蘇程程，　張譯丹，　向國安，　馬永強，　周　欣，　彭守春，　魏路清△，　姬文婕△

(1中國人民武裝警察部隊后勤學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸與重癥醫(yī)學(xué)科,2天津市心血管重塑與靶器官損傷重點實驗室，天津 300162;3中國人民武裝警察部隊福建總隊醫(yī)院，福建 福州350000)

?

▲ 并列第1作者

鹽皮質(zhì)激素受體阻斷劑對SiO2誘導(dǎo)的肺巨噬細(xì)胞表型偏移的調(diào)節(jié)*

蘇程程1▲，張譯丹3▲，向國安1，馬永強2，周欣2，彭守春1，魏路清1△，姬文婕1△

(1中國人民武裝警察部隊后勤學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸與重癥醫(yī)學(xué)科,2天津市心血管重塑與靶器官損傷重點實驗室，天津 300162;3中國人民武裝警察部隊福建總隊醫(yī)院，福建 福州350000)

[摘要]目的： 研究鹽皮質(zhì)受體阻斷劑螺內(nèi)酯(spirolactone，SPI)對二氧化硅(SiO2)誘導(dǎo)的肺巨噬細(xì)胞表型偏移的影響。方法: 將60只C57BL/6小鼠隨機分為生理鹽水(NS)組、SiO2組、SPI治療組(SiO2+SPI組)及溶劑對照組(SiO2+NS組)，經(jīng)口咽吸入SiO2懸濁液(40 mg/kg)建立矽肺模型，對照組給予等量生理鹽水，SiO2+SPI組在造模后每天經(jīng)口灌胃給予SPI(10 mg·kg-1·d-1)，SiO2+NS組以相同方式給予等量生理鹽水。造模后3 d、14 d、28 d取材，進行肺泡灌洗，取灌洗液細(xì)胞進行定量、分類計數(shù)及流式細(xì)胞術(shù)分析，右下肺葉用酶解法制成單細(xì)胞懸液行流式細(xì)胞術(shù)分析。結(jié)果: 與SiO2組相比，SPI治療可以明顯降低SiO2干預(yù)后3 d、14 d支氣管肺泡灌洗液總細(xì)胞數(shù)及巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞數(shù)。SiO2干預(yù)后14 d、28 d，肺泡巨噬細(xì)胞和間質(zhì)巨噬細(xì)胞由M1表型向M2表型偏移，SPI治療可以有效逆轉(zhuǎn)SiO2誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞表型偏移。結(jié)論: SPI可以減輕SiO2導(dǎo)致的肺泡炎癥細(xì)胞浸潤，可能是通過逆轉(zhuǎn)SiO2誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞表型偏移實現(xiàn)的。

[關(guān)鍵詞]二氧化硅； 鹽皮質(zhì)受體； 螺內(nèi)酯； 巨噬細(xì)胞

矽肺是由于長期吸入二氧化硅(silicon dioxide,SiO2)顆粒引起的以肺部廣泛的結(jié)節(jié)性纖維化為特征的職業(yè)性肺疾病，是塵肺中最常見、也是最具危害性的一種;由于脫離暴露因素仍進行性發(fā)展且缺乏有效的治療方法，該病嚴(yán)重威脅各國特別是廣大發(fā)展中國家相關(guān)從業(yè)人員的健康[1-2]。相關(guān)研究表明，肺巨噬細(xì)胞在矽肺的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用：SiO2進入呼吸道后被肺巨噬細(xì)胞吞噬，導(dǎo)致溶酶體破壞，并激活NALP3炎癥復(fù)合體，觸發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)并促進纖維化形成[3]。巨噬細(xì)胞具有異質(zhì)性，在疾病的不同階段受內(nèi)環(huán)境各種因子的影響轉(zhuǎn)變?yōu)樽罹邇?yōu)勢的表型，發(fā)揮不同的功能[4]。巨噬細(xì)胞按激活狀態(tài)可以分為經(jīng)典激活巨噬細(xì)胞(M1表型)和替代激活巨噬細(xì)胞(M2表型)，分別與Th1和Th2免疫反應(yīng)有關(guān)[4-5]。現(xiàn)有研究表明巨噬細(xì)胞表型變化與慢性阻塞性肺疾病、肺纖維化等疾病的形成密切相關(guān)[6]。

