任應(yīng)國，　唐石磊，　高園林

(1南陽市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 南陽 473000；2河南大學(xué)淮河醫(yī)院神經(jīng)外科，3開封市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 開封 475000)

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白藜蘆醇對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元損傷的影響*

任應(yīng)國1，唐石磊2△，高園林3

(1南陽市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 南陽 473000；2河南大學(xué)淮河醫(yī)院神經(jīng)外科，3開封市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 開封 475000)

[摘要]目的： 研究不同劑量的白藜蘆醇對大鼠海馬神經(jīng)元氧化損傷的影響。 方法: 通過體外原代培養(yǎng)獲得大鼠海馬神經(jīng)元。實驗分為對照(control，Con)組、三甲基氯化錫(trimethyltin chloride，TMT)組、溶劑對照(vehicle)組和白藜蘆醇(resveratrol，Res)組。其中，Res設(shè)4個濃度：5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L和40 μmol/L；除對照組外，其它各組細胞均采用三甲基氯化錫(TMT)處理使細胞出現(xiàn)氧化應(yīng)激狀態(tài)。采用CCK-8法和熒光探針DCFH-DA法觀察各組神經(jīng)元的活力與細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)含量的變化；TUNEL熒光染色法檢測各組神經(jīng)元的凋亡程度。結(jié)果: 與TMT組相比，不同濃度的白藜蘆醇均能提高神經(jīng)元的活力，其中20 μmol/L的作用最顯著。20 μmol/L白藜蘆醇能抑制經(jīng)TMT處理后神經(jīng)元內(nèi)的ROS水平以及凋亡程度的增加。結(jié)論: 白藜蘆醇具有抑制TMT誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元氧化損傷的作用。

[關(guān)鍵詞]白藜蘆醇； 海馬神經(jīng)元； 氧化應(yīng)激； 三甲基氯化錫

氧化應(yīng)激主要指體內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生與清除發(fā)生失衡，從而導(dǎo)致細胞和組織受到氧化損傷。醫(yī)學(xué)研究普遍認為氧化應(yīng)激在神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生與發(fā)展過程中具有重要作用，如阿茲海默癥、帕金森癥、肌萎縮性側(cè)索硬化癥、脊髓性肌萎縮等疾病的發(fā)生均與氧化應(yīng)激密切相關(guān)[1-2]。

白藜蘆醇(resveratrol，Res)主要是葡萄、漿果和花生等多種植物在遇到惡劣環(huán)境中產(chǎn)生的一種天然的植物抗毒素，能夠調(diào)節(jié)多種細胞生長進程，并具有保護細胞與抗氧化的功效[3]。研究表明，白藜蘆醇能夠激活Neuro2a細胞中腺苷酸活化蛋白激酶并促進軸突的生長，可能對以軸突病變和神經(jīng)退行性變?yōu)橹鞯募膊【哂兄委熥饔肹4-5]。三甲基氯化錫(trimethyltin chloride，TMT)是用于PVC塑料的穩(wěn)定劑和防銹油漆的添加劑，可導(dǎo)致海馬神經(jīng)元退行性變，其主要機制是通過誘發(fā)神經(jīng)元內(nèi)聚集大量的活性氧自由基，從而導(dǎo)致神經(jīng)元的病變。本實驗采用TMT處理誘發(fā)海馬神經(jīng)元氧化應(yīng)激模型，觀察白藜蘆醇對海馬神經(jīng)元氧化應(yīng)激的保護作用，為白藜蘆醇用于臨床防治氧化應(yīng)激相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病提供實驗依據(jù)。

材料和方法

1主要儀器設(shè)備

超凈工作臺(蘇州醫(yī)療設(shè)備廠)；CO2培養(yǎng)箱(Forma Scientific)；熒光倒置相差顯微鏡(Leica)；高速冷凍離心機(Biofugeprimor)。

