鄭海青 汪晶波 劉 丹 趙華鋒 佟剛強(qiáng)

(湖北省當(dāng)陽市中醫(yī)院檢驗(yàn)科，宜昌444100)

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由CRISPR-Cas介導(dǎo)的細(xì)菌和古細(xì)菌的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)

鄭海青 汪晶波 劉 丹 趙華鋒 佟剛強(qiáng)

(湖北省當(dāng)陽市中醫(yī)院檢驗(yàn)科，宜昌444100)

最新研究發(fā)現(xiàn)，微生物有一套以核酸為基礎(chǔ)的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，這改變了之前研究者認(rèn)為的微生物免疫系統(tǒng)僅局限于固有免疫系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)[1]。細(xì)菌與古細(xì)菌通過整合外源性核酸片段到宿主染色體成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences，CRISPR)一端，從而獲得對(duì)病毒及質(zhì)粒的抗性。本文對(duì)這種免疫系統(tǒng)的功能進(jìn)行了總結(jié)，并討論了這種可遺傳的免疫系統(tǒng)的進(jìn)化意義。

1 CRISPR的生物學(xué)特性

CRISPR最早由Ishino等[2]在1987年發(fā)表的對(duì)大腸桿菌iap基因3′下游序列的描述中觀察得到，但此后一直未能引起研究者的重視。直到2002年Jansen等[3]通過生物信息學(xué)方法在細(xì)菌和古細(xì)菌基因組中找出短重復(fù)序列以及與重復(fù)序列相關(guān)的基因，并正式將此種序列命名為“成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列”(CRISPR)，與其相關(guān)的蛋白編碼基因命名為CRISPR相關(guān)基因(CRISPRE associated genes,Cas)，有關(guān)CRISPR的相關(guān)研究才真正鋪展開來。隨后對(duì)CRISPR進(jìn)行系統(tǒng)的研究發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)是一個(gè)具有不同DNA重復(fù)片段(長度為20～50個(gè)堿基對(duì))的超家族[4]，在重復(fù)片段的上游還具有cas基因，其編碼的Cas蛋白具有遺傳與功能的多樣性，且是CRISPR系統(tǒng)亞型分類的依據(jù)。盡管CRISPR重復(fù)序列具有多樣性，但大多數(shù)重復(fù)序列在3′-端都有一個(gè)保守的GAAA(C/G)基序，是一個(gè)或多個(gè)保守Cas蛋白的結(jié)合位點(diǎn)[5]。除了重復(fù)序列和間隔序列具有多樣性之外，CRISPR位點(diǎn)的數(shù)目及每個(gè)基因座的長度也是可變的。不同的CRISPR位點(diǎn)數(shù)及這些重復(fù)陣列的長度與基因組大小無關(guān)，一些最小的微生物基因組，如納米古細(xì)菌可包含多個(gè)CRISPR位點(diǎn)，且在一些基因組中，CRISPR可占染色體總量的1%以上，如硫化葉菌。重復(fù)序列-間隔序列-重復(fù)序列的模式是公認(rèn)的CRISPR位點(diǎn)決定性特征[6]。富含腺嘌呤和胸腺嘧啶的序列被稱為引導(dǎo)序列，往往位于CRISPR位點(diǎn)的兩側(cè)。比較分析顯示，最接近引導(dǎo)序列的間隔序列是最多樣的，離引導(dǎo)序列最遠(yuǎn)的重復(fù)序列往往會(huì)被降解[7]。前導(dǎo)序列含有啟動(dòng)子元件[5]和結(jié)合調(diào)節(jié)蛋白的位點(diǎn)[8]，這對(duì)CRISPR RNA(crRNA)的表達(dá)與新序列的獲得至關(guān)重要[9]。CRISPR包括三種亞型：(1)Ⅰ型CRISPR/Cas系統(tǒng)廣泛分布于細(xì)菌和古細(xì)菌中[10]。Ⅰ型系統(tǒng)包括六個(gè)不同的亞型(A～F)，所有這些類型都編碼cas3基因。cas3包含一個(gè)N末端HD磷酸水解酶結(jié)構(gòu)域和C末端DExH解旋酶結(jié)構(gòu)域[11]；(2)Ⅱ型系統(tǒng)只存在于細(xì)菌中[12]，包括四個(gè)cas基因：cas9，cas1，cas2和csn2(Ⅱ-A型)或cas 4(Ⅱ-B型)。cas9基因是該系統(tǒng)的一大特點(diǎn)，它編碼一個(gè)大型多功能蛋白，這個(gè)蛋白既參與crRNA生物合成也參與入侵DNA的降解[13]；(3)目前已鑒定出兩個(gè)Ⅲ型系統(tǒng)(Ⅲ-A型和Ⅲ-B型)[14]，這些系統(tǒng)在古細(xì)菌中更為常見。Ⅲ-B型系統(tǒng)只能與其他CRISPR類型一起發(fā)揮作用。兩個(gè)Ⅲ型系統(tǒng)都能編碼cas10和cas6基因。Cas6是CRISPR特異性的核糖核酸內(nèi)切酶，Cas10則與目標(biāo)序列的干擾相關(guān)[15]。