鹽皮質(zhì)激素受體(mineralocorticoid receptor，MR)是一種典型的胞核甾體類激素受體，廣泛表達于腎臟、肺臟、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)組織以及心臟等部位[7-9]。在之前的研究中我們使用MR阻斷劑螺內(nèi)酯(spirolactone，SPI)減輕了矽肺小鼠肺組織炎癥及纖維化，且前期研究表明阻斷MR可以對博來霉素(bleomycin，BLM)導(dǎo)致的肺巨噬細(xì)胞表型變化起到有效的調(diào)控作用[10]，而SiO2能否引起小鼠巨噬細(xì)胞表型偏移及阻斷MR能否調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞表型的偏移尚未見文獻報道。本實驗擬探討SiO2誘導(dǎo)對小鼠肺巨噬細(xì)胞表型的影響，并研究SPI能否對巨噬細(xì)胞表型的偏移起到調(diào)控作用。

材料和方法

1 動物和試劑

6～8周齡雄性C57BL/6小鼠，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，許可證號為SCXK-(軍)2012-0004。小鼠在通風(fēng)、溫度和濕度適宜的清潔級動物室內(nèi)常規(guī)飼養(yǎng)，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實驗。

螺內(nèi)酯、0.5～10 μm SiO2(Sigma)；Ⅰ型膠原酶(Gibco)；PerCP/Cy5.5標(biāo)記的抗小鼠CD64抗體、PE/Cy7標(biāo)記抗小鼠CD11b抗體、phycoerythrin PE標(biāo)記抗小鼠CD206抗體、碘化丙啶(propidium iodide，PI)(BioLegend)；異氟烷(河北一品制藥有限公司)；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

2方法

2.1矽肺模型的制備60只雄性C57BL/6小鼠，隨機分為生理鹽水組(NS組)、SiO2組、生理鹽水干預(yù)組(SiO2+NS組)和螺內(nèi)酯干預(yù)組(SiO2+SPI組)，每組均為15只。NS組小鼠制備模型是吸入40 μL生理鹽水，其余3組小鼠吸入等容積SiO2懸濁液(50 mg/mL)。吸入的方法采用經(jīng)口咽吸入，具體的方法簡述如下：采用MIDMARK小動物麻醉罐2%異氟烷輕度麻醉小鼠，將小鼠上頜中切牙懸掛于特制環(huán)形架的橡膠帶上，鑷子夾閉鼻孔，同時從一側(cè)嘴角輕輕拉出舌以暴露舌根和咽后壁，將均一的SiO2懸濁液或生理鹽水沿咽后壁緩慢注入，確保其隨呼吸運動吸入肺部，用吸耳球進行正壓通氣，結(jié)束后將小鼠置于掌心保持上體直立位，直至完全蘇醒。模型制備后，SiO2+SPI組每天經(jīng)口灌胃給予螺內(nèi)酯(10 mg·kg-1·d-1)治療，SiO2+NS組給予同等容積的生理鹽水灌胃。

2.2標(biāo)本的采集及處理分別于矽肺模型建立后第3、14、28天取材。將小鼠麻醉后摘眼球放血處死，固定后于頸部正中縱行切開皮膚，鈍性分離皮下組織，暴露氣管，將氣管剪開小切口插入插管并結(jié)扎，用注射器注入1 mL預(yù)冷無菌生理鹽水，輕輕按壓小鼠胸廓，回吸液體，共進行3次。將收集的支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)進行細(xì)胞計數(shù)、分類計數(shù)及流式細(xì)胞術(shù)分析，右下肺葉用于制備單細(xì)胞懸液，進行流式細(xì)胞術(shù)檢測。

2.3肺泡灌洗液細(xì)胞分類計數(shù)將BALF 于4 ℃ 300×g離心10 min，棄去上清，用紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞，再一次離心后棄去上清，用預(yù)冷的D-Hanks液重懸細(xì)胞，進行細(xì)胞計數(shù)，取1×105細(xì)胞甩片，4 ℃、1 500 r/min離心15 min進行甩片，將玻片上的細(xì)胞在預(yù)冷的無水乙醇中固定30 min，水化后進行HE染色，封片后用光學(xué)顯微鏡進行觀察，并在400倍視野中隨機選擇1個區(qū)域，連續(xù)計數(shù)200個細(xì)胞，計算巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞比例，并根據(jù)細(xì)胞計數(shù)的結(jié)果得出各種細(xì)胞的絕對計數(shù)。

