李自青,趙立峰,劉　宏

(1.山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院,山西大同037009;2.山西大同大學(xué)呼吸病與職業(yè)病研究所,山西大同037009;3.天津市北辰區(qū)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展服務(wù)中心,天津北辰300400)

鹿產(chǎn)氣莢膜梭菌二價(jià)滅活疫苗的制備和免疫效力試驗(yàn)

李自青1,2,趙立峰3,劉宏1,2

(1.山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院,山西大同037009;2.山西大同大學(xué)呼吸病與職業(yè)病研究所,山西大同037009;3.天津市北辰區(qū)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展服務(wù)中心,天津北辰300400)

為了研制鹿產(chǎn)氣莢膜梭菌A型和C型二價(jià)滅活疫苗,對(duì)疫苗的免疫效力和免疫持續(xù)期以及疫苗保存期進(jìn)行測(cè)定,從而為開發(fā)免疫原性較好的無毒副作用的滅活疫苗奠定基礎(chǔ).將產(chǎn)氣莢膜梭菌T5-A和J28-C株的培養(yǎng)液按1∶1混和,混合菌液按9∶1加入滅菌鋁膠,經(jīng)濃縮制備3批滅活疫苗0406-1,0406-2,0406-3.安全檢驗(yàn)合格后,采用"血清中和試驗(yàn)"檢驗(yàn)技術(shù),進(jìn)行家兔攻毒與血清抗體效價(jià)的平行試驗(yàn),測(cè)定疫苗的免疫效力和免疫持續(xù)期以及疫苗保存期.結(jié)果是疫苗的安全性良好,免疫效力表明疫苗的免疫保護(hù)率為100%,抗體效價(jià)顯示C型抗體效價(jià)高于A型,疫苗對(duì)C型菌的保護(hù)期長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月,而對(duì)A型菌的保護(hù)期為3個(gè)月.疫苗保存期的測(cè)定表明,疫苗可以保存10個(gè)月以上.表明3批疫苗安全性較好,對(duì)家兔有較強(qiáng)的免疫保護(hù),為疫苗的下一步鹿田間試驗(yàn)提供了理論依據(jù).

產(chǎn)氣莢膜梭菌;鹿滅活疫苗;疫苗制備;免疫效力

產(chǎn)氣莢膜梭菌是一種嚴(yán)重威脅人類和動(dòng)物健康的病原菌.該菌在土壤、人以及動(dòng)物腸道和糞便中廣泛存在,經(jīng)常由于深部創(chuàng)傷繼發(fā)感染,可引起人食物中毒和動(dòng)物出血性腸炎[1].出血性腸炎是我國(guó)飼養(yǎng)鹿最常見的疾病,其死亡率占飼養(yǎng)鹿總死亡率的60%以上,給鹿養(yǎng)殖場(chǎng)造成很大的威脅[2].本試驗(yàn)對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌滅活疫苗進(jìn)行研制,并對(duì)疫苗的免疫效力和免疫持續(xù)期以及疫苗保存期進(jìn)行了測(cè)定.旨在為開發(fā)免疫原性好且沒有毒副作用的二價(jià)鹿產(chǎn)氣莢膜梭菌滅活疫苗,為防止鹿產(chǎn)氣莢膜梭菌病的流行奠定基礎(chǔ).

1　材料與方法

1.1菌株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物疫苗制備菌種產(chǎn)氣莢膜梭菌T5-A和J28-C由本校微生物實(shí)驗(yàn)室保存.健康家兔體重1.5～2 kg,ICR品系小鼠體重10～ 12 g,雌雄各半,由本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供.

1.2細(xì)菌培養(yǎng)和毒力測(cè)定產(chǎn)氣莢膜梭菌T5-A和J28-C菌株參照文獻(xiàn)[3]測(cè)定的最佳產(chǎn)毒條件在35℃培養(yǎng)7 h,取培養(yǎng)物(4℃)下4 000 r/min離心20 min,收集上清倍比稀釋后,每個(gè)劑量耳靜脈注射6只家兔,觀察家兔死亡情況,確定T5-A和J28-C菌株對(duì)家兔的最小致死量(MLD).同樣的方法測(cè)定菌株對(duì)小鼠的最小致死量(MLD).

