王　爽　高　捷　王　軍劉　銳(西安醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，陜西　西安　700)

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NBQX對帕金森病模型大鼠內(nèi)側(cè)前額葉皮層錐體神經(jīng)元電活動及5－羥色胺受體的影響

王爽高捷王軍1劉銳2(西安醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，陜西西安710021)

〔摘要〕目的研究6－羥多巴胺( 6－OHDA)損毀大鼠黑質(zhì)致密部( SNc)后內(nèi)側(cè)前額葉皮層( mPFC)中錐體神經(jīng)元電活動增強及5－羥色胺( 5－HT) 1A受體敏感性下降與AMPA/KA受體的相關(guān)性。方法應(yīng)用在體細(xì)胞外電生理學(xué)記錄的方法觀察6－OHDA損毀大鼠SNc后，頸靜脈應(yīng)用AMPA/KA受體阻滯劑NBQX，進(jìn)一步局部應(yīng)用5－HT1A受體激動劑8－OH－DPAT后錐體神經(jīng)元放電頻率的變化。結(jié)果頸靜脈應(yīng)用AMPA/KA受體阻滯劑NBQX后，帕金森病( PD)組大鼠錐體神經(jīng)元爆發(fā)式放電比例明顯降低( P＜0．05)，放電頻率無明顯變化( P＞0．05)，進(jìn)一步局部應(yīng)用5－HT1A受體激動劑8－OH－DPAT后錐體神經(jīng)元放電頻率無明顯變化( P＞0．05)。結(jié)論AMPA/KA受體阻滯劑對PD模型大鼠內(nèi)側(cè)前額葉皮層錐體神經(jīng)元電活動增強有恢復(fù)作用; 5－HT1A受體敏感性下降可能與AMPA/KA受體關(guān)系不大。

〔關(guān)鍵詞〕帕金森病; mPFC; AMPA/KA受體; 5－羥色胺1A受體

1西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院急診科

2西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科

第一作者:王爽( 1978－)，男，副教授，博士，主要從事神經(jīng)退行性疾病的中樞機制研究。

帕金森病( PD)是由于黑質(zhì)致密部( SNc)多巴胺( DA)能神經(jīng)元進(jìn)行性變性導(dǎo)致紋狀體中DA水平顯著降低，而引起整個基底神經(jīng)節(jié)環(huán)路的功能紊亂，其主要的臨床癥狀為運動遲緩、靜止性震顫、肌強直和姿勢步態(tài)異常〔1〕。有關(guān)DA能神經(jīng)元受損原因和PD發(fā)病機制的研究尚無定論。近年來研究發(fā)現(xiàn)，谷氨酸( Glu)的興奮毒性在PD的發(fā)展過程中發(fā)揮主要作用〔2〕。Glu是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，其相應(yīng)的受體主要分為兩大類: iGluRs和mGluRs。iGluRs進(jìn)一步分為N－甲基－D－天門冬氨酸受體( NMDA)，氨基－3－羥基－5－甲基異惡唑受體( AMPA)及海人藻酸( KA)受體，它們的活化導(dǎo)致相關(guān)離子通道的開放。而且本課題組以前的研究證明，5－羥色胺( HT) 1A受體對于在PD非運動系統(tǒng)癥狀中起重要作用，而AMPA/KA受體對于5－HT1A受體有無影響我們并不十分清楚〔3〕。本文通過研究內(nèi)側(cè)前額葉皮層( mPFC)錐體神經(jīng)元放電頻率的改變，探討AMPA/KA受體與5－HT1A受體的相互影響。

1材料和方法

1. 1動物和藥品雄性SD大鼠32只，體重220～300 g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。大鼠在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境飼養(yǎng)，室溫20℃～25℃，24 h晝夜循環(huán)光照，自由攝食飲水。大鼠隨機分為:假手術(shù)組( n= 11)和PD組( n= 21)。實驗所用6－OHDA、NBQX、8－OH－DPAT和地昔帕明均購自美國Sigma公司。