2 CRISPR介導(dǎo)免疫的三個(gè)階段

CRISPR/Cas系統(tǒng)介導(dǎo)的免疫保護(hù)包括三個(gè)階段：CRISPR調(diào)節(jié)、crRNA生物合成及crRNA指導(dǎo)的干擾。在噬菌體侵入的初期，CRISPR/Cas復(fù)合物首先靶向裂解噬菌體基因組中的原型間隔序列，進(jìn)而將其整合到宿主基因組中CRISPR 位點(diǎn)的5′-端。然后，這些原型間隔序列被轉(zhuǎn)錄成crRNA。最后，實(shí)現(xiàn)對(duì)入侵的噬菌體DNA 序列的干擾[16]。

2.1 CRISPR調(diào)節(jié) 大量研究表明，外源性DNA整合到CRISPR位點(diǎn)是一種普遍存在的現(xiàn)象，CRISPR轉(zhuǎn)錄子是噬菌體新型防御機(jī)制的核心組件，作用類似于真核生物的RNA干擾(RNA interference，RNAi)[17]。如Perez-Rodriguez等[18]從酸奶樣品中分離到兩種不同的噬菌體，感染嗜熱鏈球菌后篩選到九株噬菌體抗性的突變株。所有突變株都含有1～4個(gè)新的間隔序列，且這些新間隔序列均整合到了CRISPR位點(diǎn)的引導(dǎo)序列端，這表明間隔序列是提供免疫保護(hù)的關(guān)鍵所在，從而證實(shí)了噬菌體的抗性可通過在CRISPR位點(diǎn)插入或刪除噬菌體靶向間隔來達(dá)到增強(qiáng)或削弱的目的。雖然間隔序列的整合機(jī)制仍然尚不明確，但基于研究者對(duì)嗜熱鏈球菌和大腸桿菌的研究，目前已鑒定出了幾種參與該過程的Cas蛋白。如Babu等[19]研究發(fā)現(xiàn)，Cas1和Cas2是參與整合過程的保守核酸酶。值得注意的是，Cas1和Cas2的過表達(dá)足以在大腸桿菌BL21(DE3)染色體的內(nèi)源性CRISPR位點(diǎn)前導(dǎo)序列端添加新的間隔序列重復(fù)單元[20]。目前，前導(dǎo)序列端的準(zhǔn)確識(shí)別機(jī)制尚不明確，但可以肯定的是，前導(dǎo)序列的突變能夠阻斷轉(zhuǎn)錄且不干擾整合；與此相反，引導(dǎo)序列的前60個(gè)核苷酸的突變可使整合終止。引導(dǎo)序列的前60個(gè)核苷酸是必需的，但至少有一個(gè)重復(fù)序列，整合過程才會(huì)發(fā)生。除了Cas1和Cas2外，大腸桿菌I-E型的CRISPR系統(tǒng)還包括六種其他的Cas蛋白。雖然這些蛋白并非是獲得新序列的必需蛋白，但當(dāng)系統(tǒng)中存在這些蛋白質(zhì)時(shí)，新序列的獲得模式會(huì)發(fā)生變化[21]。如Swarts等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在大腸桿菌系統(tǒng)中有完整的8種(類型I-E家族)cas基因，CRISPR位點(diǎn)往往通過獲得多個(gè)新的間隔序列而增大。第一個(gè)間隔序列的獲取往往會(huì)加速隨后的間隔序列的獲得，并且所有的間隔序列可來源于同一個(gè)DNA鏈。此外，噬菌體抗性水平的增加也與目標(biāo)特異性的間隔序列的數(shù)量相關(guān)；因此，對(duì)特定信號(hào)響應(yīng)的快速延伸的CRISPR位點(diǎn)的機(jī)制可限制噬菌體突變的機(jī)會(huì)。

