陳雪姣，趙偉鋒，溫一陽，王朝杰，付　蕾，胡金龍，白　冰，倉順東

(鄭州大學附屬人民醫(yī)院,河南 鄭州 450003)

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肝癌組織中SRC-3的表達及其與肝癌臨床病理特征的關系

陳雪姣，趙偉鋒，溫一陽，王朝杰，付蕾，胡金龍，白冰，倉順東

(鄭州大學附屬人民醫(yī)院,河南 鄭州 450003)

[摘要]目的探討肝癌組織中類固醇受體共激活因子-3(SRC-3)表達及其與肝癌臨床病理特征的關系。方法采用免疫組織化學染色和RT-PCR檢測80例肝癌組織和癌旁組織中SRC-3蛋白和mRNA表達水平。結果肝癌組織中SRC-3蛋白陽性表達率為56.25%，明顯高于癌旁組織的8.75%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。58例肝癌組織中SRC-3 mRNA呈高水平轉錄，癌旁組織僅有12例出現高水平轉錄，肝癌組織中SRC-3 mRNA轉錄水平較癌旁組織明顯升高(P<0.05)。合并乙型肝炎病毒(HBV)感染肝癌患者SRC-3蛋白表達陽性率為63.49%，明顯高于未合并HBV感染肝癌患者的29.41%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；甲胎蛋白(AFP)<400 ng·mL-1肝癌患者SRC-3蛋白表達陽性率為76.19%，明顯高于AFP≥400 ng·mL-1肝癌患者的49.15%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；高分化肝癌患者SRC-3蛋白表達陽性率為 88.24%，明顯高于中、低分化患者的47.62%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論SRC-3的高表達與肝癌的疾病進展關系密切，可能成為潛在的肝癌分子標志物或治療靶點。

[關鍵詞]肝癌；類固醇受體共激活因子-3；免疫組織化學染色；RT-PCR

近年來，新增肝癌病例逐年增多，其早期癥狀輕微，不易被診斷并及時治療，故患者被確診時多處于中晚期，部分甚至出現遠處轉移的癥狀[1]，導致其治療難度較大，同時患者預后性較差，死亡率極高，故準確查明肝癌的發(fā)病機制以提高其早期診斷的準確性，已成為延長患者生存時間的關鍵點[2]。類固醇受體共激活因子-3(steroid receptor coactivator -3，SRC-3)作為新發(fā)現的一種原癌基因，其蛋白編碼類似固醇激素受體，具有激活轉錄細胞染色體片段的功能，若其在人體內過表達可導阻斷或影響多種信號通路[3]，從而刺激或抑制腫瘤生成。本研究采用免疫組織化學染色和RT-PCR檢測2013年5月至2015年5月在我院治療的80例肝癌患者的肝癌組織和癌旁組織中SRC-3蛋白和mRNA表達水平，以探討SRC-3表達與肝癌臨床病理特征的關系，現將結果報道如下。

1資料與方法

1.1研究對象選取2013年5月至2015年5月在我院治療的肝癌患者80例，納入標準[4]：1)均為行肝癌切除術患者；2)手術前未進行過放療、化療、介入等治療；2)術后病理檢查證實為肝細胞肝癌；4)患者及家屬知情同意，并簽署同意書。排除標準：患者臨床病理資料缺失；術前行過放療、化療、介入治療。80例肝癌患者中，男57例，女23例；年齡32～73(53.19±12.40)歲。本次研究通過了院內倫理委員會批準。

1.2標本采集納入研究的80例肝癌患者手術切除后均獲取的新鮮組織標本，送檢經術后病理檢查確診為肝細胞肝癌。標本獲取即可放于液氮標本罐中，并冷存于-80 ℃低溫冰箱中，后用質量分數4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，HE染色。

1.3儀器和試劑NCOA3多克隆抗體購自上海研晶實業(yè)科技有限公司；生物素標記的羊抗兔二抗購自上海研卉生物科技有限公司；RNA Trizol、PrimeScript RT reagent逆轉錄試劑盒及2×Taq PCR Mastennix均購自日本TAKARA(大連)公司；凝膠成像分析系統(tǒng)購自上海志行儀器設備有限公司；醫(yī)用冰箱購自安徽中科都菱商用電器股份有限公司。

