王 勇 高 斌 賀克武

金納米粒子生物毒性的研究進展

王 勇 高 斌 賀克武

納米復(fù)合物；金；毒性；綜述

金納米材料（gold nanoparticles，GNPs）是最穩(wěn)定的貴金屬納米材料之一，納米級別的金納米材料具有宏觀金粒子所不具備的物理性質(zhì)，如量子效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)、光學(xué)效應(yīng)等。金納米材料的形式表現(xiàn)多種多樣，如球形、星形、棒狀、殼狀等，在免疫檢測、細胞成像、光熱治療、放療增敏等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景［1-3］。然而，由于納米材料與常規(guī)物質(zhì)的理化性質(zhì)不同，其生物安全性越來越受到重視。國內(nèi)外研究顯示，將一些正常物質(zhì)由微米級制作成納米級后，即可能具有潛在的生物毒性。因此，重視金納米技術(shù)的安全問題，在組織、細胞及基因?qū)用嫦到y(tǒng)性地評估金納米粒子的應(yīng)用與風(fēng)險非常關(guān)鍵。

1 金納米粒子在組織的分布

大量金納米粒子與小鼠的實驗研究表明，金納米粒子可廣泛存在于小鼠各器官組織中（表1）［4-8］，如肝臟、腎臟、脾臟、肺、心臟、腦、睪丸、骨骼、肌肉等。這些金納米粒子經(jīng)各種途徑進入小鼠各器官與組織后，與各器官組織、細胞和生物分子接觸，可能會產(chǎn)生多種潛在的生物效應(yīng)，對小鼠的健康產(chǎn)生影響。Sonavane等［7］研究發(fā)現(xiàn)，15～50 nm的金納米粒子可以通過小鼠血-腦屏障進入腦組織并積累。Zhang等［9］在實驗研究中使用13.5 nm的金納米粒子經(jīng)灌胃法喂養(yǎng)小鼠14 d［2.2 mg/（kg·d）］，在血液及骨髓細胞中均發(fā)現(xiàn)了金納米粒子的分布。

2 金納米材料的細胞毒性

2.1 金納米粒子尺寸對細胞毒性的影響 既往實驗研究發(fā)現(xiàn)，金納米粒子的尺寸與毒性之間具有依賴關(guān)系：金納米粒子尺寸越小，對細胞的毒性越強。Pan等［10］報道相對于15 nm的金納米粒子，1.4 nm金納米粒子對結(jié)締組織成纖維細胞、上皮細胞、巨噬細胞、黑色素瘤細胞有更大的細胞毒性。Liu等［11］指出5 nm的金納米粒子可以阻滯肺癌A549細胞株的細胞增殖，而20 nm與40 nm的金納米粒子則沒有這種阻滯效果。Abdelhalim［12］將10 nm、20 nm、50 nm的金納米粒子經(jīng)腹腔注入小鼠體內(nèi)后飼養(yǎng)3 d或7 d，發(fā)現(xiàn)心肌細胞出現(xiàn)代謝及結(jié)構(gòu)障礙、心肌細胞的改變與心肌細胞的細胞質(zhì)液化、慢性炎癥細胞等作用有關(guān)。該實驗中心肌細胞的改變與金納米粒子的尺寸與時間具有依賴關(guān)系：金納米粒子的尺寸越小、接觸時間越長，心肌的改變程度越明顯。在此基礎(chǔ)上，Abdelhalim等［13］又發(fā)現(xiàn)10 nm、20 nm、50 nm金納米粒子使小鼠肝細胞在慢性炎癥細胞的作用下出現(xiàn)水腫、脂肪變性、肝血竇擴張充血等改變，而且所用金納米粒子的尺寸和接觸時間均影響肝細胞改變的程度。同時，金納米粒子可能存在一個最佳的細胞吸收尺寸，Chithrani等［14］報道，Hela細胞對14 nm、50 nm金納米粒子的吸收能力因金納米粒子的尺寸不同而產(chǎn)生差異，金納米粒子的飽和濃度也不同，并發(fā)現(xiàn)50 nm金納米粒子能被Hela細胞最有效吸收。

Cardoso等［15］將10 nm、30 nm金納米粒子與生理鹽水均按70 μg/kg注入小鼠體內(nèi)，24 h或28 d后采用斬首法處死全部小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠急性或慢性攝入金納米粒子均對腦皮質(zhì)DNA有損傷作用，小鼠急性攝入金納米粒子（24 h）后，30 nm金納米粒子組對小鼠腦皮質(zhì)的損傷作用高于10 nm金納米粒子組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。這一研究表明金納米粒子的細胞毒性可能是金納米粒子的多種理化性質(zhì)和所作用的細胞系共同決定的，尺寸影響細胞對金納米粒子的吸收能力和飽和濃度，并不能決定其細胞毒性。