2動物及主要試劑

Sprague-Dawley大鼠(山東大學(xué)實驗動物中心)；白藜蘆醇，純度>98%(天津尖峰生物科技有限公司)；三甲基氯化錫(trimethyltin-chloride，TMT)、β-tubulin抗體(Sigma)；Triton X-100(上海索萊寶生物科技有限公司)；CKK-8試劑(Dojindo)；DCFH-DA活性氧檢測試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)；TUNEL試劑盒(Roche)；DMEM/F12培養(yǎng)基、Neurobasal培養(yǎng)基(Gibco)；Hoechst 33258染色液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

3方法

3.1大鼠海馬神經(jīng)元的原代培養(yǎng)取新出生的SD大鼠，斷頭，剝離大腦，清洗2次。置于平皿中在解剖顯微鏡下分離出海馬組織，剪碎為1 mm×1 mm×1 mm小塊，加入0.125%胰酶2 mL，37 ℃消化25 min，消化結(jié)束后離心，棄去上清液，加入DMEM/F12培養(yǎng)基，反復(fù)吹打，靜置液體后收集上清。重復(fù)上述步驟直至全部消化完全，收集上清，用200目細胞篩過濾制成單細胞懸液。細胞計數(shù)后，以2×108/L接種于培養(yǎng)瓶中，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后更換為Neurobasal培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，每隔2 d換全新培養(yǎng)基，培養(yǎng)7 d后用于后續(xù)實驗。

3.2免疫熒光染色法鑒定神經(jīng)元收集上述培養(yǎng)7 d后的神經(jīng)元，PBS洗滌，加入4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗滌3次，每次5 min。加入1% H2O2室溫作用10 min，再加入0.3% Triton X-100室溫透膜15 min。封閉液封閉1 h，加入β-tubulin III抗體(1∶50)，4 ℃過夜；再加入 II 抗(1∶200)避光孵育1 h。用染色液染色3 min，抗熒光淬滅封片液封片，于熒光顯微鏡下觀察拍照。

3.3藥物處理與分組將白藜蘆醇溶解于0.24%四氫呋喃甲醇中，神經(jīng)元培養(yǎng)7 d后，洗去培養(yǎng)基，分為：對照(control,Con)組;TMT組;溶劑對照組(vehicle組)：加入同等劑量四氫呋喃甲醇，再加入5 μmol/L TMT處理24 h；Res組：分別加入5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L和40 μmol/L白藜蘆醇5 h后，再加入5 μmol/L TMT處理24 h。

3.4細胞活力的檢測將經(jīng)相應(yīng)處理的各組神經(jīng)元以2×108/L接種于96孔板中，每組設(shè)空白對照孔2個，只加入培養(yǎng)基。于各孔中加入10 μL的CCK-8試劑，在37 ℃避光孵育2 h。酶標儀在450 nm波長處測定各孔吸光度(A)值?？鬃x數(shù)=實測值-空白對照孔讀數(shù)。

3.5ROS的檢測采用DCFH-DA活性氧檢測試劑盒來測定各組神經(jīng)元內(nèi)ROS水平。將各組神經(jīng)元以2×108/L接種于48孔板中，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后更換為Neurobasal培養(yǎng)基，每孔100 μL，經(jīng)相應(yīng)處理后，按照試劑盒說明書操作進行處理，用酶標儀檢測熒光強度488/525 nm下的熒光強度。

3.6神經(jīng)元凋亡的檢測將神經(jīng)元以2×108/L接種于鋪有蓋玻片的48孔板中，每孔加入4%多聚甲醛，固定20 min，加入1% H2O2室溫作用10 min，再加入0.3% Triton X-100冰上透膜15 min，PBS洗滌后，滴加TUNEL染色液20 μL，室溫孵育90 min，Hoechst 33258染色5 min，抗熒光淬滅封片液封片，熒光顯微鏡觀察并拍照。

4統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 15.0軟件進行分析，實驗結(jié)果以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，各組間差異采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，Bonferroni校正的t檢驗進行多重比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1大鼠海馬神經(jīng)元的鑒定

檢測β-tubulin III神經(jīng)元特異性標志物并進行Hoechst 33258細胞核染色，如圖1所示，綠色熒光為神經(jīng)元染色，藍色熒光為細胞核染色，神經(jīng)元突起相互連接成網(wǎng)狀，分布均勻，僅有少量細胞未出現(xiàn)綠色熒光，表明神經(jīng)元的純度高。

Figure 1. Identification of primary rat hippocampal neurons (×400). A: Hoechst 33258 nuclear staining; B: β-tubulin III neuron staining; C: overlapping.