1.4SRC-3引物設計按照SRC-3的cDNA序列排列，使用Primer 3.0軟件對PCR引物進行設計，序列如下：P1(上游引物)：5’-TCTGGG-GACTAAGCAACAGG-3’，P2(下游引物)：5’-AGTCACATTTCG-GTTTGGCC-3’，擴增產物為262 bp。以β-actin基因表達產物作為內參照設計PCR引物，序列如下：P1：5’-CCTGGCACCCAGCACAAT-3’：P2：5’-GGGCCGGACTCGTCATACT-3’，擴增產物為143 bp，由美國Invitmgen公司合成。

1.5SRC-3蛋白檢測肝癌組織及癌旁組織中SRC-3蛋白檢測采用免疫組織化學S-P法。肝癌組織及癌旁組織切片置于65 ℃烤箱中加溫30 min，后逐步脫蠟及水化，加入質量分數3% H2O2除去內源性過氧化物酶，接著放入室溫條件下孵育10~15 min，使用PBS沖洗1次，加入0.01 moL·L-1的檸檬酸PBS緩沖液緩慢加溫至95~98 ℃攪拌修復20 min，然后放于室溫條件下慢慢冷卻，選擇PBS沖洗，再加入體積分數5%山羊血清后封閉置于37 ℃靜置20 min，加入兔抗人SRC-3抗體放入4 ℃孵育箱靜置過夜，取出放入37 ℃條件下解凍30 min，PBS沖洗后滴加羊抗兔二抗，于37 ℃孵育20 min，行PBS沖洗并滴入鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物，置于37 ℃條件下孵育20 min，PBS沖洗后滴加DAB顯色，在顯微鏡觀察下控制染色試劑反應時間，達到理想染色時即刻用蒸餾水沖洗以終止反應，后行蘇木素復染，脫水、透明，最后用中性樹膠封固。

1.6SRC-3 mRNA轉錄水平檢測RT-PCR法檢測SRC-3 mRNA轉錄：取100 mg肝癌組織及癌旁組織后用Trizol法常規(guī)提取總RNA，后用分光光度計檢測定量后，抽取2 μg總RNA，按照試劑盒操作說明對cDNA行逆轉錄合成。以β-actin作為內參，對半定量PCR行擴增。條件為：94 ℃溫度下，預變性5 min，變性30 s，55 ℃溫度下退火30 s，72 ℃溫度下延伸30 s，行循環(huán)30次，72 ℃溫度下延伸5 min。反應得到PCR產物放入4 ℃冰箱下冷存，后取10 μL擴增產物，DAB染色后加質量分數1.5%瓊脂糖凝膠電泳30 min，后取反應物在凝膠成像儀下觀察PCR擴增結果。

1.7免疫組織化學結果判斷免疫組織化學染色陽性為細胞內出現淡黃至棕褐色顆粒。采用二級計分法，將陽性著色細胞占視野內細胞百分比和細胞著色強度得分結合計算[6]。陽性細胞≤10%為0分，11%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分。細胞著色強度[7]：棕褐色為3分，棕黃色為2分，淡黃色為1分，不著色為0分。陽性細胞百分比得分和細胞著色強度得分乘積，≤1分為陰性，>1分為陽性。

2結果

2.1SRC-3蛋白在肝癌組織和癌旁組織中的表達SRC-3蛋白陽性染色主要表現為細胞質內呈棕黃色顆粒，分布呈彌漫或局灶狀(圖1)。肝癌組織中SRC-3蛋白陽性表達率為56.25%，明顯高于癌旁組織的 8.75%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1　SRC-3蛋白在肝癌組織和癌旁組織中的表達

圖1　SRC-3 在肝癌組織(A)和癌旁組織(B)中的表達情況(S-P，×400)

