郭偉良,王文慧,鄧興旺,胡文婷,謝珍玉,王世鋒,周永燦

(熱帶生物資源可持續(xù)利用省部共建國家重點實驗室培育基地海南大學(xué)海洋學(xué)院,海南?？?70228)

響應(yīng)面法優(yōu)化一種抗無乳鏈球菌中藥復(fù)方的浸提工藝研究

郭偉良,王文慧,鄧興旺,胡文婷,謝珍玉,王世鋒,周永燦

(熱帶生物資源可持續(xù)利用省部共建國家重點實驗室培育基地海南大學(xué)海洋學(xué)院,海南海口570228)

為了確定一種中藥復(fù)方中抗無乳鏈球菌活性成分(ACAS)的最佳浸提工藝,以ACAS浸提得率為指標(biāo),采用單因素和Box-Behnken Design試驗設(shè)計(BBD)結(jié)合響應(yīng)面分析法(RSM)序貫優(yōu)化中藥復(fù)方ACAS浸提工藝.結(jié)果顯示,ACAS最佳浸提工藝為:以80%乙醇水溶液為溶劑,按液料比16.48∶1(mL/g),39℃浸提2 h、浸提2次,在此最優(yōu)條件下進(jìn)行平行4次驗證試驗,ACAS浸提得率可達(dá)4.02%±0.15%,與預(yù)測值4.06%的相對誤差為0.99%,是優(yōu)化前40.2倍.為中藥復(fù)方ACAS純化鑒定、藥理毒理分析等后續(xù)研究奠定了良好基礎(chǔ).

無乳鏈球菌;中藥復(fù)方;響應(yīng)面法;浸提工藝優(yōu)化

無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae,SA)是多種淡海水養(yǎng)殖魚類的重要病原,尤其對羅非魚等溫水性魚類危害嚴(yán)重[1].為防治該病,濫用和亂用抗生素等違禁藥物時有發(fā)生,導(dǎo)致藥物殘留超標(biāo)而嚴(yán)重影響?zhàn)B殖羅非魚產(chǎn)品品質(zhì).中藥因具有多功效、低毒、低殘留、致病菌不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)勢而在水產(chǎn)病害防治中廣泛使用[2].由于中藥活性成分提取常涉及到藥材多組分的多層次溶出,提取過程受多因素交互作用影響[3],僅采用簡單的單因素試驗方法難以精確定位中藥最優(yōu)提取工藝.Box-Behnken Design試驗設(shè)計(BBD)結(jié)合響應(yīng)面分析法(Response Surface Methodology,RSM)是集數(shù)學(xué)、統(tǒng)計學(xué)和計算機(jī)科學(xué)于一體的實驗設(shè)計與優(yōu)化方法,已廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)藥、化工、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域[4].本文在作者前期建立的具有良好抗羅非魚SA活性的馬兜鈴金銀花復(fù)方(Compound of Aristolochic Debilis and Lonicera ja?ponica,CAL)基礎(chǔ)上,采用BBD結(jié)合RSM方法,優(yōu)化CAL中抗SA活性成分(Active Components Against Streptococcus agalactiae,ACAS)浸提工藝,為CAL中活性成分鑒定和防治羅非魚鏈球菌病綠色新藥的研發(fā)奠定基礎(chǔ).

1　材料與方法

1.1試驗材料馬兜鈴與金銀花飲片,購自?？谑袕V安堂藥品超市海甸分店.SA為本實驗室從海南患病羅非魚中分離鑒定和保存的致病菌株.

1.2試驗方法

1.2.1樣品預(yù)處理馬兜鈴和金銀花分別于80℃烘箱中干燥2 h,用高速粉碎機(jī)粉碎后過60目篩,按照等質(zhì)量比混勻而制成粉末CAL,待用.

1.2.2ACAS含量測定參照文獻(xiàn)[5],瓊脂擴(kuò)散法測定ACAS含量標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制.