2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測肺泡巨噬細(xì)胞(alveolar macrophages,AMφ)表型變化取5×105BALF細(xì)胞，加入10 μL抗體混合液(含PI 2 μL、PerCP/Cy5.5-CD64 1.2 μL和PE-CD206 1 μL)24 ℃避光孵育15 min, 加入600 μL staining buffer，300目尼龍濾網(wǎng)過濾至流式試管，Beckman Coulter FC500流式細(xì)胞儀進行檢測。

2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測肺間質(zhì)巨噬細(xì)胞(interstitial macrophages,IMφ)表型變化將新鮮的經(jīng)過灌洗的右下肺置于1.5 mL Eppendorf管，在冰上用預(yù)冷的D-Hanks溶液清洗肺組織3次，用眼科剪剪碎肺組織；加入1.5 mL 0.2% I型膠原酶，1 mL移液器輕輕吹散組織團塊；37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育1 h，每隔20 min輕輕抽吸數(shù)次；將所得細(xì)胞懸液用300目尼龍濾網(wǎng)過濾，4 ℃、300×g離心5 min后棄上清，加入預(yù)冷的紅細(xì)胞裂解液，作用10 min后離心棄上清，D-Hanks溶液洗滌后重懸細(xì)胞并計數(shù)，取5×105細(xì)胞，加入10 μL抗體混合液(含PI 2 μL、PerCP/Cy5.5-CD64 1.2 μL、PE/Cy7-CD11b 1 μL和PE-CD206 1 μL)24 ℃避光孵育15 min, 加入600 μL staining buffer，300目尼龍濾網(wǎng)過濾至流式試管。

3統(tǒng)計學(xué)處理

STATA 14.1統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，組間比較采用t檢驗和單因素方差分析，多重比較使用Tukey’s法，以P<0.05作為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1各組小鼠肺泡灌洗液細(xì)胞分類計數(shù)變化

SiO2誘導(dǎo)后3 d，小鼠肺泡灌洗液中的總細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞計數(shù)明顯增高(P<0.01)，而給予SPI干預(yù)后，BALF總細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)及淋巴細(xì)胞數(shù)均明顯下降(P<0.05)，而巨噬細(xì)胞數(shù)未見顯著下降。

SiO2誘導(dǎo)后14 d，小鼠肺泡灌洗液總細(xì)胞數(shù)及各類細(xì)胞分類計數(shù)均顯著增高(P<0.01)，而給予SPI干預(yù)后，BALF中的總細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)及巨噬細(xì)胞數(shù)均顯著下降(P<0.05)，而淋巴細(xì)胞計數(shù)未見顯著下降。

SiO2誘導(dǎo)后28 d，小鼠肺泡灌洗液總細(xì)胞數(shù)及各類細(xì)胞分類計數(shù)顯著增高(P<0.01)，SPI干預(yù)可以顯著降低肺泡灌洗液總細(xì)胞數(shù)、巨噬細(xì)胞數(shù)及中性粒細(xì)胞數(shù)(P<0.05),見圖1。

Figure 1.SPI treatment alleviated inflammatory cell infiltration induced by SiO2administration. Mean±SEM.n=5.**P<0.01vsNS group;#P<0.05,##P<0.01vsSiO2+SPI group.

