白小明

(朝陽市建平縣職業(yè)教育中心,遼寧朝陽 122400)

實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)在動物疫病診斷中的應(yīng)用

白小明

(朝陽市建平縣職業(yè)教育中心,遼寧朝陽 122400)

隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，熒光定量PCR不僅實(shí)現(xiàn)了從定性到定量的飛躍，且同常規(guī)PCR相比，能夠在同一溶液當(dāng)中實(shí)現(xiàn)不同反應(yīng)，且無須后處理，具有靈敏度高以及特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。通過其在動物疫病檢疫中的應(yīng)用，具有較好的診斷效果以及應(yīng)用價(jià)值。

1 禽流感病毒檢測

目前，禽流感已經(jīng)在世界范圍內(nèi)分布，大部分都為隱性感染，沒有特殊臨床表現(xiàn)，僅僅有少數(shù)類型具有高致病以及傳播迅速的特征。由于該病毒具有較為頻繁的變異特征，且具有較多的血清類型，在國外，以往經(jīng)常以雞胚病毒分離方式進(jìn)行病毒檢測，不僅檢測時(shí)間較長，且檢測血清類型較多。目前，我國已有學(xué)者根據(jù)病毒型開發(fā)設(shè)計(jì)出具有特異、敏感特征的引物探針，建立出能夠?qū)崿F(xiàn)A型病毒的熒光PCR。

2 新城疫病毒檢測

該病毒根據(jù)其致病能力的不同可以分為弱毒、中等毒以及強(qiáng)毒力型。在以往診斷中，同樣需要以雞胚病毒分離方式進(jìn)行檢測，所需時(shí)間相對較長。在我國，張鶴曉等建立的熒光PCR法不僅能夠?qū)⑷跣鲁且卟《就袕?qiáng)毒力的新城疫病毒進(jìn)行區(qū)分，且不會同常見病毒發(fā)生交叉反應(yīng)，即具有較高的敏感性。Tan SW等也通過SYBR技術(shù)對新城疫病毒在定量以及定性方面分別開展分析，最終通過融解曲線實(shí)現(xiàn)PCR的定性分析。通過熒光PCR在新城疫病毒檢測當(dāng)中的應(yīng)用，不僅能夠獲得同雞胚分離一致的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，且能夠證明該方式具有快速、安全、敏感以及特異性特點(diǎn)。

3 鴨乙肝病毒檢測

鄒文等學(xué)者通過SYBR PCR技術(shù)的應(yīng)用對鴨乙肝病毒進(jìn)行檢驗(yàn)，經(jīng)過檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該技術(shù)是對DHBV進(jìn)行檢測的新方式，具有敏感、特異以及簡便的特征。陳壓西等對鴨乙肝病毒核酸PCR技術(shù)進(jìn)行了建立，并將其應(yīng)用在鴨血清病毒核酸監(jiān)測當(dāng)中，在實(shí)現(xiàn)目標(biāo)體內(nèi)復(fù)制情況分析的基礎(chǔ)上為鴨肝炎病毒在評價(jià)、發(fā)病機(jī)理以及抗病毒療效預(yù)測方面提供了重要依據(jù)。

4 豬瘟病毒檢測

目前，現(xiàn)有的常規(guī)方式很難對帶毒豬、隱性感染豬以及弱毒免疫豬進(jìn)行區(qū)分。陳玉棟等在豬瘟病毒弱毒疫苗5端非編碼區(qū)對一條熒光探針以及引物進(jìn)行了設(shè)計(jì)，在同LC監(jiān)測系統(tǒng)相結(jié)合的基礎(chǔ)上對豬瘟兔化弱毒疫苗的監(jiān)測方式進(jìn)行了建立，不僅具有較高的靈敏度，且檢測耗時(shí)較短，僅僅需要4h。而溫國元等，則將5端非編碼區(qū)作為擴(kuò)增靶區(qū)進(jìn)行試驗(yàn)，對Tapman探針以及兩條引物進(jìn)行設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)了熒光PCR檢測方式的建立。該方式靈敏度更高，可以達(dá)到10拷貝/μl，具有較好的應(yīng)用效果。