2.2 CRISPR RNA的生物合成 2008年，Brouns等[23]確定了CRISPR特異性內(nèi)切核糖核酸酶Cas6e(以前稱作CasE或Cse3)對(duì)大腸桿菌(I-E型)中前體crRNA的處理，Cas6e是多樣性蛋白大家族中的一員，這個(gè)家族被稱為重復(fù)序列相關(guān)的神秘蛋白質(zhì)(Repeat-associated mysterious proteins，RAMP)。所有的RAMP蛋白都含有至少一種RNA識(shí)別基序(RNA recognition motif，RRM)和保守的富含甘氨酸的環(huán)(Glycine rich loop，G環(huán))。RRMs由一個(gè)保守的β1α1β2β3α2β4排列組成，其中β鏈組成了四條鏈反平行排列的β片層，兩個(gè)螺旋一起位于片層的一面[24]。這種折疊已在多種不同的RNA結(jié)合蛋白中發(fā)現(xiàn)，常常通過位于β-片層開放面的保守殘基結(jié)合RNA。Cas6e蛋白質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)揭示了兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成一個(gè)N端和C端的RRM[25]。一個(gè)富含脯氨酸的短接頭連接兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，β-片層中的各個(gè)RRM面之間則形成蛋白質(zhì)表面上的V形槽。這個(gè)裂縫最初預(yù)測(cè)是RNA結(jié)合面，但Cas6e與crRNA結(jié)合的共結(jié)晶結(jié)構(gòu)揭示了一個(gè)非典型的結(jié)合機(jī)制，涉及到序列和結(jié)構(gòu)的特異性相互作用，主要是位于蛋白的相反面。大腸桿菌CRISPR的重復(fù)序列部分回文，產(chǎn)生一個(gè)具有穩(wěn)定7 nt的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA，有一個(gè)由GCGU四環(huán)組成的帽子結(jié)構(gòu)。Cas6e C-末端結(jié)構(gòu)域帶正電的β-發(fā)夾與RNA雙鏈體的大溝相互作用，且位于蛋白質(zhì)帶正電裂縫的3′-鏈磷酸骨架上[26]。RNA結(jié)合誘導(dǎo)構(gòu)象的變化，從而破壞莖的底部堿基對(duì)，并且發(fā)生在酶活性位點(diǎn)伸展構(gòu)象的易斷裂磷酸上。切除機(jī)制是不依賴金屬離子的，并且發(fā)生在莖的基部，產(chǎn)生一個(gè)有5′-羥基和2′,3′-環(huán)狀磷酸酯的成熟crRNA。成熟的crRNA(～61 nt)由32-nt的間隔序列相鄰的5′-端8-nt的重復(fù)序列(也稱為5′手柄)和21個(gè)核苷酸的3′端的21-nt的剩余重復(fù)序列組成的。Cas6e仍然綁定到3′-莖-環(huán)結(jié)構(gòu)作為召集大型監(jiān)測(cè)復(fù)合物-CRISPR內(nèi)切核糖核酸酶復(fù)合體(CRISPR ribonuclease complex，Cascade)的核點(diǎn)，這是免疫系統(tǒng)下一步沉默靶基因所必需的[27]。