圖1螺內(nèi)酯干預(yù)后小鼠肺泡灌洗液細(xì)胞總數(shù)及分類計數(shù)的變化

2各組小鼠肺炎癥纖維化轉(zhuǎn)化期肺泡巨噬細(xì)胞亞群變化

造模后14 d，SiO2組小鼠M1 AMφ比例顯著下降，與NS組相比差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.01)；而SiO2+SPI組小鼠M1 AMφ比例較SiO2+NS組明顯增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.01)。M2 AMφ也有相應(yīng)的變化趨勢。造模后28 d小鼠肺泡巨噬細(xì)胞表型存在與14 d肺泡巨噬細(xì)胞表型偏移類似的變化，具體表現(xiàn)為SiO2可以誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞由M1表型向M2表型偏移，而SPI干預(yù)可以明顯逆轉(zhuǎn)上述表型偏移(P<0.01)，見圖2。

3各組小鼠肺炎癥纖維化轉(zhuǎn)化期間質(zhì)巨噬細(xì)胞亞群變化

如圖3所示，在造模后的14 d和28 d，SiO2組小鼠M1 IMφ比例較NS組均明顯下降，M2 IMφ比例升高(P<0.01)。給予SPI干預(yù)小鼠M1 IMφ比例明顯升高，相反M2 IMφ比例下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.01)。

Figure 2.SPI treatment reversed alveolar macrophage (AMφ) subtype switching induced by SiO2administration. Mean±SEM.n=5.**P<0.01vsNS group;##P<0.01vsSiO2+SPI group.

圖2螺內(nèi)酯干預(yù)后小鼠肺泡巨噬細(xì)胞表型的變化

Figure 3.SPI treatment reversed pulmonary interstitial macrophage (IMφ) subtype switching induced by SiO2administration. Mean±SEM.n=5.**P<0.01vsNS group;##P<0.01vsSiO2+SPI group.

圖3螺內(nèi)酯干預(yù)后小鼠肺間質(zhì)巨噬細(xì)胞表型變化

討論

矽肺是塵肺病中最常見、危害性最大的一種。現(xiàn)階段對矽肺的治療仍停留在氧療、肺泡灌洗及肺移植等對癥治療階段。近年來，國內(nèi)外學(xué)者從免疫調(diào)節(jié)及細(xì)胞因子水平對矽肺的發(fā)病機制進行了探索，然而其確切的機制尚未完全闡明。近來的研究表明，腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)在肺損傷的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用[11]。近來的研究證明針對該系統(tǒng)的干預(yù)可以在博來霉素導(dǎo)致的肺損傷模型中發(fā)揮明顯的治療作用[12]，多項研究使用鹽皮質(zhì)受體阻斷劑SPI治療博來霉素導(dǎo)致的肺纖維化，效果良好。SPI能否治療石英導(dǎo)致的肺損傷及肺纖維化鮮見于文獻報道，有待進一步的研究。

巨噬細(xì)胞是廣泛存在于呼吸系統(tǒng)的主要免疫防御細(xì)胞，是機體呼吸系統(tǒng)抵御病原體第一道防線的重要組成部分[13]，按照存在的部位，巨噬細(xì)胞可以分為存在于肺泡和呼吸道的肺泡巨噬細(xì)胞及存在于肺間質(zhì)的間質(zhì)巨噬細(xì)胞，兩者均在矽肺發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用。一般的觀點認(rèn)為，M1表型巨噬細(xì)胞具有促炎、抵抗病原體的作用，而M2表型巨噬細(xì)胞具有組織重塑、促纖維化的作用[14]。Herd等[15]的研究表明巨噬細(xì)胞對SiO2顆粒的吞噬反應(yīng)與其表型有關(guān)：M1表型巨噬細(xì)胞與M2表型及未極化的巨噬細(xì)胞相比對入侵的SiO2顆粒有更強的吞噬作用，因而在矽肺的發(fā)生發(fā)展中表現(xiàn)為保護作用，而M2表型則表現(xiàn)為促纖維化的作用，因此調(diào)控巨噬細(xì)胞表型可能是治療矽肺的有效靶點[15]。MR廣泛分布于包括巨噬細(xì)胞在內(nèi)的多個器官系統(tǒng)[7-9]，本課題組已經(jīng)使用MR阻斷劑SPI調(diào)控肺部巨噬細(xì)胞表型，治療BLM導(dǎo)致的肺損傷及纖維化[10]，因此我們假設(shè)SiO2可以誘導(dǎo)小鼠肺巨噬細(xì)胞發(fā)生表型偏移，而SPI可以逆轉(zhuǎn)SiO2誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞表型偏移。