1.3全菌滅活疫苗的制備將菌體培養(yǎng)液離心過濾除菌后,上清液用無菌1 mol/L NaOH調(diào)至pH值7.2,按體積比加入0.5%甲醛,37℃下脫毒5 d.經(jīng)滅活檢驗(yàn)合格后,將產(chǎn)氣莢膜梭菌T5-A和J28-C株的培養(yǎng)液按1∶1混和.混合菌液按9∶1加入滅菌鋁膠,混勻,4℃下靜置10 d.棄1/2上清液,加入剩余量0.006%硫柳汞,混勻.無菌檢驗(yàn)合格后,配苗分裝,制備3批產(chǎn)氣莢膜梭菌滅活疫苗0406-1,0406-2,0406-3,4℃保存.

1.4疫苗安全檢驗(yàn)按照《中國(guó)獸藥典》(2010版)[4]質(zhì)量檢驗(yàn)方法對(duì)每種疫苗進(jìn)行物理性狀和細(xì)菌性檢驗(yàn),合格后用3批疫苗分別接種體重1.5～2 kg健康家兔6只,每只頸部皮下注射4 mL,連續(xù)10 d觀察家兔局部或全身有無異常反應(yīng). 1.5免疫劑量測(cè)定取健康家兔60只,隨機(jī)分成3組,每組20只,疫苗0406-1采用頸部皮下注射,注射劑量分別為1 mL、2 mL、3 mL,同時(shí)取10只作為對(duì)照注射生理鹽水.免疫21 d后,每組20只平均分為兩個(gè)小組,分別用1MLD A型和C型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素耳靜脈注射進(jìn)行攻毒,觀察7 d,根據(jù)家兔死亡情況確定最小免疫劑量,并計(jì)算保護(hù)率.

1.6免疫效力試驗(yàn)3批疫苗以最小免疫劑量分別接種健康家兔20只,21 d后耳靜脈采血,將每組免疫家兔血清混合,取0.1 mL混合血清分別加入不同最小致死量(MLD)的A型菌和C型菌,混勻,37℃恒溫水浴40 min,然后尾靜脈注射小鼠,每組6只,每只0.3 mL,同時(shí)設(shè)立對(duì)照,根據(jù)小鼠死亡情況測(cè)定血清抗體效價(jià).然后分別用1MLD A型和C型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素對(duì)家兔進(jìn)行攻毒,計(jì)算保護(hù)率.

1.7免疫持續(xù)期試驗(yàn)分別用3批疫苗免疫健康家兔,在免疫3個(gè)月、6個(gè)月及9個(gè)月后耳靜脈采血,測(cè)定血清抗體效價(jià),方法同1.6.之后分別用1MLD A型和C型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素進(jìn)行攻毒,觀察家兔死亡情況并計(jì)算保護(hù)率. 1.8疫苗保存期試驗(yàn)3批疫苗在4℃～10℃保存8、10、12個(gè)月后,分別取出免疫家兔,免疫21 d后,分別用A型和C型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素進(jìn)行攻毒,攻毒劑量為1MLD,觀察家兔死亡情況.

2　結(jié)果

2.1試驗(yàn)菌株毒力測(cè)定毒力測(cè)定結(jié)果顯示,產(chǎn)氣莢膜梭菌對(duì)家兔的MLD:T5-A為1.5 mL,J28-C為0.025 mL.對(duì)小鼠的MLD:T5-A為0.025 mL,J28-C為0.001 mL.

2.2安全性檢驗(yàn)制備的疫苗物理性狀呈均勻的混懸液,無菌檢驗(yàn)呈陰性.3批疫苗接種的家兔食欲正常,精神狀態(tài)良好,體溫未升高,無全身不良反應(yīng),注射部位無潰爛,僅個(gè)別家兔局部出現(xiàn)輕微的肉芽腫,表明疫苗無毒,安全性較好.

2.3最小免疫量試驗(yàn)不同劑量疫苗免疫家兔后的攻毒結(jié)果顯示,免疫劑量1 mL(8X1010CFU)時(shí)疫苗保護(hù)率為60%～70%(6/10～7/10),免疫劑量為2 mL和3 mL的保護(hù)率均達(dá)到100%(10/10),說明疫苗的最小免疫劑量為2 mL.