【作者單位】 安徽醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院介入科 安徽合肥 230061

2.2 金納米粒子濃度對細胞毒性的影響金納米粒子的濃度也是其影響細胞功能的一個重要因素，其可能原因是粒子濃度增多，大量粒子進入細胞質(zhì)，破壞了亞細胞結(jié)構(gòu)功能及細胞的增殖、運動和形態(tài)［16］。Ajdary等［17］將濃度為25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L的金納米粒子（平均為10 nm）置入小鼠體內(nèi)14 d（注射法劑量為0.3 ml/d，灌胃法劑量為0.2 ml/d），取小鼠血樣本及腎臟組織。腎臟病理分析發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，低濃度組（25 mg/L）小鼠腎實質(zhì)和腎髓質(zhì)表現(xiàn)正常，腎小體中腎小球與腎小囊顯示明顯；中濃度組（50 mg/L）中腎皮質(zhì)改變明顯，腎小囊消失，腎小球仍然可見；高濃度組（100 mg/L）中，腎皮質(zhì)與腎小體均消失，小體周圍毛細血管網(wǎng)擴張。Pernodet等［18］將不同濃度（0.2、0.4、0.6、0.8 mg/ml）的檸檬酸包覆的金納米粒子（14 nm）與人真皮成纖維細胞相互作用，發(fā)現(xiàn)真皮成纖維細胞增殖數(shù)量與濃度成反比；電子顯微鏡下進一步觀察發(fā)現(xiàn)，隨著金納米粒子濃度增高，盡管不同濃度組細胞中肌動蛋白數(shù)量仍基本相同，但是肌動蛋白的直徑卻越來越小，表明金納米粒子能作用于肌動蛋白的表達，影響細胞增殖、運動和黏附能力。

2.3 金納米粒子不同形狀及表面修飾對細胞毒性的影響金納米粒子的形狀可以影響其細胞毒性。Favi等［19］使用多分枝星形金納米粒子［AuNSTs，（33.69±8.45）nm］與裸露的球形金納米粒子［AuNSPs，（61.46±4.28）nm］作用于人皮膚成纖維細胞和鼠脂肪墊內(nèi)皮細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)AuNSPs濃度達到40 μg/ml時對兩種細胞均有致死作用，而AuNSTs濃度達到400 μg/ml時對兩種細胞的毒性作用仍弱于AuNSPs濃度。但是該實驗并不能完全說明金納米粒子不同形狀對細胞毒性有差異性的影響。尺寸影響細胞對粒子的細胞吸收能力，而該實驗所用的兩種金納米粒子直徑并不相同。

金納米粒子的表面經(jīng)不同生物分子修飾后，具有特定的功能，可以應(yīng)用于不同環(huán)境中。因為金納米粒子進入生物體內(nèi)通常均經(jīng)過表面修飾，故表面修飾物可能會影響其生物利用率。Zeng等［20］研究二氧化硅包覆的金納米粒子（GNSs）與裸露的金納米棒（GNRs）在不同表面配體作用［檸檬酸與十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）修飾］下對HepG2肝癌細胞增殖和形態(tài)的影響，在濃度為0.625 pmol/L、CTAB-GNSs 與CA-GNSs尺寸為45 nm時，CTAB-GNSs使細胞生存率減少了60.9%，細胞毒性明顯；而檸檬酸修飾的GNSs（CAGNSs）幾乎無細胞毒性。CTAB-GNSs的半抑制濃度（IC50）為0.5 pmol/L，明顯低于CA-GNSs的IC50（200 pmol/L）。Niidome等［21］在Hela細胞研究中采用MMT分析發(fā)現(xiàn)，CTAB-GNRs濃度為0.5 mmol/L有很大的細胞毒性，細胞死亡率為80%；用聚乙醇修飾劑代替CTAB后，細胞存活率為95%。上述結(jié)果表明，金納米粒子表面修飾物的不同對細胞的增殖和形態(tài)的影響具有差異性。

