顧曉明

（江蘇鹽城市亭湖區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，江蘇鹽城 224002）

家禽血凝試驗(yàn)及血凝抑制試驗(yàn)的操作方法及注意事項(xiàng)

顧曉明

（江蘇鹽城市亭湖區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，江蘇鹽城 224002）

血凝試驗(yàn)及血凝抑制試驗(yàn)因其簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、實(shí)用被廣泛應(yīng)用。但在試驗(yàn)過(guò)程中，人為因素的影響很大，常常因?yàn)椴僮鞑灰?guī)范等，導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確，甚至失敗。因此，要了解試驗(yàn)的操作方法及注意事項(xiàng)，本文結(jié)合以往操作經(jīng)驗(yàn)，簡(jiǎn)要總結(jié)歸納，供讀者參考。

血凝試驗(yàn) 血凝抑制試驗(yàn) 操作方法 注意事項(xiàng)

血凝試驗(yàn)（Hemagglutination Test，HA）與血凝抑制試驗(yàn)（Hemagglutination Inhibition Test，HI）試驗(yàn)是檢測(cè)家禽A類疾?。ㄐ鲁且吆颓萘鞲械龋┑某Ｒ?guī)方法，也是檢測(cè)家禽免疫抗體水平一種基本方法。該方法具有經(jīng)濟(jì)、反應(yīng)迅速可靠、操作簡(jiǎn)便和可以對(duì)抗體水平進(jìn)行量化的優(yōu)點(diǎn)，能夠處理大量的樣品，是一種在基層臨床實(shí)踐中極易推廣的檢驗(yàn)檢疫手段與診斷方法［1］。但試驗(yàn)結(jié)果受操作技術(shù)的影響很大，因此，試驗(yàn)時(shí)必須細(xì)心，保證試驗(yàn)的精準(zhǔn)性。

1 血樣的采集和處理

采血在血清學(xué)檢測(cè)和實(shí)驗(yàn)研究中是一項(xiàng)前提性工作，采血質(zhì)量的好壞，直接影響能不能進(jìn)行實(shí)驗(yàn)和判定實(shí)驗(yàn)結(jié)果［2］。采血時(shí)，采血者除認(rèn)真做好自身防護(hù)工作，采血設(shè)備需經(jīng)消毒干燥，做到無(wú)菌采樣。

分離血清的血液，試管要靜置、斜放，便于血清析出。溫度在23℃以上時(shí)，血樣在2 h內(nèi)即可析出清亮的血清。若溫度為10℃左右的時(shí)候，最好立即放入37℃培養(yǎng)箱中孵育2～3 h。在送樣過(guò)程中，血樣不可劇烈搖晃以免溶血，送至實(shí)驗(yàn)室后要立即分離血清，不能立即分離的血樣要及時(shí)冷藏。如血清樣品有溶血、膠凍樣現(xiàn)象出現(xiàn)時(shí)應(yīng)棄去。

家禽中，除雞外，有些禽（如水禽、鴿子）血清可能對(duì)雞紅細(xì)胞產(chǎn)生非特異性的凝集，造成假陽(yáng)性反應(yīng)。可用待檢血清做血凝試驗(yàn)，如果待檢血清出現(xiàn)凝集紅細(xì)胞的現(xiàn)象，則說(shuō)明有非特異凝集素存在，需用雞紅細(xì)胞進(jìn)行吸附。方法：取5%～10%雞紅細(xì)胞與等量水禽血清混合30min，取上清液做HI試驗(yàn)。結(jié)果判定時(shí)比原方法高一個(gè)滴度。因此在血凝抑制試驗(yàn)中應(yīng)按照病毒種類和血清來(lái)源采取相應(yīng)的處理方式。

2 試劑配制和使用時(shí)注意事項(xiàng)

2.1 紅細(xì)胞懸液

源于不同個(gè)體雞只的紅細(xì)胞對(duì)病毒的敏感性不同。所以，應(yīng)采集3羽以上成年SPF公雞或非免疫的健康公雞的混合血液制成紅細(xì)胞懸液。若采集的是免疫過(guò)的雞的血液，應(yīng)充分洗去血漿。在最后一遍洗滌后，充分吸棄紅細(xì)胞的上清液，保證紅細(xì)胞濃度。紅細(xì)胞懸液的濃度對(duì)于血凝抑制效價(jià)也有影響。紅細(xì)胞濃度低，血凝抑制效價(jià)就會(huì)下降；反之血凝抑制效價(jià)就會(huì)上升，紅細(xì)胞濃度以0.5%～1.0%為宜。適宜的轉(zhuǎn)速和離心時(shí)間以2000r/min的速度離心，第1次和第2次 為3 min和第3次為5 min離心為宜。