2.4免疫效力試驗(yàn)和C型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素對(duì)免疫組家兔和對(duì)照組進(jìn)行攻毒,結(jié)果表明,疫苗的免疫保護(hù)率均為100%(10/10).血清抗體效價(jià)結(jié)果顯示,A型毒素1MLD～3MLD劑量測(cè)毒時(shí),小鼠存活,4MLD～6MLD劑量時(shí),小鼠死亡;C型毒素1MLD～4MLD劑量時(shí),小鼠存活,5MLD～ 6MLD劑量時(shí),小鼠死亡;陽性對(duì)照小鼠全部存活,陰性對(duì)照小鼠死亡.表明C型抗體效價(jià)為4MLD,A型抗體效價(jià)為3MLD,提示我們疫苗對(duì)C型菌的免疫保護(hù)可能高于A型.

2.5免疫持續(xù)期試驗(yàn)3批疫苗(0406-1,0406-2,0406-3)免疫家兔后,攻毒結(jié)果顯示,3個(gè)月后疫苗對(duì)A型菌和C型菌的保護(hù)率都為100%(10/ 10),6個(gè)月后對(duì)A型菌的保護(hù)率降低到60%～ 70%(6/10～7/10),而對(duì)C型菌的保護(hù)率仍為100%(10/10),9個(gè)月后對(duì)A型菌保護(hù)率降低到20%～30%(2/10～3/10),對(duì)C型菌保護(hù)率為60%～70%(6/10～7/10).血清抗體效價(jià)測(cè)定結(jié)果顯示,免疫3個(gè)月后與初免疫后抗體效價(jià)保持不變,A型為3MLD,C型為4MLD;免疫后6個(gè)月抗體效價(jià)下降,A型為1MLD,C型為2MLD;免疫后9個(gè)月A型為0,C型為1MLD.表明疫苗的保護(hù)效率與血清抗體效價(jià)保持一致.2.6疫苗保存期試驗(yàn)疫苗在4℃～10℃保存8個(gè)月、10個(gè)月疫苗對(duì)A型菌和C型菌的保護(hù)率均為100%(10/10),但保存12個(gè)月后疫苗對(duì)A型菌的保護(hù)率降低到30%～50%(3/10～5/10),對(duì)C型菌的保護(hù)率降低到50%～70%(5/10～7/10).

3　討論

產(chǎn)氣莢膜梭菌病對(duì)家畜養(yǎng)殖業(yè)的危害非常嚴(yán)重,其中鹿出血性腸炎就是危害鹿養(yǎng)殖業(yè)最為嚴(yán)重的疾病之一,在20世紀(jì)90年代曾經(jīng)給山西的鹿養(yǎng)殖戶造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失.該病一旦發(fā)病,病死率極高,疫苗防控是最有效的辦法.疫苗的有效防控程度取決于制備疫苗的菌株與發(fā)病流行的菌株抗原的親緣關(guān)系[5].本研究在采集山西省內(nèi)各養(yǎng)鹿場(chǎng)因出血性腸炎而病死鹿病料,分離并鑒定其病原菌是A型和C型產(chǎn)氣莢膜梭菌的基礎(chǔ)上,制備了產(chǎn)氣莢膜梭菌A型菌和C型的二價(jià)滅活疫苗,以鋁膠為佐劑,通過安全性和免疫效力檢驗(yàn),表明疫苗的安全性良好,對(duì)A型菌和C型菌的保護(hù)率均達(dá)到100%,對(duì)A型菌的保護(hù)期是3個(gè)月而對(duì)C型菌的保護(hù)期可長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月,疫苗可以保存10個(gè)月以上;表明疫苗符合《獸藥典》規(guī)定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn).鋁膠雖然作為免疫佐劑被廣泛應(yīng)用,但抗原免疫原性弱時(shí),不能夠很好的提高免疫原性,而且不能介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)[6].所以下一步將篩選更適宜的佐劑,進(jìn)一步提高疫苗的免疫原性.