2.2SRC-3 mRNA在肝癌組織和癌旁組織中的轉錄水平58例肝癌組織中SRC-3 mRNA呈高水平轉錄，癌旁組織僅有12例出現高水平轉錄，肝癌組織中SRC-3 mRNA轉錄水平較癌旁組織明顯升高(P<0.05)。見表2。

表2　SRC-3 mRNA在肝癌組織和癌旁組織中的轉錄水平

2.3SRC-3蛋白表達與其臨床病理特征的關系合并乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染肝癌患者SRC-3蛋白表達陽性率為63.49%，明顯高于未合并HBV感染肝癌患者的29.41%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)<400 ng·mL-1肝癌患者SRC-3蛋白表達陽性率為 76.19%，明顯高于AFP≥400 ng·mL-1肝癌患者的49.15%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；高分化肝癌患者SRC-3蛋白表達陽性率為88.24%，明顯高于中、低分化患者的47.62%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3　SRC-3蛋白表達與其臨床病理特征的關系

3討論

現代醫(yī)學已證明，肝癌的形成過程漫長且極其復雜，其可能因機體內肝臟組織細胞增殖及生長的調控過程出現異常所致[8]。人體內各種細胞包括肝組織細胞增殖由受多種調節(jié)因子調控，其中包括生長因子及其受體、基因轉錄因子、各類信號傳導蛋白及增殖-凋亡調控蛋白酶等，這些因子均可顯著影響腫瘤生成及生長，并有效促進或抑制細胞凋亡[9]。近年來，有學者在研究乳腺癌致病機制的過程中，新發(fā)現一種核激素受體轉錄共激活因子SRC-3，經實驗證明其與乳腺癌腫瘤細胞轉錄擴展具有密切關系[10]。研究[11]顯示，SRC-3能夠與細胞核受體、核因子кB(NF-кB)、激活蛋白-1(AP-1)和組蛋白乙酰轉移酶及甲基轉移酶等人體因子或蛋白結合、相互作用，使得細胞內染色體得到重建，并促進靶基因轉錄。SRC-3能夠有效促進細胞的生長及增殖，還可顯著調節(jié)細胞代謝和信號傳導中發(fā)揮著重要的作用，同時人體細胞內SRC-3表達水平及活性的改變會導致相關細胞因子呈現連鎖式異變，從而造成整個細胞出現變異或癌變化。

在本研究中，通過免疫組織化學染色檢測肝癌組織及癌旁組織標本中SRC-3的表達，我們可以觀察到SRC-3蛋白陽性染色表現為細胞質內呈棕黃色顆粒，染色結果顯示肝癌組織中SRC-3蛋白陽性表達率為56.25%，而癌旁組織中SRC-3蛋白陽性表達率明顯要低，僅為8.75%。結果顯示，肝癌組織中SRC-3呈現異常性高表達。同時，我們觀察染色后的標本，可見SRC-3染色呈彌漫或局灶狀分布，肝癌組織染色顆粒較集中，而癌旁組織染色顆粒分散。故我們可推測SRC-3和肝細胞的合成、增殖、凋亡及代謝信號傳導等生理活動具有一定相關性，若其表達異?？蓪е赂渭毎愖兂筛伟┘毎?。