不合格的紅細(xì)胞懸液不能使用，可以通過(guò)觀察血沉質(zhì)量等方法判斷是否合格。建議使用與血清來(lái)源相同的禽種紅細(xì)胞，以避免易產(chǎn)生非特異現(xiàn)象［3］。做同一試驗(yàn)或測(cè)同一批樣品不能更換紅細(xì)胞。一般正確保存3 d的紅細(xì)胞不會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。但也有研究表明保存6個(gè)月的雞紅細(xì)胞與試驗(yàn)時(shí)現(xiàn)配的雞紅細(xì)胞在HA與HI試驗(yàn)中結(jié)果無(wú)差異［4］，所以可以根據(jù)實(shí)際情況決定。在試驗(yàn)過(guò)程中，加入紅細(xì)胞懸液時(shí)應(yīng)先將其輕輕充分搖勻，以免每孔中加入的紅細(xì)胞懸液濃度不同，造成差異［5］。

2.2 稀釋液的選擇

在血凝抑制試驗(yàn)中，最常用的稀釋液為滅菌的生理鹽水、磷酸鹽緩沖液（pH值為7.0～7.2的PBS）和巴比妥緩沖液（pH值為7.2的VBS）。病毒的血凝性最適pH值為6.0～7.2。當(dāng)pH值＜5.8時(shí)，紅細(xì)胞易發(fā)生溶血；當(dāng)pH值＞7.8時(shí)，吸附于紅細(xì)胞上的病毒易脫落。此外，緩沖液對(duì)其他酸堿物質(zhì)具有一定的緩沖能力，有維持反應(yīng)體系pH值的作用，而生理鹽水不具備緩沖功能，一般不推薦使用。因此，稀釋液一般首選0.01mol.L-1、 pH值7.0～7.2的等滲磷酸緩沖液（PBS），以免其pH值對(duì)試驗(yàn)產(chǎn)生影響。

2.3 4個(gè)血凝單位抗原的影響

4個(gè)血凝單位抗原準(zhǔn)確制備也是血凝及血凝抑制試驗(yàn)過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)，當(dāng)抗原濃度高時(shí)，HI抗體效價(jià)就會(huì)降低，反之則會(huì)有所升高。為保證4個(gè)血凝單位抗原的配制準(zhǔn)確無(wú)誤，須做抗原回歸試驗(yàn)。若前2孔完全凝集（第2孔為完全凝集的終點(diǎn)），則視為抗原配置正確。4個(gè)血凝單位抗原需現(xiàn)配現(xiàn)用。需用時(shí)混勻，配好的工作抗原室溫下不可長(zhǎng)時(shí)間放置，且不可反復(fù)凍融。如檢驗(yàn)樣品過(guò)多，工作抗原添加時(shí)間較長(zhǎng)最好放在冰上，以免抗原失效。

3 器材的選擇和使用

所用器材主要有單道、多道可調(diào)微量加樣器、微量反應(yīng)板、吸頭等。試驗(yàn)中使用的反應(yīng)板應(yīng)清潔、內(nèi)壁光滑、無(wú)磨損。使用過(guò)的反應(yīng)板先用流水沖凈孔中的反應(yīng)物，然后浸泡在清潔液中（新反應(yīng)板可直接放入清潔液中浸泡），24 h后取出，用流水沖洗干凈后，再在蒸餾水中沖洗l遍，甩干，擺放在恒溫箱中，70℃以下烤干備用。吸頭經(jīng)超聲波清洗、高壓滅菌后可反復(fù)使用，使用一段時(shí)間后要淘汰、及時(shí)更新。微量反應(yīng)板、吸頭的清洗比較煩瑣，容易有殘留，最好盡量使用合格的一次性產(chǎn)品。

單道、多道可調(diào)微量加樣器在使用前或使用一些時(shí)間后均應(yīng)進(jìn)行校正或鑒定，使用時(shí)規(guī)范操作。在使用微量移液器時(shí)，每個(gè)吸頭要安裝牢固，防止漏氣。稀釋血清時(shí)，在吸取第l孔時(shí)要先按下移液器，再插入凝集板孔，吸取后加入第2孔，在反復(fù)抽取過(guò)程中，移液器滴頭不要離開(kāi)液面，防止產(chǎn)生氣泡。在使用微量移液器時(shí)，手壓下的力度要均勻，防止移液量不準(zhǔn)。在使用移液器滴加液體時(shí)，有時(shí)會(huì)使管嘴與凝集板孔接觸造成樣品交叉。因此，在使用移液器時(shí)一定要保持移液器吸頭垂直加入液體，保持管嘴與凝集板孔間的距離，保證每個(gè)凝集孔內(nèi)液體數(shù)量和濃度準(zhǔn)確。

4 溫度控制

溫度對(duì)血凝抑制試驗(yàn)的影響較大，從4℃～37℃，呈正相關(guān)。在37℃時(shí)，凝集的紅細(xì)胞易洗脫；4℃以下紅細(xì)胞易產(chǎn)生自凝。即溫度過(guò)高，試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)快，但凝集解脫也快，使凝集現(xiàn)象消失；溫度過(guò)低，試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)慢。故試驗(yàn)環(huán)境溫度應(yīng)控制在室溫20℃～25℃。時(shí)間控制在紅細(xì)胞對(duì)照完全沉淀的前后5min內(nèi)判定試驗(yàn)結(jié)果較好，大約在30～40 min左右。也不要將反應(yīng)板放置于風(fēng)扇、空調(diào)或風(fēng)機(jī)出風(fēng)口，以免液體揮發(fā)較快，影響試驗(yàn)結(jié)果［6］。