圖1原代大鼠海馬神經(jīng)元的鑒定

2各組神經(jīng)元活力的比較

采用CCK-8法檢測經(jīng)不同濃度白藜蘆醇預(yù)處理5 h、再經(jīng)TMT誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷后細胞活力的變化。如圖2所示，經(jīng)TMT處理后，TMT組與vehicle組的細胞活力顯著低于Con組(P<0.05)；與TMT組相比，5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L和40 μmol/L的白藜蘆醇均可提高神經(jīng)元活力，差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)。TMT組與vehicle組相比差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性。

Figure 2.The effects of resveratrol at different concentrations on the cell viability after oxidative stress injury. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsCon group;#P<0.05vsTMT group.

圖2不同濃度白藜蘆醇對誘導(dǎo)氧化應(yīng)激神經(jīng)元活力的影響

5 μmol/L和10 μmol/L白藜蘆醇提高神經(jīng)元活力作用的差距不大，20 μmol/L提高細胞活力作用適中，便于進行后續(xù)實驗。選用20 μmol/L的白藜蘆醇預(yù)處理神經(jīng)元5 h后，加入TMT處理12 h、24 h和36 h;其中TMT處理24 h，白藜蘆醇提高細胞活力的作用最顯著，見圖3。

3各組大鼠神經(jīng)元ROS累積的比較

采用DCFH-DA熒光探針檢測20 μmol/L白藜蘆醇對神經(jīng)元氧化應(yīng)激誘導(dǎo)損傷后細胞ROS量的變化。與Con組相比，TMT組與vehicle組經(jīng)TMT處理后神經(jīng)元內(nèi)的ROS水平顯著增加(P<0.05)；TMT組與vehicle組間差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性；加入白藜蘆醇預(yù)處理后，可顯著抑制神經(jīng)元內(nèi)ROS的生成，見圖4。

Figure 3. The effects of resveratrol at 20 μmol/L on the cell viability after oxidative stress injury. Mean±SD.n=3.

圖320 μmol/L白藜蘆醇預(yù)處理后對大鼠神經(jīng)元氧化誘導(dǎo)不同時間細胞活力的影響

Figure 4. The effects of resveratrol at 20 μmol/L on the content of ROS after oxidative stress injury. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsCon group;#P<0.05vsTMT group.

圖4白藜蘆醇對誘導(dǎo)氧化應(yīng)激后神經(jīng)元內(nèi)ROS含量的影響

4TUNEL熒光染色法

TUNEL熒光染色的陽性細胞呈綠色，細胞核被Hoechst 33258染成藍色。如圖5所示，Con組只有少量細胞呈陽性，推測為細胞的基礎(chǔ)正常凋亡；TMT組與vehicle組可見大量呈陽性的細胞，提示TMT誘導(dǎo)氧化應(yīng)激引起大量大鼠神經(jīng)元的凋亡；加入20 μmol/L白藜蘆醇預(yù)處理5 h后，可觀察到呈陽性的細胞數(shù)量顯著減少(P<0.05)，提示白藜蘆醇可抵抗TMT對大鼠神經(jīng)元的氧化應(yīng)激作用。

Figure 5. The effects of resveratrol at 20 μmol/L on the cell apoptosis after oxidative stress injury (×200). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsCon group;#P<0.05vsTMT group.