以水為溶劑,液料比20∶1(mL/g),40℃浸提CAL 3 h,6 000 r/min離心10 min,上清液濃縮40倍作為母液.因ACAS未經(jīng)分離純化,其含量尚未得知,本文假定ACAS的初始浸提得率為0.1%,則母液的ACAS濃度為2.00 mg/mL,ACAS浸提得率計算公式(a):

將母液等梯度稀釋成ACAS濃度范圍為0.04～0.16 mg/mL的7個標(biāo)準(zhǔn)液,瓊脂擴(kuò)散方法測定各標(biāo)準(zhǔn)液的抑菌圈直徑,以ACAS濃度對數(shù)作橫坐標(biāo),抑菌圈直徑作縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.曲線的回歸方程為Y=7.163Lg(X)+12.54,相關(guān)系數(shù)(R2)為0.931.

將樣品液稀釋或濃縮至合適濃度,瓊脂擴(kuò)散法測定其抑菌圈直徑,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算ACAS濃度,按式(a)計算ACAS浸提得率.

1.2.3單因素法優(yōu)化ACAS浸提工藝條件按照母液制備方法浸提ACAS,其他條件不變,分別考察浸提溶劑中乙醇體積分?jǐn)?shù)、浸提次數(shù)、浸提時間、浸提溫度和浸提液料比對ACAS浸提得率的影響,初步優(yōu)化ACAS浸取工藝.

1.2.4BBD結(jié)合RSM方法優(yōu)化ACAS熱水浸提工藝條件在單因素試驗的基礎(chǔ)上,選取浸提時間、溫度和液料比作為考察因素,進(jìn)行3因素3水平的BBD設(shè)計試驗,ACAS浸提得率作為響應(yīng)值,RSM法分析獲得CAL的ACAS浸提工藝最優(yōu)條件.在最優(yōu)條件下進(jìn)行4次平行驗證試驗.

表1　浸提次數(shù)對ACAS浸提得率的影響

2　結(jié)果與分析

2.1單因素法優(yōu)化CAL的ACAS浸提工藝采用單因素法優(yōu)化CAL的ACAS浸提工藝.浸提溶劑中乙醇體積分?jǐn)?shù)優(yōu)化見圖1:當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時 ACAS浸提得率達(dá)到最大,低于40%或高于80%ACAS浸提得率急劇下降.根據(jù)相似相溶原理推測ACAS的主要成分極性接近80%乙醇水溶液.采用80%的乙醇水溶液作為溶劑浸提3次,每次浸提ACAS得率見表1:第3次浸提濃縮10倍,瓊脂擴(kuò)散法仍未能檢出ACAS,為此選擇浸提次數(shù)為2次.浸提時間的優(yōu)化見圖2:浸提時間為2 h時ACAS浸提得率最高,延長至3 h時,ACAS浸提得率大幅下降,說明浸提2～ 3 h間可能ACAS某些不穩(wěn)定成分分解,或有ACAS拮抗成分浸出,使部分ACAS活性受抑制.浸提溫度的優(yōu)化見圖3:在30℃～50℃區(qū)間ACAS浸提得率穩(wěn)定于較高的狀態(tài),高于50℃ACAS浸提得率迅速下降,說明ACAS中含有熱不穩(wěn)定性組分.浸提液料的優(yōu)化見圖4:液料比為20∶1時ACAS浸提得率最高,大于20∶1,ACAS浸提得率與液料比呈負(fù)相關(guān),這可能是由于加大液料比增加ACAS拮抗成分溶出,降低浸提液的抗SA的活性.

圖1　浸提溶劑對ACAS浸提得率的影響

圖2　浸提時間對ACAS浸提得率的影響

2.2BBD結(jié)合RSM法優(yōu)化ACAS提取工藝通過單因素試驗結(jié)果分析,選擇浸提時間2 h、溫度40℃和液料比20∶1為中心點,進(jìn)行3因素3水平BBD設(shè)計試驗,試驗因素水平設(shè)計見表2,結(jié)果列于表3,以ACAS浸提得率為響應(yīng)值,采用SAS 8.02軟件進(jìn)行RSM擬合分析,獲得多元二次回歸模型為:Y=4.0126+0.002X1-0.1541X2-0.2340X3-0.0223X1X2-0.1178X2X3-0.07588X1X3-0.2063-0.6154-0.3248(b).