5 結(jié)果判定

血凝抑制試驗(yàn)的結(jié)果判定，以完全抑制紅細(xì)胞凝集的最大稀釋倍數(shù)判為該血清的血凝抑制滴度。除了受到溫度，反應(yīng)時(shí)間，以及樣品試劑質(zhì)量等客觀因素的影響，還受到人為主觀判定的影響。比如在對(duì)照相對(duì)較為標(biāo)準(zhǔn)合理的情況下，會(huì)發(fā)現(xiàn)在終點(diǎn)判別上，有時(shí)會(huì)很模糊，血紅細(xì)胞有時(shí)只有紅點(diǎn)無(wú)淚滴，或有些輕微掛，或紅細(xì)胞完全凝集。在溫度（最適溫度20℃～25℃）控制穩(wěn)定，反應(yīng)時(shí)間充足合適，以及樣品試劑質(zhì)量都合格的情況下（這些客觀因素可控性較強(qiáng)，很容易把握），并在紅細(xì)胞對(duì)照出現(xiàn)完全沉淀、病毒對(duì)照出現(xiàn)完全凝集的情況下，操作者應(yīng)根據(jù)對(duì)照選擇無(wú)淚滴紅點(diǎn)或是紅細(xì)胞完全凝結(jié)的一孔作為該血清的血凝抑制滴度。關(guān)鍵是操作者應(yīng)該統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，即若以紅細(xì)胞完全凝集為最終效價(jià)，則從開(kāi)始到最后一板的判定讀數(shù)均以此為標(biāo)準(zhǔn)，這樣可以消除系統(tǒng)誤差，增強(qiáng)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)性。建議讀數(shù)者不應(yīng)被更換，這也是為消除主觀判定影響的措施之一，因不同人讀數(shù)標(biāo)準(zhǔn)會(huì)有差異。若檢測(cè)量不是很大，或人力安排允許，建議做重復(fù)，在最大限度的避免了客觀因素和主觀因素所造成影響的情況下，血凝抑制試驗(yàn)的結(jié)果相對(duì)還是比較穩(wěn)定的，具有可重復(fù)性。

血凝抑制試驗(yàn)試驗(yàn)成功與否的判斷要素：陽(yáng)性血清不超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)值的±1個(gè)滴度，陰性對(duì)照血清在2log2以下時(shí)為100%凝集；空白對(duì)照液體清亮，紅細(xì)胞流淌良好（100%陰性）；抗原回滴時(shí)結(jié)果準(zhǔn)確。若病毒對(duì)照孔沒(méi)有完全凝集，生理鹽水對(duì)照孔沒(méi)有完全沉淀，那這塊反應(yīng)板就被認(rèn)為試驗(yàn)失敗，結(jié)果應(yīng)棄之不用，樣品要重新加樣檢查。

6 其他加樣細(xì)節(jié)和技巧

將抗原血清稀釋后，加4個(gè)血凝單位抗原以及紅細(xì)胞懸液時(shí)，可由11孔開(kāi)始往前加，這樣可避免由于槍頭沾染孔內(nèi)樣品而造成的誤差。因后一孔的濃度對(duì)于前一孔而言相對(duì)較低，即使沾染一點(diǎn)也不會(huì)造成太大影響，從而增加了結(jié)果的準(zhǔn)確性。

7 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，在血凝抑制試驗(yàn)中，影響試驗(yàn)結(jié)果的因素很多。因此，做實(shí)驗(yàn)前，應(yīng)綜合各類文獻(xiàn)中所提及的注意事項(xiàng)，結(jié)合以往操作經(jīng)驗(yàn)，嚴(yán)格遵守各項(xiàng)操作規(guī)程，耐心細(xì)致地做好每一個(gè)環(huán)節(jié)，并在一些操作技巧和熟練程度上苦下功，發(fā)現(xiàn)問(wèn)題及時(shí)糾正處理，保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確，從而準(zhǔn)確評(píng)價(jià)家禽免疫的效果［6］。

［1］ 王孟華.淺析影響血凝和血凝抑制試驗(yàn)的因素［J］.福建畜牧獸醫(yī)，2004，26（6）：51-52.

［2］ 許勇團(tuán).雞的血液和病料采集技術(shù)［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)文摘，2014，30（6）：50-51.

［3］ 顧俐敏，毛裕新，葉明，等.異種家禽紅細(xì)胞對(duì)禽流感抗體檢測(cè)的影響［J］.上海畜牧獸醫(yī)通訊，2011，（4）：40-41.