2.4 金納米粒子產(chǎn)生細胞毒性的機制 一般認為粒子經(jīng)內(nèi)吞作用被細胞攝取后積聚在核內(nèi)體或溶酶體，但是目前對金納米粒子產(chǎn)生細胞毒性的機制尚不明確。由于金納米粒子形狀不同、尺寸大小、表面修飾物的種類甚至表面zeta電位及作用細胞類型不同等，均可能導(dǎo)致細胞毒性產(chǎn)生的機制有差異。金納米粒子的細胞毒性機制可能是由于其可以引起細胞中自噬小體的表達和積聚，溶酶體功能障礙，活性氧和活性氮的產(chǎn)生。Ma等［22］報道10～50 nm金納米粒子的依賴吸收可引起小鼠腎臟細胞自噬體的積累和溶酶體修復(fù)障礙。Jia等［23］認為金納米粒子會引起氮的氧化物釋放到血清中，引起細胞毒性。Ng等［24］報道金納米粒子會使人肺成纖維細胞MRC-5出現(xiàn)自噬及氧化應(yīng)激，同時觀察到自噬小體的形成和自噬相關(guān)蛋白MAC-LC3及ATG7的上調(diào)及脂質(zhì)過氧化作用，蛋白質(zhì)免疫印跡分析檢測到丙二醛，進一步確定細胞發(fā)生了脂質(zhì)過氧化。

3 金納米材料的基因毒性

目前金納米粒子的毒性研究以生物代謝及細胞研究為主，基因毒性研究相對較少。金納米粒子對哺乳細胞系的基因毒性主要有DNA損傷、染色體斷裂、編碼蛋白表達異常等。Chueh等［25］進行了金納米棒（平均長度10～40 nm）對人肺成纖維細胞MRC-5的基因毒性研究，發(fā)現(xiàn)金納米棒會使MRC-5細胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)。脫氧核糖核酸微陣列分析顯示，這種應(yīng)激反應(yīng)在其DNA損傷反應(yīng)與修復(fù)、細胞周期調(diào)控、氧化還原穩(wěn)態(tài)中一直存在；ABC轉(zhuǎn)運蛋白在細胞增殖與抑制金納米棒對細胞及基因毒性中也發(fā)揮作用。聚類分析、信號通路和基因本體分析顯示，基因表達了大量編碼蛋白，以p53（3.1倍）、BRCA1（4.3倍）為著。同時，金納米棒還引起B(yǎng)ER修復(fù)基因及同源重組相關(guān)基因的表達，表明金納米粒子會引起DNA損傷和染色體斷裂，錯配修復(fù)和跨損傷DNA合成的相關(guān)基因如MLH3，Rev1表達增加。Balansky等［26］將劑量為3 mg/kg金納米粒子（40 nm、100 nm）懸浮液在雌鼠妊娠期10 d、12 d、14 d、17 d經(jīng)胎盤注入，結(jié)果100 nm組胎鼠的肝臟及外周血嗜多染紅細胞微核率顯著增加，miRNA表達增加。對實驗中胎鼠1280種miRNA進行分析，100 nm組胎鼠肺中28種miRNA上調(diào)2倍以上，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；胎鼠肝臟中5種miRNA上調(diào)，其中Let-7a與miR-183在肺和肝臟中均上調(diào)。該實驗證明了金納米粒子對胎鼠DNA具有損傷及影響相關(guān)表觀遺傳變化。

在細菌方面，Wang等［27］研究顯示，金納米粒子（16 nm）對TA102鼠傷寒沙門菌株有致突變作用。而Lopes等［28］對TA98/TA100鼠傷寒沙門菌株及費氏弧菌研究顯示，金納米棒（橫徑10 nm，長徑35 nm）對3者均無致突變效應(yīng)。由于金納米粒子不能通過細菌細胞壁，部分學(xué)者認為金納米材料關(guān)于細菌的基因毒性研究沒有意義。

4 討論及展望

金納米材料由于其獨特的理化性質(zhì)，在醫(yī)學(xué)上展現(xiàn)了巨大的應(yīng)用潛力，故其對生物體安全性的研究勢在必行。金納米材料可在生物體內(nèi)各組織分布，并具有細胞毒性和基因毒性；影響細胞的增殖和形態(tài)，使細胞發(fā)生凋亡、自噬；引起細胞DNA損傷及染色體斷裂。上述生物毒性與金納米材料的尺寸、形態(tài)、濃度、表面修飾物等均有一定的聯(lián)系。綜合分析上述因素的作用，探索金納米材料產(chǎn)生生物毒性的機制，尋找一種理想尺寸、形態(tài)及表面修飾物的金納米材料將會是金納米材料下一步的研究重點。

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（本文編輯 張春輝）

O614.123

10.3969/j.issn.1005-5185.2016.06.018

國家自然科學(xué)基金面上項目（81071240）。

高 斌 E-mail: gaobin_3136@163.com

2015-11-16

2016-02-02