滅活疫苗的效力檢驗(yàn)以往一直采用本動(dòng)物攻毒法,這種方法成本高,周期長(zhǎng),而且程序復(fù)雜[7].本試驗(yàn)采用"血清中和試驗(yàn)"的檢驗(yàn)技術(shù),進(jìn)行了家兔攻毒與血清抗體效價(jià)的平行試驗(yàn).血清抗體效價(jià)測(cè)定中C型抗體效價(jià)高于A型抗體,免疫攻毒時(shí),疫苗對(duì)C型菌的保護(hù)優(yōu)于A型菌.說明用"血清中和試驗(yàn)"來代替"本動(dòng)物攻毒"的效力檢驗(yàn)技術(shù)可行.這種技術(shù)的應(yīng)用不僅可以節(jié)省成本、縮短周期,而且操作方便,尤其適用于對(duì)多價(jià)疫苗的檢驗(yàn),從而為今后的疫苗檢驗(yàn)奠定基礎(chǔ).

[1]Qiu H,Chen F,Leng X,et al.Toxinotyping of Clostridium per?fringens fecal isolates of reintroduced Père David's deer(Elaphur?us davidianus)in China[J].J Wildl Dis,2014,50(4):942-945.

[2]鐘震宇,張林源,唐寶田.2000-2009年北京南海子麋鹿出血性腸炎發(fā)生特點(diǎn)分析[J].畜牧與獸醫(yī),2013,45(4):56-58.

[3]趙立峰,郭宏偉,任家琰,等.A型產(chǎn)氣莢膜桿菌產(chǎn)毒條件的測(cè)定[J].經(jīng)濟(jì)動(dòng)物學(xué)報(bào),2005,9(2):100-102.

[4]中國(guó)獸藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)獸藥典[S].三部.2010年版.

[5]Belikov S I,Kondratov I G,Potapova U V,et al.The relation?ship between the structure of the tick-borne encephalitis vi?rus strains and their pathogenic properties[J].PLoS One,2014,9 (4):e94946.

[6]Mody K T,Popat A,Mahony D,et al.Mesoporous silica nanopar?ticles as antigen carriers and adjuvants for vaccine delivery[J].Na?noscale,2013,5(12):5167-5179.

[7]曲海波,劉洪斌,白同臣,等.A型產(chǎn)氣莢膜梭菌類毒素疫苗與全菌滅活疫苗的安全性和免疫效力的比較研究[J].中國(guó)獸藥雜志,2010,44(2):15-16.

Preparation and immunity test of two bivalent inactivated vaccineof Clostridium perfringens from deer

LI Zi-qing1,2,ZHAO Li-feng3,LIU Hong1,2
(1.Medical College of Shanxi Datong University,Datong 037009,China; 2.Respiratory and Occupational Disease Research Institute of Shanxi Datong University,Datong 037009,China; 3.The service center for development of aquaculture industry in beechen district in tianjin,Tianjin 300400,China)

To develop a bivalent inactivated vaccine of Clostridium perfringens type A and C from deer,we measured the vac?cine immune efficacy and duration and vaccine storage period.Culture solution of Clostridium perfringens T5-A and J28-C was mixed with 1∶1,and then mixed the bacteria liquid with the disinfectant gel at a ratio of 9∶1.And three batches of inactivated vac?cine 0406-1/0406-2/0406-3 were prepared.After safety inspection"serum neutralization test,vaccine immune efficacy and dura?tion period and vaccine storage period were tested.Vaccine was good safety,and protection rate for Clostridium perfringens type A and C was 100%.The antibody titer of type C was higher than type A,and the vaccine protection for type C strains was up to 6 months,and type A was 3 months.The vaccine could be kept for more than 10 months.The three batches of vaccine have good safe?ty,and a strong immune protection to the rabbits.

Clostridium perfringens;Inactivated vaccine of deer;Preparation;immunity test

LIU Hong

S852.4

A

0529-6005(2016)06-0025-03

2015-09-10

大同市科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(201361)

李自青(1980-),女,講師,碩士,主要從事分子生物學(xué)與腫瘤免疫學(xué)研究,E-mail:liziqing_1234@163.com

劉宏,E-mail:a-liuhong@163.com