石 霖 呼延含蓉

禽流感病毒診斷技術(shù)的研究進(jìn)展

石 霖 呼延含蓉

禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）是一種可以引起人畜共患病的病原，由其引發(fā)的禽流感疫情不僅給養(yǎng)禽行業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，而且也給人類(lèi)健康，甚至生命安全帶來(lái)了嚴(yán)重威脅。該病至今已經(jīng)給全球經(jīng)濟(jì)和公共衛(wèi)生帶來(lái)了嚴(yán)重后果。由禽流感病毒感染的家禽，其臨診癥狀及剖檢的病理變化通常會(huì)因感染禽流感病毒毒株的亞型及特點(diǎn)有所差異，其臨診癥狀也通常因感染家禽的種類(lèi)、家禽日齡、感染情況及其他環(huán)境等不同而表現(xiàn)出不同癥狀。如高致病性禽流感（HPAI）的臨診癥狀較為明顯，其癥狀和病理變化對(duì)確診為疑似HPAI病例有一定的參考價(jià)值；然而低致病性禽流感（LPAI）感染家禽，其癥狀往往不明顯，有時(shí)臨診上難以進(jìn)行確診。因此，為了有效地對(duì)禽流感病毒進(jìn)行監(jiān)測(cè)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)流行的毒株從而控制該病毒的傳播，還需依賴(lài)于能夠準(zhǔn)確和敏感地檢測(cè)家禽病原和血清的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)建立了多種分子生物學(xué)及血清學(xué)檢測(cè)禽流感的試驗(yàn)方法。

1 禽流感樣本的采集

對(duì)于來(lái)自活禽的樣本主要采集泄殖腔和喉氣管拭子，研究表明，泄殖腔和喉氣管拭子樣品用于檢測(cè)禽流感病毒的結(jié)果準(zhǔn)確。將棉拭子插入泄殖腔1.5～2.0cm處，旋轉(zhuǎn)后沾上糞便獲得泄殖腔拭子樣品；將棉拭子插入口腔至咽的后部直達(dá)喉氣管，輕輕擦拭并慢慢旋轉(zhuǎn)沾上氣管分泌物從而獲得喉氣管拭子樣品。將采集的棉拭子樣品置于含有抗生素的PBS離心管中，低溫保存。對(duì)于病死禽類(lèi)主要采集其組織樣品，每只禽采集腸管及腸內(nèi)容物各1份，肺臟和氣管樣品各1份，肝臟、脾臟、腎臟、腦等各1份，做好標(biāo)記。在特殊條件下，也可以采集禽類(lèi)的新鮮糞便。采集的病原檢測(cè)樣品應(yīng)保存于含有抗生素的PBS緩沖液中，加入抗生素的主要目的是消除任何可能干擾后續(xù)診斷的細(xì)菌。此外，從采集樣品開(kāi)始，現(xiàn)場(chǎng)樣本應(yīng)始終嚴(yán)格保存在低溫條件下，切忌頻繁的反復(fù)凍融，因?yàn)檫@會(huì)導(dǎo)致病毒效價(jià)的明顯降低或者病毒分離的失敗。如果采集到的樣品不能在短期內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，建議將所有樣品保存在-80℃冰箱內(nèi)。

2 禽流感病毒的分離培養(yǎng)

1933年，科研人員將流感病毒樣品接種到10～12胚齡SPF雞胚羊膜腔中，并首次成功分離，證實(shí)雞胚中的羊膜腔的細(xì)胞非常適合流感病毒的增殖。這種使用SPF雞胚分離禽流感病毒的方法，不僅是診斷禽流感病毒的金標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，而且還是可以經(jīng)過(guò)雞胚接種產(chǎn)生高效價(jià)禽流感病毒的方法。目前，除了最近發(fā)現(xiàn)的在蝙蝠上分離到的流感病毒H17N10外，幾乎所有的流感病毒均可通過(guò)該方法進(jìn)行檢測(cè)。樣品接種SPF雞胚后，如果沒(méi)有血凝結(jié)，可將收集的尿囊液連續(xù)盲傳三代后重新檢測(cè)血凝結(jié)后，若仍無(wú)血凝結(jié)，則可以確定該樣品不含禽流感病毒。