SRC-3 mRNA水平在乳腺癌組織內及子宮內膜癌組織內的表達水平明顯高于正常乳腺及子宮內膜組織。本研究結果顯示，肝癌組織中SRC-3 mRNA呈高水平轉錄的標本數量明顯高于癌旁組織，同時肝癌組織中SRC-3 mRNA轉錄水平較癌旁組織明顯升高。現代臨床研究[12]證實，慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎患者均是肝癌的高發(fā)群體，這是因為肝炎病毒復制與肝癌產生機制間具有明顯相關性，HBV繼發(fā)肝硬化后進一步導致肝癌概率最高，據統(tǒng)計，約70%~90%的慢性乙型肝炎患者在肝硬化后均出現肝癌。同時，HBV可促使細胞染色體的融合，并可反式激活細胞基因，提高細胞內SRC-3表達后呈現高水平轉錄，并和NF-κB相互作用，導致基因轉錄異變后插入肝組織細胞主基因序列段內，導致其RNA轉錄異變，促使細胞癌變。故在研究中，合并HBV感染肝癌患者SRC-3蛋白表達陽性率明顯高于未合并HBV感染肝癌患者。同時，在本研究中，我們還發(fā)現AFP<400 ng·mL-1肝癌患者SRC-3蛋白表達陽性率明顯高于AFP≥400 ng·mL-1肝癌患者，這是因為肝癌腫瘤患者可致體內AFP水平呈現高表達，其已作為常規(guī)篩選肝癌患者檢測標志物。其于正常人體內的濃度標準約為20 ng·mL-1，高表達標準為400 ng·mL-1，其代表患者肝癌直徑較大且已彌散至不同的肝葉上。同時，研究中高分化肝癌患者SRC-3蛋白表達陽性率也明顯高于中、低分化患者。因此，我們推斷肝癌患者腫瘤分期及分化程度越高，其肝組織內SRC-3水平越高，故我們認為SRC-3表達水平還可預測患者預后及未來存活率。

綜上所述，SRC-3表達水平變化與肝癌患者臨床病理特征具有一定相關性，能夠被作為一種潛在的肝癌分子標志物用于未來肝癌治療的新靶點。

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SRC-3 Expression in the Hepatocellular

Carcinoma and Its Relationship with Clinicopathological Features

Chen Xuejiao,Zhao Weifeng,Wen Yiyang,Wang Zhaojie,Fu Lei,Hu Jinlong,Bai Bing,Cang Shundong

(DepartmentofOncology,thePeople’sHospitalAffiliatedtoZhengzhouUniversity,Zhengzhou450003,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the expression of steroid receptor coactivator-3(SRC-3)in the hepatocellular carcinoma tissues and its relationship with clinicopathological features.Methodsimmunohistochemical staining and RT-PCR were used to detect SRC-3 protein and mRNA expression levels in the 80 cases of hepatocellular carcinoma and paraneoplastic tissues.ResultsThe positive expression rate of SRC-3 protein in hepatocellular carcinoma tissues was 56.25%,which was significantly higher than that(8.75%)in the paraneoplastic tissues(P<0.05).SRC-3 mRNA was high level transcription in the 58 cases of hepatocellular carcinoma,and was 12 cases in the paraneoplastic tissues,SRC-3 mRNA transcription level in the hepatocellular carcinoma was significantly increased than the paraneoplastic tissue(P<0.05).The positive rate of SRC-3 protein expression in the patients with hepatitis B virus (HBV) infection was 63.49%,which was significantly higher than that(29.41%)of patients with non HBV infection,the difference was statistically significant(P<0.05); the positive rate of SRC-3 protein expression in the patients with alpha-fetoprotein (AFP) <400 ng·mL-1was 76.19%,significantly higher than that(49.15%)in the patients with AFP≥400 ng·mL-1,the difference was statistically significant(P<0.05); the positive rate of SRC-3 protein expression in the patients with high differentiated hepatocellular carcinoma was 88.24%,significantly higher than that(47.62%)in the patients with inmiddle and low differentiated hepatocellular carcinoma,the difference was statistically significant(P<0.05).ConclusionSRC-3 high expression is related with the canceration and progression of hepatocellular carcinoma,and may become a potential molecular marker or therapeutic target.

[Key words]hepatocellular carcinoma; steroid receptor coactivator-3; immunohistochemical staining; RT-PCR

收稿日期：(2015-06-13)

[中圖分類號]R735.7；R730.23

[文獻標識碼]A

[文章編號]1673-5412(2015)06-0469-05

通信作者：趙偉鋒(1986-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事腫瘤靶向治療分子機制研究。E-mail：292965288@qq.com

作者簡介：陳雪姣(1987-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事胸部、胃腸道及血液系統(tǒng)惡性腫瘤的基礎研究和臨床工作。E-mail：chenxuejiao9999@163.com

DOI:10.3969/j.issn.1673-5412.2015.06.003