圖3　浸提溫度對ACAS浸提得率的影響

圖4　液料比對ACAS浸提得率的影響

表2　響應(yīng)面試驗因素水平表

表3　響應(yīng)面試驗設(shè)計方案及結(jié)果

表4　響應(yīng)面試驗方差分析

回歸模型的相關(guān)系數(shù)(R2)為0.9851,表明回歸模型擬合度較好.其顯著性分析結(jié)果(pr>F值= 0.005)表明模型顯著可靠.采用t檢驗方法對模型各項進(jìn)行顯著性分析且繪制兩兩因素之間的響應(yīng)曲面圖.顯著性分析結(jié)果見表4:浸提溫度(X2)、液料比(X3)及3個考察因素的平方項對響應(yīng)值有著極顯著的影響,而浸提溫度和液料比(X2X3)之間存在著顯著的交互作用.兩兩因素之間的響應(yīng)曲面見圖5-圖7:圖5和圖7中浸提時間(X1)截面拋物線跨度較小,說明其在考察區(qū)內(nèi)對響應(yīng)值的影響不顯著;圖6中的浸提溫度(X2)和浸提液料比(X3)的截面拋物曲線跨度大,斜面較陡,表明浸提溫度和浸提液料比在考察區(qū)內(nèi)對響應(yīng)值的影響顯著.圖5和圖7的等高線近似于正圓型,表明浸提時間與浸提溫度(X1X2)、浸提時間與浸提液料比(X1X3)它們之間影響不顯著;圖6中等高線呈橢圓形,且橢圓長短軸與XY正交坐標(biāo)軸有一定角度,表明X2和X3之間有著較為顯著的交互作用.

圖5　Y=f(X1,X2)的響應(yīng)面圖和等高線圖

采用單因素和BBD結(jié)合RSM序貫優(yōu)化獲得中藥復(fù)方ACAS最優(yōu)浸提工藝:提取溶劑的乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%、浸提2次、浸提時間2 h、溫度39℃和液料比16.48∶1(mL/g),模型預(yù)測的ACAS最高浸提得率為4.06%,4次平行驗證試驗的平均ACAS浸提得率為4.02%±0.15%,與預(yù)測值的相對誤差為0.99%,表明所建模型準(zhǔn)確可靠.ACAS浸提得率比優(yōu)化前提高40.2倍.

圖6　Y=f(X2,X3)的響應(yīng)面圖和等高線圖

圖7　Y=f(X1,X3)的響應(yīng)面圖和等高線圖

3　討論

中草藥具有低毒、低污染、低成本、多組分協(xié)同作用不易引起耐藥和多功效等優(yōu)勢,在水產(chǎn)養(yǎng)殖動物病害防治研究與應(yīng)用中潛力巨大.然而中草藥在水產(chǎn)中應(yīng)用多數(shù)是借鑒或沿用人用或禽畜用藥經(jīng)驗,針對性不強,急需加強針對水產(chǎn)養(yǎng)殖動物病原的中草藥篩選及其活性成分分離純化鑒定、藥理和毒理等一系列基礎(chǔ)研究[6].

本文所用的中藥復(fù)方包含金銀花和馬兜鈴兩味中草藥,瓊脂擴(kuò)散法研究表明,兩者具有協(xié)同抗SA的活性.其中,金銀花具有抗菌消炎、清熱解毒、抗病毒及免疫調(diào)節(jié)等功能.其主要抗菌活性成分有綠原酸等有機(jī)酸類、木犀草素等黃酮類、β-谷甾醇等甾醇類及揮發(fā)油等[7].馬兜鈴具有抗菌、抗腫瘤和抗炎等作用,其主要抗菌活性成分為揮發(fā)油和馬兜鈴酸等[8].由于馬兜鈴酸具有較強的腎毒性和致畸等副作用,本文作者采用瓊脂擴(kuò)散法考察馬兜鈴酸標(biāo)準(zhǔn)品對SA的抑制效果,結(jié)果顯示,馬兜鈴酸無抗SA活性,說明馬兜鈴中抗SA活性物質(zhì)可能是其揮發(fā)油成分.

