基（購自購自北京陸橋生物科技有限公司）、細菌生化常規(guī)微量鑒定管（購自杭州天和微生物試劑有限公司）等。

1.1.3 藥敏試驗紙片

藥敏試紙片（杭州天和微生物試劑有限公司）。

1.1.4 試驗動物

20g左右的小白鼠10只，由獸醫(yī)預防醫(yī)學實驗室提供。

1.2 試驗儀器

SW-WJ-LCU潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術公司制造，編號A20100107）、FA2004N電子天平（上海精密科學儀器有限公司制造，出廠號55201，型號FA2004N）、生化培養(yǎng)箱（北京泰克儀器有限公司制造，型號LRH-250A）、立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠，型號YXQ-LS-SU）。

2 試驗方法

2.1 病原菌分離鑒定

2.1.1 各種培養(yǎng)基的制備

普通瓊脂培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)液、SS瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、三糖鐵培養(yǎng)基按常規(guī)進行配制，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

半固體培養(yǎng)基：在制備普通肉湯培養(yǎng)基的基礎上再加入0.3～0.5%的瓊脂粉混合加熱融化，分裝滅菌，趁熱豎立放置，待凝固后，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

血液培養(yǎng)基：將普通瓊脂培養(yǎng)基加熱融化高壓滅菌后，待冷至55℃左右加入無菌的脫纖家兔鮮血5%混合后，傾注于滅菌平皿。待凝固后放入37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h，無細菌生長的血液平板4℃保存?zhèn)溆肹1]。

2.1.2 涂片及染色

無菌操作取病死綿羊的肝臟、心血、腎臟和滲出物及分離培養(yǎng)物涂片，干燥，革蘭氏染色，鏡檢。

2.1.3 分離培養(yǎng)與觀察

無菌操作取病料肝臟、心血分別接種于普通肉湯培養(yǎng)基、普通瓊脂平板培養(yǎng)基、血液瓊脂平板培養(yǎng)基、SS培養(yǎng)基、三糖鐵培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基上，置37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h，觀察其生長變化情況。

2.1.4 運動性觀察

用滅菌的接種針取液體肉湯培養(yǎng)物穿刺半固體培養(yǎng)基，置37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h，觀察其生長情況。

2.1.5 生化試驗

用滅菌的接種針取液體肉湯培養(yǎng)物接種細菌生化常規(guī)微量鑒定管，置37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h，觀察其生長發(fā)酵情況。

2.2 動物致病性試驗

將以分離菌接種于營養(yǎng)肉湯37℃培養(yǎng)24h，應用平板稀釋法計數(shù)含菌量，使其達到8×108cfu/ml。將小鼠分成2組，每組5只，試驗組腹腔注射0.5ml菌液，對照組腹腔注射0.5ml無菌生理鹽水。隔離飼養(yǎng)1周，記錄小鼠發(fā)病率和病死率，剖檢死亡小鼠，觀察病變并分離細菌。

2.3 藥敏試驗

采用紙片平板擴散法（K-B法），取純培養(yǎng)物，無菌接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)16～18h得到幼齡菌液。取幼齡菌液0.1ml于普通營養(yǎng)瓊脂平板表面，用“T”形涂布棒涂勻，待其稍干后，用無菌鑷子將藥敏試紙均勻等距貼在培養(yǎng)基表面，置37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)18～24h，觀察并記錄抑菌圈的直徑，以抑菌圈直徑大小作為判定細菌對藥物敏感性的標準。

判定標準：抑菌直徑＜10mm為耐藥；抑菌直徑10～15 mm為中度敏感；抑菌直徑＞15 mm為高敏[2]。

3 試驗結果及分析

3.1 涂片染色結果

取培養(yǎng)物涂片固定，經(jīng)革蘭氏染色后觀察，可在顯微鏡下看到中等大小革蘭氏陰性的小桿菌，多單個存在、少部分成對存在，未發(fā)現(xiàn)芽胞和無莢膜。該形態(tài)特征與綠膿桿菌的形態(tài)特征相同。