然而，使用雞胚分離禽流感病毒的方法需要連續(xù)供應(yīng)現(xiàn)成的受精雞胚和培養(yǎng)雞胚的孵化器設(shè)備。為了獲得較高的病毒效價(jià)，整個(gè)病毒分離過(guò)程需要花費(fèi)數(shù)天甚至數(shù)周，是耗時(shí)耗力的診斷方法，如果有疑似HPAI的樣品，則必須在生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行操作。因此，雞胚病毒分離的方法并不被廣泛應(yīng)用于禽流感病毒感染的常規(guī)診斷中。但是，該方法可以提供大量的具有傳染性的活病毒，因此在研究機(jī)構(gòu)，尤其是禽流感參考實(shí)驗(yàn)室可以利用這種培養(yǎng)系統(tǒng)分離培養(yǎng)高效價(jià)的病毒，進(jìn)一步用于病毒的生物學(xué)特征研究、致病性研究、傳播機(jī)制研究等。

19世紀(jì)40年代有學(xué)者使用細(xì)胞進(jìn)行流感病毒的分離培養(yǎng)，為在雞胚中不能很好生長(zhǎng)的人或豬流感病毒提供了可行的分離培養(yǎng)方法。該方法可培養(yǎng)并且擴(kuò)增病毒，這種方法比直接檢測(cè)更靈敏。同時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)還可以監(jiān)控細(xì)胞病理變化以及在加入紅細(xì)胞后的紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象。目前，已經(jīng)有多種哺乳動(dòng)物和禽類(lèi)的細(xì)胞系被用于流感病毒的分離培養(yǎng)。最常用的細(xì)胞主要包括：初級(jí)恒河猴腎和恒河猴腎（LLCMK2）細(xì)胞、非洲綠猴腎細(xì)胞、貂肺上皮細(xì)胞系（MvlLu）、水牛綠猴腎細(xì)胞、犬腎細(xì)胞（MDCK）、綠猴連續(xù)細(xì)胞系（Vero）、人類(lèi)肺胚胎細(xì)胞（MRC5）、CA-CO-2細(xì)胞系、鴨胚胎細(xì)胞（CCL-141）、鵝胚腎細(xì)胞（CCL-169）、鴨胚成纖維細(xì)胞和雞胚成纖維細(xì)胞等。另外，由于病毒緩慢地從感染病毒的細(xì)胞表面釋放，可以在顯微鏡下觀(guān)察到紅細(xì)胞吸附導(dǎo)致的紅細(xì)胞直接黏附在這些感染的細(xì)胞上。除了雞胚成纖維細(xì)胞外，MDCK細(xì)胞目前也被廣泛應(yīng)用于病毒分離系統(tǒng)。然而，由于禽流感病毒依據(jù)毒株不同而有不同的宿主和體外繁殖特性，同時(shí)不是所有的宿主細(xì)胞對(duì)所有的禽流感病毒亞型具有耐受性，因此有效的病毒分離只有在細(xì)胞培養(yǎng)物對(duì)其接種的病毒敏感時(shí)才能成功。此外，該方法需要將樣品快速地運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室，因?yàn)檠舆t可能導(dǎo)致病毒失活，從而不能做到從任何感染物上分離到病毒。