5 偽狂犬病毒

口蹄疫是一種對偶蹄動物具有強(qiáng)烈傳染性的疾病，危害非常大。花群義等根據(jù)聚合酶3D基因片段以保守區(qū)域方式實(shí)現(xiàn)探針以及引物的設(shè)計(jì)，在擴(kuò)增區(qū)當(dāng)中，口蹄疫病毒A、C、O型序列相同，在將探針同引物共同應(yīng)用的情況下實(shí)現(xiàn)熒光PCR方式的建立。楊素等人所建立的熒光PCR技術(shù)，則對傳統(tǒng)技術(shù)中病毒鑒定準(zhǔn)確性差、敏感性差以及用時(shí)較長的缺點(diǎn)進(jìn)行了克服，在對環(huán)境污染、病毒擴(kuò)散缺點(diǎn)積極避免的基礎(chǔ)上應(yīng)用在大批量樣品檢測當(dāng)中。

6 炭疽芽孢桿菌檢測

Makino等通過炭疽特異性引物實(shí)現(xiàn)EQ PCR檢測，在該方式中，能夠有效地實(shí)現(xiàn)空氣中細(xì)菌芽孢的檢測。李偉等人通過熒光PCR技術(shù)的應(yīng)用，在pXI1質(zhì)粒上pag基因?qū)崿F(xiàn)基因探針以及引物的設(shè)計(jì)，對具有定性、快速、定量以及準(zhǔn)確特征的炭疽芽孢桿菌檢測方式進(jìn)行了建立。陳蘇紅等人，在pXO1上pag基因以及pXO2上cap基因作為特異引物，在以DNA進(jìn)行嵌入之后實(shí)現(xiàn)定量擴(kuò)增，并在PCR后實(shí)現(xiàn)曲線分析，以此觀察產(chǎn)物是否為之前設(shè)定的目的產(chǎn)物。在將該方式應(yīng)用在炭疽芽孢桿菌檢測后，靈敏度在1000拷貝以上。

7 胸膜肺炎放線桿菌檢測

李樹清等人根據(jù)apx IV A基因序列對相應(yīng)探針以及引物進(jìn)行設(shè)計(jì)，在此基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)熒光PCR技術(shù)的建立并將其投入應(yīng)用。經(jīng)過試驗(yàn)操作，在150份樣品當(dāng)中檢測出23份APP陽性的樣品。

8 寄生蟲病

寄生蟲病方面，劉世國等人通過PCR技術(shù)的應(yīng)用實(shí)現(xiàn)感染弓形蟲血液蟲體的觀察。王頻佳等人則通過弓形蟲529bp傳入大腸桿菌方式實(shí)現(xiàn)重組質(zhì)粒的構(gòu)建，在將其作為模板的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)熒光PCR標(biāo)曲建立，對具有特異、快速以及靈敏特征的PCR方式進(jìn)行了建立。此外，近年來也具有毛圓線蟲、立克次氏體以及小隱孢子蟲的相關(guān)檢測報(bào)道。

熒光PCR技術(shù)在具體應(yīng)用中具有準(zhǔn)確、實(shí)時(shí)以及快速的特點(diǎn)，具有較好的研究前景。在未來研究中，要繼續(xù)做好不同疾病PCR檢測方式的建立，以此更好的發(fā)揮該技術(shù)使用效果。

[1] 張彩鳳.PCR相關(guān)技術(shù)在動物疫病檢疫檢測上的應(yīng)用[J].現(xiàn)代農(nóng)村科技，2012，（1）：155-156.

[2] 白舟，李顥，謝佳，趙曉祥.熒光定量PCR法檢測鄰苯二甲酸酯的研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，（4）：177-179.

[3] 曹龍凱，郭春華.標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)流程[J].飼料博覽，2012，（4）：222-224.