3.2 分離培養(yǎng)結果

病料接種37℃培養(yǎng)24h觀察。結果該菌在普通培養(yǎng)基生長出光滑、濕潤、微隆起、邊緣整齊的中等大小的菌落，該培養(yǎng)均能產(chǎn)生水溶性的綠色素和熒光素，使培養(yǎng)基呈藍綠色；血液培養(yǎng)基上菌落周圍有透明的溶血環(huán)，說明該分離菌具有溶血作用；分離菌在肉湯培養(yǎng)基中呈混濁生長。上部液面呈藍綠色，表面有白色菌膜形成；在SS瓊脂上也生長良好，培養(yǎng)72h后有的菌落中央呈綠棕色；在麥康凱培養(yǎng)基上生長良好，呈白色菌落，培養(yǎng)基呈暗色；三糖鐵培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，試管底部不出現(xiàn)黃色，說明該分離菌不能產(chǎn)生硫化氫。以上培養(yǎng)特性與綠膿桿菌的培養(yǎng)特性相同。

3.3 運動性觀察結果

在穿刺的半固體培養(yǎng)基中呈放射狀生長，培養(yǎng)基上層呈綠色，說明該分離菌具有鞭毛，能運動，能產(chǎn)生水溶性的綠色素。

3.4 生化試驗結果

本菌能分解葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不分解乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇。尿素水解緩慢，不產(chǎn)生硫化氫和吲哚。能還原硝酸鹽，V-P試驗和M.R試驗均為陰性。以上結果與綠膿桿菌的生化試驗結果相同。

3.5 動物致病性試驗結果

小鼠后接種分離菌于10～20h內(nèi)全部死亡，接種小鼠死亡前均出現(xiàn)精神沉郁，身體抖動。對照組觀察7d未見異常。剖檢死亡小鼠可見肝、脾、肺、腎臟明顯腫大；脾臟嚴重充血，肝臟有出血點，腎臟出血；肺臟充血，皮下有膠凍樣淡綠色滲出液，并能從死亡的小鼠臟器中分離到接種菌。

3.6 藥敏試驗結果

分離菌株對鹽酸左旋氧氟沙星、乳酸環(huán)丙沙星高敏，對卡那霉素、丁胺卡那霉素、硫酸銨普霉素、頭孢噻呋鈉、多黏菌素、青霉素、鏈霉素等藥物產(chǎn)生了耐藥。

4 討論

（1）通過該病的流行病學、臨床癥狀、病理剖檢變化以及實驗室診斷結果綜合分析，該羊場本次疾病的發(fā)生和流行是由于綠膿桿菌感染引起。

（2）根據(jù)藥敏試驗結果，對全場發(fā)病羊飲0.5%鹽酸左旋氧氟沙星，連飲3d。全場搞好衛(wèi)生，用百勝30消毒，每日1次。同時飼喂營養(yǎng)豐富的料，該病4d得到了有效的控制。

（3）綠膿桿菌是一種條件性致病菌，對畜禽的致病力不強，未能引起人們的足夠重視。但是近年來，有關綠膿桿菌導致的畜禽疫病日漸增多，應引起重視[3]。

（4）從藥敏試驗結果可以看出，綠膿桿菌對大多數(shù)藥物產(chǎn)生了耐藥性，因此在臨床治療該病時應盡量做藥敏試驗，根據(jù)藥敏試驗的結果選擇有效藥物，以免延誤治療時機。

（5）該病預防主要是加強飼養(yǎng)管理。給予營養(yǎng)豐富的優(yōu)質飼料，禁止飼喂霉敗變質和被病原微生物污染的飼料，注重環(huán)境衛(wèi)生，定期消毒。

[1]姚火春.獸醫(yī)微生物學實驗指導（第二版）[M].中國農(nóng)業(yè)出版社,2011:19～21.

[2]韓青松,簡永利,涂宜強,等.綠膿桿菌研究進展[J].畜牧與飼料科學,2012,33（1）:122-124

[3]周學章,田東林,鄧明旭.雛雞綠膿桿菌病病原菌的分離和鑒定[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志,2004（3）:19-21.