另一種培養(yǎng)禽流感病毒的有效技術(shù)是快速離心培養(yǎng)技術(shù)（SVC），該技術(shù)是在一個(gè)含有蓋玻片的瓶中用單一或者混合細(xì)胞系培養(yǎng)兩種細(xì)胞的單層細(xì)胞。該方法經(jīng)過(guò)低溫離心后，可以增加病毒與細(xì)胞接觸的概率，再進(jìn)行培養(yǎng)，孵育24～48h后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行熒光抗體染色、檢測(cè)，靈敏度是傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的60%以上，該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是通過(guò)離心的方法增強(qiáng)了細(xì)胞的病毒感染性，從而提高了檢測(cè)的靈敏度并縮短了檢測(cè)時(shí)間（縮短到24h），該方法的檢測(cè)靈敏度與傳統(tǒng)的試管培養(yǎng)法相當(dāng)，但是高于直接熒光抗體檢測(cè)。

3 禽流感病毒的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)

分子生物技術(shù)又稱(chēng)核酸檢測(cè)技術(shù)，檢測(cè)病毒核酸，即RNA或者DNA，能夠縮短實(shí)驗(yàn)室診斷禽流感病毒的周期。目前，已經(jīng)建立起多種檢測(cè)禽流感病毒核酸RNA的技術(shù)，最常用的是反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）。RTPCR將來(lái)自于雞胚、細(xì)胞培養(yǎng)液或者臨診組織樣品的病毒RNA反向轉(zhuǎn)錄cDNA，然后使用禽流感病毒特異性引物擴(kuò)增該cDNA，根據(jù)分子質(zhì)量不同使用瓊脂糖凝膠分離PCR產(chǎn)物，再使用溴化乙啶染色分析PCR產(chǎn)物，這種方法可以用于臨診疑似樣品的實(shí)驗(yàn)室診斷。其主要缺點(diǎn)是：操作過(guò)程中可能產(chǎn)生污染，同時(shí)需要進(jìn)行凝膠電泳與凝膠成像等復(fù)雜的操作。

熒光RT-PCR是在此基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，該反應(yīng)體系除了加入特異性檢測(cè)引物外，還加入了熒光標(biāo)記探針，通過(guò)熒光PCR儀器實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR產(chǎn)物的數(shù)量，該方法的主要優(yōu)點(diǎn)為：所需時(shí)間短，2～3h即可顯示結(jié)果，無(wú)須凝膠電泳與凝膠成像等后續(xù)操作。熒光RT-PCR檢測(cè)技術(shù)是近年來(lái)應(yīng)用較多的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，目前已經(jīng)在省級(jí)以上動(dòng)物疫病診斷機(jī)構(gòu)廣泛使用，該方法靈敏、快速，可對(duì)禽流感的亞型進(jìn)行區(qū)分。近年來(lái)基因芯片技術(shù)發(fā)展迅速，基因芯片技術(shù)是結(jié)合一些現(xiàn)代高新技術(shù)，把核酸信息按要求固定在某些特定載體上，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)不同生物組的分析和檢測(cè)，具有高通量、平行性分析、微量化等特點(diǎn)。在禽流感病毒的檢測(cè)過(guò)程中，將反轉(zhuǎn)錄的cDNA產(chǎn)物固定于載體上，通過(guò)熒光標(biāo)記的核酸探針與靶分子的雜交，可以區(qū)分混合體系中的擴(kuò)增產(chǎn)物，借此來(lái)區(qū)分病毒亞型。王秀榮等利用基因芯片區(qū)分禽流感病毒H5、H7、H9主要亞型，為禽流感病毒診斷的快速高通量檢測(cè)奠定扎實(shí)的技術(shù)基礎(chǔ)。2000年誕生的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)（LAMP）技術(shù)是分子檢測(cè)技術(shù)的又一突破，該方法通過(guò)兩對(duì)引物，利用BstDNA聚合酶的鏈置換活性提供反應(yīng)的動(dòng)力，在恒溫條件下完成對(duì)核酸的擴(kuò)增反應(yīng)。該技術(shù)于恒溫條件下幾十分鐘內(nèi)即可完成，無(wú)須昂貴的儀器設(shè)備，結(jié)果可肉眼直接觀(guān)察，具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高、特異性好等特點(diǎn)，非常適用于基層實(shí)驗(yàn)室及大型養(yǎng)殖場(chǎng)的檢測(cè)。近年來(lái)，已有一些成功應(yīng)用該技術(shù)對(duì)病原體進(jìn)行檢測(cè)的文獻(xiàn)報(bào)道。