圖5白藜蘆醇對誘導(dǎo)氧化應(yīng)激后大鼠神經(jīng)元凋亡的影響

討論

活性氧自由基累積導(dǎo)致的細胞氧化應(yīng)激是神經(jīng)退行性疾病發(fā)生的主要因素之一，因此如何清除細胞內(nèi)活性氧以及進行細胞的氧化損傷修復(fù)成為預(yù)防和治療神經(jīng)退行性疾病的主要研究方向。白藜蘆醇在抗菌、抗氧化和應(yīng)激反應(yīng)過程中起著重要作用。國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)在多種組織器官隨衰老出現(xiàn)氧化性損傷的小鼠模型中，白藜蘆醇能夠降低衰老引起的氧化損傷作用[6]。此外，白藜蘆醇可以通過一氧化氮和內(nèi)皮細胞一氧化氮合酶作用，對心血管系統(tǒng)產(chǎn)生影響，通過提高心肌線粒體錳超氧化物歧化酶的活性，從而增加呼吸鏈酶CoIV的活性[7]。Siddiqui等[8]研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇對氧化損傷的PC12細胞具有保護作用，能夠顯著降低細胞內(nèi)活性氧自由基，并回復(fù)細胞內(nèi)的GSH和脂質(zhì)過氧化水平。有研究表明白藜蘆醇的抗氧化作用可能與對羥基的直接歧化作用有關(guān)[9]。

白藜蘆醇是近年來在氧化應(yīng)激方面的研究熱點，臨床研究表明白藜蘆醇對心臟、肝臟和腎臟具有顯著的抗氧化作用，修復(fù)相應(yīng)功能的損傷。Sun等[10]研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇具有抑制自由基反應(yīng)，從而保護嗜酒者腦損傷后神經(jīng)細胞的基本功能。楊迎暴等[11]報道指出白藜蘆醇能夠有效抑制急性脊髓損傷早期脂質(zhì)過氧化反應(yīng)以及活性氧的水平，具有保護脊髓損傷的作用。

我們研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可呈濃度依賴性地抑制TMT對海馬神經(jīng)元活力的損害，增加大鼠神經(jīng)元的活力，具有量效關(guān)系。5 μmol/L和10 μmol/L濃度水平的白藜蘆醇提高神經(jīng)元活力作用的差距不大，20 μmol/L提高細胞活力作用更適用于進行后續(xù)實驗。20 μmol/L水平的白藜蘆醇能夠顯著降低氧化應(yīng)激損傷的神經(jīng)元中活性氧自由基的量，提示白藜蘆醇對大鼠神經(jīng)元具有保護作用。再者，白藜蘆醇顯著減少氧化應(yīng)激損傷細胞的凋亡數(shù)，推測白藜蘆醇具有抗氧化的保護作用，防止細胞的衰老凋亡。其具體機制將在后續(xù)實驗中繼續(xù)進行研究。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅森)

Effects of resveratrol on oxidative damage induced by reactive oxygen series in rat hippocampal neurons

REN Ying-guo1, TANG Shi-lei2, GAO Yuan-lin3

(1DepartmentofNeurology,NanyangCentralHospital,Nanyang473000,China.2DepartmentofNeurosurgery,HuaiheHospitalofHenanUniversity,3DepartmentofNeurology,KaifengCenterHospital,Kaifeng475000,China.E-mail:tangyong197102@126.com)

[KEY WORDS]Resveratrol; Hippocampal neurons; Oxidative stress; Trimethyltin chloride

[ABSTRACT]AIM: To investigate the protective effects of resveratrol on oxidative damage in the rat hippocampal neurons. METHODS: The primary rat hippocampal neurons were isolated and culturedinvitro, and were treated with different concentrations of resveratrol (5, 10, 20 and 40 μmol/L) in the presence of trimethyltin chloride (TMT). Tetrahydrofuryl alcohol was used as a vehicle control. The cell viability was examined by CCK-8 assay. The generation of reactive oxygen species (ROS) was determined by DCFH-DA staining. The apoptosis of the neurons was detected by TUNEL. RESULTS: Compared with TMT group, resveratrol significantly reversed the decrease in the cell viability. The viability of the neurons reached the maximum level under the condition of resveratrol treatment at 20 μmol/L. Treatment with 20 μmol/L resveratrol inhibited TMT-induced increases in ROS generation and apoptosis in the neurons. CONCLUSION: Resveratrol attenuates TMT-induced oxidative damage in rat hippocampal neurons.

[文章編號]1000- 4718(2016)06- 1057- 05

[收稿日期]2015- 10- 28[修回日期] 2016- 03- 11

*[基金項目]河南省科技廳資助項目(No. 102300410136)

通訊作者△Tel: 0371-23906045; E-mail： tangyong197102@126.com

[中圖分類號]R363

[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.016