2.3 CRISPR RNA指導(dǎo)的干擾 所有的crRNAs都可與Cas蛋白聯(lián)系形成大的CRISPR相關(guān)的核糖核蛋白復(fù)合物，但這些復(fù)合物是如何在擁擠的含有大量非目標(biāo)核酸(非靶RNA和DNA)的胞內(nèi)環(huán)境中找到與crRNA互補(bǔ)的短目標(biāo)序列的呢？研究表明，許多DNA結(jié)合蛋白能夠用比純粹的隨機(jī)碰撞高得多的手段定位它們的同源結(jié)合位點(diǎn)。一些蛋白質(zhì)通過靜電吸引到帶負(fù)電荷的糖-磷酸主鏈，進(jìn)而非特異結(jié)合到DNA上加速靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)。最初的結(jié)合后往往發(fā)生分子內(nèi)易位，被稱為一維滑動(dòng)。與耗能馬達(dá)蛋白(即聚合酶、解旋酶、錯(cuò)配修復(fù)酶和Ⅰ型限制性內(nèi)切酶)的定向運(yùn)動(dòng)相反，DNA滑動(dòng)是熱擴(kuò)散驅(qū)動(dòng)的能源獨(dú)立的過程[28]。然而，DNA的初步結(jié)合是一個(gè)沒有引導(dǎo)的過程，受到一維擴(kuò)散的限制。因此，一個(gè)包括3D組件的搜尋過程可加速靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)。所有CRISPR系統(tǒng)目標(biāo)的識(shí)別都包括crRNA-間隔區(qū)序列與互補(bǔ)核酸靶序列的雜交。大腸桿菌的crRNA引導(dǎo)監(jiān)視復(fù)合物為Cascade，其可優(yōu)先結(jié)合到長的負(fù)超螺旋雙鏈DNA(質(zhì)?；蚴删wDNA)上[29]。負(fù)超螺旋壓縮雙鏈DNA，從而1D距離很遠(yuǎn)的序列可在3D空間位置上接近，從而大大加快了雙鏈DNA結(jié)合蛋白的搜尋過程[30]。此外，負(fù)超螺旋狀態(tài)，有利于鏈的分離。如Westra等[31]最近發(fā)現(xiàn)負(fù)超螺旋提供了分離32 nt雙鏈DNA大約一半的能量。crRNA間隔序列的前8個(gè)核苷酸對(duì)靶標(biāo)的結(jié)合最為重要。crRNA間隔序列區(qū)域被認(rèn)為是種子序列，并且與種子序列互補(bǔ)的靶序列的單核苷酸突變會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的結(jié)合缺陷。與此相反，即使靶標(biāo)上非種子序列出現(xiàn)多個(gè)錯(cuò)配，仍可進(jìn)行高親和力結(jié)合，并可在噬菌體感染期間發(fā)揮正常作用[32]。

3 CRISPR介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫及其應(yīng)用

在篩選噬菌體抵抗的嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus,S.thermophilus)過程中，Barrangou等[32]首次闡明S.thermophilus對(duì)噬菌體產(chǎn)生的抵抗作用是由其CRISPR從噬菌體基因組中獲得新的間隔序列而得到的，這種與噬菌體DNA高度同源的片段一旦整合進(jìn)入細(xì)菌基因組DNA中便產(chǎn)生了具有該噬菌體特異性抗性的菌株。此后Garneau等[33]研究發(fā)現(xiàn)S.thermophilus亦能從外源性質(zhì)粒中獲得間隔序列，從而通過RNA介導(dǎo)的Cas蛋白特異性地清除質(zhì)粒，產(chǎn)生對(duì)該質(zhì)粒免疫的菌株。