禽流感病毒的分子診斷方法，尤其是熒光RT-PCR檢測(cè)方法在檢疫部門(mén)應(yīng)用較多，該方法具備簡(jiǎn)便、快速、靈敏的優(yōu)點(diǎn)，但是也存在分子診斷技術(shù)共有的技術(shù)問(wèn)題。其中最重要的是禽流感病毒變異頻繁，病毒的基因序列可能產(chǎn)生遺傳漂移和轉(zhuǎn)變，如果引物結(jié)合位點(diǎn)在內(nèi)的基因序列發(fā)生改變，則該反應(yīng)將不會(huì)擴(kuò)增已改變的目標(biāo)序列，使得PCR方法的精準(zhǔn)性和特異性受到影響，因此基于核酸的分子檢測(cè)需要定期根據(jù)禽流感的流行情況和變異情況對(duì)其引物序列進(jìn)行更新。除此之外，還有一些因素也可以導(dǎo)致產(chǎn)生假陰性結(jié)果，如在準(zhǔn)備樣品過(guò)程中，混在病原體內(nèi)的抑制物、病毒的效價(jià)較低、目標(biāo)RNA在擴(kuò)增前出現(xiàn)了降解以及配制反應(yīng)體系時(shí)出現(xiàn)了錯(cuò)誤等，其中RNA質(zhì)量問(wèn)題是最重要的，使用降解的RNA或無(wú)效的PCR反應(yīng)會(huì)使結(jié)果不準(zhǔn)確。因此，遵循嚴(yán)格的操作程序是非常重要的。

此外，從mRNA到cDNA的互補(bǔ)轉(zhuǎn)變具有高度多樣性，選擇不同的反轉(zhuǎn)錄酶會(huì)使RT-PCR結(jié)果相差很大。mRNA不是線(xiàn)性分子，而是通過(guò)廣泛的鏈內(nèi)堿基配對(duì)形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，這導(dǎo)致許多由單鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)和長(zhǎng)度可變的雙鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu)組成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。反轉(zhuǎn)錄（Reversed Transcription，RT）步驟的效率在很大程度上依賴(lài)用于合成不針對(duì)發(fā)夾結(jié)構(gòu)的cDNA的引物，因?yàn)榕c核酸分子內(nèi)雜交（即mRNA與自身）動(dòng)力相比核酸分子間（即引物與mRNA）雜交動(dòng)力相對(duì)較弱。因此，應(yīng)選擇適合的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄引物而不是莖狀結(jié)構(gòu)的引物。同樣重要的是，要確保在PCR引物結(jié)合位點(diǎn)，擴(kuò)增子本身沒(méi)有二級(jí)結(jié)構(gòu)，因?yàn)樵诮Y(jié)合位點(diǎn)廣泛出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)產(chǎn)生不同結(jié)果。最后，該方法檢測(cè)只能確定病原體的數(shù)量，并不能確定病原體是否具有感染能力。因此，陽(yáng)性結(jié)果不一定能說(shuō)明會(huì)對(duì)公共衛(wèi)生構(gòu)成了威脅，而是需要進(jìn)一步的病毒分離培養(yǎng)來(lái)確定病毒的活力。

4 禽流感血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)

在診斷禽類(lèi)禽流感病毒過(guò)程中，血清學(xué)診斷方法不僅在監(jiān)測(cè)種群疫病上發(fā)揮著重要作用，同時(shí)也為禽流感病毒感染的診斷提供了一個(gè)精確的方法。血清學(xué)診斷對(duì)于家禽的LPAI病毒感染有一定的參考價(jià)值，而對(duì)在HPAI病例中禽類(lèi)產(chǎn)生抗體前就已經(jīng)死亡的意義并不大。