1. 2大鼠PD模型的建立采用6－OHDA化學(xué)性毀損單側(cè)SNc中的DA能神經(jīng)元，建立PD大鼠模型。術(shù)前3 d給予青霉素腹腔注射( 80 000 U/d)。大鼠用水合氯醛( 400 mg/kg，i．p．)麻醉后，將頭固定于腦立體定位儀上。在6－OHDA注射前30 min，給大鼠注射地昔帕明( 25 mg/kg，i．p．)以保護去甲腎上腺素能神經(jīng)元。常規(guī)消毒，剪開頭皮，剝離骨膜，暴露顱骨，將顱骨前后囟調(diào)平(前后囟水平高度相差在0．2 mm以內(nèi))。根據(jù)Paxinos－Watson腦定位圖對右側(cè)SNc進(jìn)行定位，坐標(biāo)位置: AP:－5．0～5．3 mm; L: 1．9～2．1 mm; D: 7．1～7．4 mm。用微型電鉆在顱骨上鉆一個直徑約3 mm的小孔，剝離硬腦膜。用10 μl的微量注射器與玻璃微電極相粘，尖端直徑約50 μm，分兩個位點在SNc內(nèi)注射6－OHDA(手術(shù)前配制，4℃避光保存)。每位點注射4 μg/2 μl，總量8 μg/4 μl，給藥速度1 μl/min，注射完畢后留置5～10 min，退出玻璃微電極，消毒止血后縫合傷口，腹腔注射青霉素80 000 U預(yù)防感染，待清醒后放置籠內(nèi)飼養(yǎng)。假手術(shù)組大鼠注射等量的生理鹽水，含0．02%的Vit－C，手術(shù)方法與PD組大鼠相同。

1. 3 PD模型大鼠的行為學(xué)檢測術(shù)后第2周給大鼠頸部皮下注射阿樸嗎啡( 0．05 mg/kg)，觀察大鼠的旋轉(zhuǎn)行為。若大鼠在藥物注射后1～15 min出現(xiàn)向健側(cè)旋轉(zhuǎn)，旋轉(zhuǎn)速度每1 min大于6圈，并且5 min內(nèi)超過20圈者，表明PD模型成功。不出現(xiàn)旋轉(zhuǎn)、向患側(cè)旋轉(zhuǎn)或旋轉(zhuǎn)總?cè)?shù)不足者則視為模型不成功，予以淘汰。

1. 4電生理學(xué)記錄電生理學(xué)記錄在SNc損毀后第3周進(jìn)行。大鼠在4%水合氯醛( 400 mg/kg，i．p．)麻醉下行氣管及靜脈插管術(shù)后，頭部固定于立體定位儀上，根據(jù)Paxinos－Watson大鼠腦定位圖譜，確定右側(cè)內(nèi)側(cè)前額葉皮層的坐標(biāo)位置: AP: 2．7～3．2 mm; L: 0．1～0．6 mm; D: 1．5～2．5 mm。在冠狀面與中線成2°角處傾斜進(jìn)針，以避免損傷矢狀竇。采用玻璃微電極細(xì)胞外記錄法記錄錐體神經(jīng)元的放電，電極尖端直徑1～2 μm，阻抗10～20 MΩ，充灌液為0．5 mol/L醋酸鈉含2%滂胺天藍(lán)。細(xì)胞放電經(jīng)MEZ－8301微電極放大器，顯示于VC－11記憶示波器，以觀察電位波形、頻率和細(xì)胞放電的形式，同時信號輸入監(jiān)聽器監(jiān)聽。將信噪比大于3∶1的、穩(wěn)定的單細(xì)胞放電經(jīng)生物電信號采集與分析系統(tǒng)( CED1401 Spike2)輸入計算機后，作實時觀察、儲存和進(jìn)行頻率及放電形式的分析。采樣時間10～20 min。整個實驗過程中監(jiān)測大鼠的心電，直腸溫度維持在( 37± 0．5)℃。

1. 5錐體神經(jīng)元的確認(rèn)mPFC中錐體神經(jīng)元通常表現(xiàn)為緩慢的自發(fā)放電，頻率0．1～5 Hz;動作電位的波寬＞1 ms;呈現(xiàn)不規(guī)則或爆發(fā)式的放電形式。

1. 6統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS13．0統(tǒng)計軟件行方差分析及χ2檢驗。

2結(jié)果

與給藥前比較，PD組大鼠靜脈給予AMPA/KA拮抗劑NBQX( 2 mg/kg，i．v．)后錐體細(xì)胞爆發(fā)式放電頻率由78．6%下降為43．65%( P=0．033)。與給藥前比較，假手術(shù)組大鼠靜脈給予AMPA/KA拮抗劑NBQX( 2 mg/kg，i．v．)后錐體細(xì)胞放電頻率明顯降低( P=0．021)，而繼續(xù)局部給予5－HT1A受體激動劑8－OH－DPAT( 5 μg/100 nl)后則明顯抑制錐體細(xì)胞放電頻率( P= 0．001) ;而PD模型組大鼠靜脈給予NBQX( 2 mg/kg，i．v．)后錐體細(xì)胞放電頻率無明顯變化( P = 0．935)，繼續(xù)局部給予8－OH－DPAT( 5 μg/100 nl)后錐體細(xì)胞放電頻率無明顯變化( P=0．982)。見表1。