本研究發(fā)現(xiàn)，在SiO2干預(yù)后第3天及第14天，小鼠BALF中的細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞顯著增高，在造模后第3天，SPI顯著降低了BALF總細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)及淋巴細(xì)胞數(shù)，在造模后第14天，SPI顯著減低了BALF總細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)及巨噬細(xì)胞數(shù)，表明SPI顯著減輕了SiO2導(dǎo)致的炎癥細(xì)胞滲出。同時，檢測SiO2誘導(dǎo)后14 d、28 d肺泡巨噬細(xì)胞、肺間質(zhì)巨噬細(xì)胞亞型發(fā)現(xiàn)，SiO2組有保護作用的M1表型巨噬細(xì)胞比例明顯下降，向具有促纖維化作用的M2表型偏移，與Herd等[15]的研究一致。而SiO2+SPI組M1表型的比例顯著提高，M2表型比例相應(yīng)下降，與SiO2組及SiO2+NS組相比差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性。由此可見，結(jié)果驗證了本研究的假設(shè)：SiO2可以誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞表型由M1向M2表型偏移，SPI可以逆轉(zhuǎn)巨噬細(xì)胞表型的偏移，并減輕小鼠肺泡炎癥細(xì)胞的滲出，可能是SPI減輕矽肺小鼠炎癥和纖維化的潛在機制，有待于進一步的研究。

綜上所述，SPI治療可以在一定程度上提高具有保護作用的M1表型巨噬細(xì)胞的比例，從而減輕矽肺早期的炎癥細(xì)胞浸潤。下一步的研究擬進一步研究SPI通過調(diào)控巨噬細(xì)胞表型治療矽肺的具體分子生物學(xué)機制。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅森)

Regulatory effects of spirolactone on SiO2-induced lung macrophage subtype switching

SU Cheng-cheng1, ZHANG Yi-dan3, XIANG Guo-an1, MA Yong-qiang2, ZHOU Xin2, PENG Shou-chun1, WEI Lu-qing1, JI Wen-jie1

(1DepartmentofRespiralogyandCriticalCareMedicine,PingjinHospital,LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForces,2TianjinKeyLaboratoryofCardiovascularRemodelingandTargetOrganInjury,Tianjin300162,China;3FujianArmedPoliceCorpsHospital，F(xiàn)uzhou350000,China.E-mail:ji_wenjie@hotmail.com;wei_luqing@hotmail.com)

[KEY WORDS]Silicon dioxide; Mineralocorticoid receptors; Spirolactone; Macrophages

[ABSTRACT]AIM: To investigate the influence of spirolactone (SPI) on mouse pulmonary macrophage subtype switching induced by silicon dioxide (SiO2). METHODS: C57BL/6 mice were divided into normal saline (NS) group, SiO2group, SiO2+SPI group and SiO2+NS group. A mouse model of silicosis was developed with crystalline SiO2particles (40 mg/kg, via oropharyngeal instillation). SPI (20 mg/kg) or (NS) was delivered daily by oral gavage after SiO2administration. The mice were sacrificed on days 3, 14 and 28. Alveolar washing, total cell counting, differential cell counting and flow cytometry analysis were performed. The right lower lobe of lavaged lungs was collected to prepare single-cell suspension for flow cytometry analysis. RESULTS: Compared with SiO2group, SPI treatment significantly alleviated SiO2-induced inflammatory cell accumulation in brochoalveolar lavage fluid on day 3 and 14. Compared with NS group, the M1 alveolar macrophages and M1 pulmonary interstitial macrophages in SiO2group switched to M2 subtype dramatically, while SPI treatment reversed the switching effectively.CONCLUSION: SPI treatment alleviates SiO2-induced inflammatory cell accumulation, which may be related to reversing macrophage subtype switching.

[文章編號]1000- 4718(2016)06- 1112- 06

[收稿日期]2016- 03- 04[修回日期] 2016- 04- 05

*[基金項目]國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 81441101)；天津市自然科學(xué)基金資助項目(No. 15JCZDJC35000)；武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院種子基金資助項目(No. FYZ201510; No. FYM201538)

通訊作者△姬文婕 Tel: 022-60577283； E-mail: ji_wenjie@hotmail.com； 魏路清 Tel: 022-60578671； E-mail: wei_luqing@hotmail.com

[中圖分類號]R363

[文獻標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.025