CRISPR介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)與哺乳動(dòng)物相較，都具有特異性、多樣性以及記憶性這三大特征。CRISPR系統(tǒng)通過將與噬菌體、病毒或者外源質(zhì)粒同源的片段整合進(jìn)間隔序列中，以此獲得相應(yīng)的特異性清除噬菌體、病毒或質(zhì)粒DNA的能力。同時(shí)通過將不同來源的DNA片段整合進(jìn)入間隔序列，細(xì)菌由此實(shí)現(xiàn)CRISPR適應(yīng)性免疫的多樣性。并且由于新的間隔序列直接整合進(jìn)入基因組當(dāng)中，該免疫特性得以在細(xì)胞分裂過程中予以保留并最終實(shí)現(xiàn)免疫記憶[34]。

CRISPR的應(yīng)用目前主要集中于生物醫(yī)藥及發(fā)酵奶制品菌種改造和分子生物技術(shù)兩方面。事實(shí)上，CRISPR在S.thermophilus中作用機(jī)制的闡明便得益于工業(yè)化生產(chǎn)中對(duì)噬菌體抗性菌株的強(qiáng)烈需求，由此推動(dòng)了相關(guān)分子機(jī)制的研究，并由此在生產(chǎn)實(shí)踐中對(duì)工業(yè)上生產(chǎn)用菌株進(jìn)行改造，通過CRISPR篩選獲得對(duì)噬菌體等病毒具有抗性的菌株，達(dá)到減少生產(chǎn)過程中噬菌體污染的所帶來經(jīng)濟(jì)損失的目的[35]。除此之外，CRISPR作用機(jī)制發(fā)現(xiàn)的更大意義在于其帶給分子生物學(xué)領(lǐng)域的重大技術(shù)革新，CRISPR/Cas9在基因編輯上的優(yōu)勢(shì)使其迅速得到應(yīng)用并與RNAi技術(shù)并列成為日常實(shí)驗(yàn)中哺乳動(dòng)物基因敲除手段之一[36]。甚至于中國科學(xué)家最近使用CRISPR/Cas9技術(shù)成功地對(duì)人廢棄胚胎β球蛋白基因進(jìn)行了敲除，雖然這一實(shí)驗(yàn)引起了世界范圍內(nèi)的巨大爭(zhēng)議，但仍然應(yīng)該看到CRISPR/Cas9在未來進(jìn)行人類疾病基因治療的潛力[37]。

4 結(jié)論與展望

20世紀(jì)80年代，海洋病毒學(xué)家報(bào)道，1升海水中含有大約一百億個(gè)噬菌體，而這些病毒被普遍認(rèn)為是地球上最豐富多樣的生物，這些病毒帶來的選擇壓力對(duì)微生物群落的組成和行為產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響，微生物宿主已經(jīng)進(jìn)化形成了不同的機(jī)制來逃避感染[38]。除了以限制修飾和受體轉(zhuǎn)變?yōu)榇淼南忍旆烙鶛C(jī)制外，近八年的研究發(fā)現(xiàn)微生物還有一套以核酸為基礎(chǔ)的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)-CRISPR。無論從論文數(shù)還是論文質(zhì)量來看，CRISPR無疑是近三年來的研究明星。隨著對(duì)CRISPR研究的深入，該系統(tǒng)的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值將會(huì)愈發(fā)凸顯。

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[收稿2015-09-07 修回2015-12-23]

(編輯 張曉舟)

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.04.035

鄭海青(1975年-)，男，主管技師，主要從事微生物及分子免疫學(xué)相關(guān)研究，E-mail:ycdyzhenghaiqing@sina.com。

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