（1）血凝和血凝抑制試驗(yàn)：其原理是依據(jù)流感病毒表面的HA蛋白可與含有唾液酸的糖蛋白結(jié)合，它們之間的結(jié)合比較緊密，不經(jīng)特殊處理，難以分開(kāi)，這種凝集是不可逆轉(zhuǎn)的。但該凝集可被相應(yīng)的特異性抗體所抑制，因此血凝試驗(yàn)通常用來(lái)進(jìn)行禽流感病毒的初步檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)間應(yīng)控制在30min以?xún)?nèi)，否則易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。一旦血凝試驗(yàn)呈陽(yáng)性結(jié)果，需要進(jìn)一步考慮用特異性血清做血凝抑制試驗(yàn)，與新城疫等有血凝活性的病原進(jìn)行鑒別。血凝抑制試驗(yàn)特異性較好，可以用來(lái)確定流感病毒的亞型。

（2）神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn)：該試驗(yàn)是鑒定禽流感病毒NA亞型的主要手段，其不會(huì)受到血清中非特異性因素的干擾，有較高準(zhǔn)確度，但需要注意，某些NA亞型之間可能會(huì)出現(xiàn)交叉反應(yīng)，HA的抗體也可能對(duì)NA產(chǎn)生影響。

（3）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)：該方法是以抗原或抗體固相化以及酶標(biāo)記技術(shù)為基礎(chǔ)的，抗原或抗體能在固相載體表面結(jié)合且保持原有的免疫學(xué)特性，經(jīng)酶標(biāo)記后的抗原或抗體復(fù)合物既保留了免疫學(xué)特性，又具備酶的活性。抗體結(jié)合顯色后利用酶標(biāo)儀讀取結(jié)果，進(jìn)行判定。ELISA檢測(cè)方法多種多樣，常見(jiàn)的有間接ELISA、競(jìng)爭(zhēng)ELISA、DOT-ELISA等，該檢測(cè)技術(shù)具有較好的敏感性和特異性，既可以檢測(cè)抗原又可以檢測(cè)抗體，是一種快速的臨床診斷方法。

（4）病毒中和試驗(yàn)：該方法是較為經(jīng)典的血清學(xué)檢測(cè)手段，特異性、敏感性都比較好，同時(shí)可以測(cè)量動(dòng)物體內(nèi)中和抗體含量，但由于操作較煩瑣、耗時(shí)，當(dāng)涉及具有感染性病毒時(shí)需要在生物安全級(jí)別較高的實(shí)驗(yàn)室操作，這使得該方法幾乎不應(yīng)用于臨床快速診斷。

（5）瓊脂凝膠擴(kuò)散試驗(yàn)：根據(jù)免疫沉淀原理，抗原和抗體可以通過(guò)懸浮的間質(zhì)擴(kuò)散到反應(yīng)區(qū)域，當(dāng)抗原和抗體發(fā)生反應(yīng)時(shí)，就會(huì)在瓊脂糖介質(zhì)上產(chǎn)生一條白色沉淀線(xiàn)。該方法操作簡(jiǎn)便、特異性較高，但是敏感性較低，對(duì)抗原、抗體要求高，病毒必須經(jīng)過(guò)裂解，故其已經(jīng)很少使用。

（6）間接免疫熒光試驗(yàn)：該方法使用標(biāo)記有熒光素的抗原或抗體進(jìn)行反應(yīng)來(lái)對(duì)流感病毒進(jìn)行鑒定，具有簡(jiǎn)便易操作、敏感、費(fèi)用低等特點(diǎn)。

摘自《黑龍江畜牧獸醫(yī)》2016（05上）