中草藥常以多組分多靶點協(xié)同抗菌,提取過程涉及多組分多層次的溶出,有些組分會發(fā)生物理或化學(xué)變化,影響活性.需尋找合適的優(yōu)化方法精確提高中藥活性成分提取得率.本研究以ACAS浸提得率為響應(yīng)值進(jìn)行CAL提取工藝的優(yōu)化,最大限度地保留ACAS成分,降低非優(yōu)化目標(biāo)成分含量,提高活性,降低毒性.BBD以考察因素組成多維空間的中心點和因素邊界的中點為試驗點,各試驗點連接形成球面或近似球面,適于以多元二次回歸模型(RSM)來逼近響應(yīng)值[9],可精確描述因素與響應(yīng)值之間的全局函數(shù)關(guān)系,快速有效確定多因素系統(tǒng)的最優(yōu)條件.BBD與RSM結(jié)合也能很好的描述提取因素與活性成分提取得率的函數(shù)關(guān)系,精確獲得中藥多活性成分體系的最優(yōu)提取條件[10-12].本文在單因素試驗基礎(chǔ)上,以BBD結(jié)合RSM法獲得了CAL中ACAS的優(yōu)化浸提工藝,并確定了浸提因素之間、浸提因素與響應(yīng)值之間的影響關(guān)系.最優(yōu)浸提條件下ACAS浸提得率實測值與模型預(yù)測值相對誤差僅為0.99%,表明所建模型準(zhǔn)確可靠.本研究結(jié)果為中藥復(fù)方活性成分的分離及CAL在防治羅非魚SA病上的安全高效應(yīng)用奠定了基礎(chǔ).

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Optimizing theextraction procession of activecomponents againstStreptococcus agalactiaefrom Chineseherbal compound using Responsesurfacemethodology

GUO Wei-liang,WANG Wen-hui,DENG Xing-wang,HU Wen-ting,XIE Zhen-yu,WANG Shi-feng,ZHOU Yong-can
(State Key Laboratory Breeding Base for Sustainable Exploitation of Tropical Bio-resources College of Marine science,Hainan University,Haikou 570228,China)

To optimize the extraction process of the active components against Streptococcus agalactiae(ACAS)from the Chi?nese herbal compound,Single-factor experiments and the combination of Box-Behnken Design(BBD)and response surface analy?sis(RSM)were sequentially applied with ACAS extraction rate as the criterion.Results showed that the optimum ACAS extraction process was as follows:the extracting solvent was 80%ethanol water solution,extracting times was twice,extraction time was 2 h,extraction temperature was 39℃and the ratio of liquid to material was 16.48:1(mL/g).The verification experiments in 4 parallels with the optimum extraction conditions were carried out and the ACAS extraction rate reached 4.02±0.15%,which was 40.2 times of the value before optimization.The relative error between the predictive and actual values was 0.99%.Our data make the basis for ACAS further study such as purification,identification,pharmacology,toxicology,and so on.

Streptococcus agalactiae;Chinese herbal Compound;Response Surface Methodology;Optimization of the ex?traction procession

ZHOU Yong-can

S943

A

0529-6005(2016)06-0107-04

2015-03-23

高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金(20124601110-006);農(nóng)業(yè)部漁用藥物創(chuàng)制重點實驗室開放課題(201408);海南省重大科技項目(ZDZX2013009);海南省產(chǎn)學(xué)研一體化專項資金項目(CXY20130058);海南自然科學(xué)基金(20153050)和海南大學(xué)地方服務(wù)項目共同資助

郭偉良(1983-),男,講師,博士,研究方向為中草藥在水產(chǎn)養(yǎng)殖病害中的應(yīng)用研究,E-mail:guowl07@mails.jlu.edu.cn

周永燦,E-mail:zychnu@163.com