表1兩組大鼠內(nèi)側(cè)前額葉皮層錐體神經(jīng)元放電頻率變化(±s)

與PD組比較: 1) P=0．021，2) P=0．001

組別　　給藥前　　給予NBQX給予8－OH－DPAT假手術(shù)組( n=11)　 2．35±0．12　 1．25±0．071)0．57±0．072)PD組( n=21)　 3．68±0．16　 3．24±0．13　 3．05±0．13

3討論

神經(jīng)元均位于內(nèi)側(cè)前額葉皮層內(nèi)，其電活動的特征符合錐體神經(jīng)元的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，屬于錐體神經(jīng)元。AMPA/KA受體阻滯劑對PD模型大鼠內(nèi)側(cè)前額葉皮層錐體神經(jīng)元電活動增強有恢復(fù)作用可能與以下原因有關(guān)。首先，正常SNc中AMPA受體依賴部位的密度比NMDA高10倍。大白鼠SNc中主要存在AMPA選擇性受體亞型，即Glu－R1－AMPA，GluR2/3，而無GluR4特異抗原決定簇。AMPA在PD患者SNc中的含量減少，但代謝型受體PD與正常人無區(qū)別。其次，GluR的興奮毒性與PD的發(fā)生機理密切相關(guān)。其受體拮抗劑對MPP和6－OHDA引起毒性損傷均有保護作用，重復(fù)應(yīng)用可延長其保護作用;說明Glu受體過度興奮確實與PD神經(jīng)元變性的發(fā)病機理有關(guān)。還有研究發(fā)現(xiàn)，長期應(yīng)用左旋多巴治療的PD大鼠模型中發(fā)現(xiàn)Glu水平的增加以及GLT－1 mRNA表達(dá)增加，推測這種GLT－1表達(dá)增加可能由細(xì)胞外高濃度的Glu導(dǎo)致的興奮性毒性的保護性機制來發(fā)揮作用〔4〕。在PD鼠模型中應(yīng)用Glu受體阻斷劑或增加Glu的攝取都顯示了明顯的治療效果〔5〕。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AMPA/KA受體拮抗劑NBQX可以減少PD大鼠錐體神經(jīng)元的爆發(fā)式放電比例，從神經(jīng)電生理角度證明了Glu受體興奮可能與PD發(fā)生有關(guān)。

頸靜脈應(yīng)用AMPA/KA受體阻滯劑NBQX后，PD組大鼠錐體神經(jīng)元放電頻率無明顯變化，進(jìn)一步局部應(yīng)用5－HT1A受體激動劑8－OH－DPAT后錐體神經(jīng)元放電頻率無明顯變化可能和以下原因有關(guān):首先，本研究發(fā)現(xiàn)，PD模型大鼠錐體神經(jīng)元電活動增強，5－HT1A受體敏感性下降;其次，本實驗結(jié)果說明，AMPA/KA受體可能與5－HT1A受體敏感性下降關(guān)系不大，但仍需要進(jìn)一步研究。

4參考文獻(xiàn)

1 Cohen JD，Peristein WM，Braver TS，et al．Temporal dynamics of brain activation during a working memory task〔J〕．Nature，1997; 386( 6625) : 604．

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3 Wang S，Zhang QJ，Liu J，et al．The firing activity of pyramidal neurons in medial preforontal cortex and their response to 5－HT1A receptor stimulation in a rodent model of Parkinson's disease〔J〕．Neuroscience，2009; 162: 1091－100．

4 Lee HK，Takamiya K，Han JS，et al．Phosphorylation of the AMPA receptor GluR1 subunit is required for synaptic plasticity and retention of spatial memory〔J〕．Cell，2003; 112: 631－43．

5 Robert S，Melon C，Guillet B，et al．Chronic L－DOPA treatment increases extracellular glutamate levels and GLT1 expression in the basal ganglia in a rat model of Parkinson's disease〔J〕．Eur J Neurosci，2004; 20( 5) : 1255－66．

〔2014－07－16修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

基金項目:陜西省科技廳青年基金資助( No．2011JQ4005) ;陜西省科技廳基金資助( No．2012KJXX－43) ;陜西省教育廳基金資助( No．2013JK0761)

〔中圖分類號〕R338. 2

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202( 2016) 02-0272-02;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2016. 02. 007