畢　磊，張煜涵，劉　暢，黃大鵬，路義鑫

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

牛貝諾孢子蟲病研究進展

畢磊，張煜涵，劉暢，黃大鵬，路義鑫

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

牛貝諾孢子蟲病又稱牛球孢子蟲病，是由貝氏貝諾孢子蟲（Besnoitia besnoiti）引起的一種急性、亞急性和慢性感染的牛原蟲性寄生蟲病。

貝諾孢子蟲最早是由Cadeac（1884）在法國南部牛群中發(fā)現(xiàn)的，近些年，歐洲的法國和西班牙地區(qū)都有大規(guī)模的牛貝諾孢子蟲病暴發(fā)。德國、意大利和東歐中部地區(qū)均報道了此病的流行［1］，給世界各地的養(yǎng)牛業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失。歐洲食品安全組織（EFSA）已經(jīng)認定貝諾孢子蟲病為重現(xiàn)疾病，并且在歐洲地方性流行［2］。國內(nèi)最早是由劉爾翔于1957年在北京某屠宰場發(fā)病黃牛病變皮膚中發(fā)現(xiàn)并鑒定為貝諾孢子蟲。

近年來，隨著牛貝諾孢子蟲病的廣泛流行，國內(nèi)外對于本病進行了更深入的研究，其進展綜述如下。

1　病原體

1.1種屬及其生物特性貝諾孢子蟲屬頂復(fù)門、孢子蟲綱、真球蟲目、肉孢子蟲科、住肉孢子蟲亞科、貝諾孢子蟲屬。目前的數(shù)據(jù)顯示，貝諾孢子蟲屬的貝諾孢子蟲還未發(fā)現(xiàn)對人有感染性?，F(xiàn)今至少有10種貝諾孢子蟲在世界范圍內(nèi)被確定，大多數(shù)報道來自有袋動物和微型哺乳動物，包囊分布于體內(nèi)，位置多在腸系膜，并且貓已被確認為多個種的終末宿主。相反，對皮膚高度趨化的有寄生于馬屬動物的B.bennetti，寄生于鹿科的B.tarandii和寄生于牛的B.besnoiti。B.oryctofelisi、B.neotomofelis和B.darling已在美洲大陸的嚙齒動物和兔類體內(nèi)發(fā)現(xiàn)確認，并表現(xiàn)明顯特征，已經(jīng)確定它們的終末宿主為貓［3］。B. tarandii和B.bennetti僅出現(xiàn)在歐洲和美洲各地，B. besnoiti流行于南非、以色列，以及歐洲和亞洲不同國家，寄生于山羊的B.caprae發(fā)生于伊朗和肯尼亞。到目前為止，這4個種各自的傳播方式和終末宿主還未確定，因此無法確認它們的有性生殖是否發(fā)生，如何發(fā)生。有人懷疑貝諾孢子蟲和弓形蟲相似，在中間宿主體內(nèi)僅有無性生殖，于終末宿主內(nèi)出現(xiàn)有性生殖，但難以確認。研究者試圖用貝氏貝諾孢子蟲包囊感染貓，僅有一個報道用疑似感染貝氏貝諾孢子蟲的牛組織喂給貓后成功感染貓。但是有人在1976年、1989年分別進行過同樣的實驗均未能得到滿意的實驗結(jié)果。并且有人用組織包囊喂給貓同樣未能成功感染。現(xiàn)已確認的貝諾孢子蟲還有寄生于嚙齒動物的B.jellisoni、寄生于倉鼠的B.wallacei和在巴西發(fā)現(xiàn)的寄生于鼠的B.akodoni。

現(xiàn)今對貝諾孢子蟲屬所有的系統(tǒng)分析都基于對ITS1基因序列的利用。雖然未能破解全序列信息，但已經(jīng)可以利用ITS1證明貝諾孢子蟲的種屬特異性。對ITS1的研究結(jié)果已經(jīng)被用于種的區(qū)分。并且ITS1轉(zhuǎn)錄區(qū)間在很多種類表現(xiàn)出高度保守性，各種間的ITS1轉(zhuǎn)錄區(qū)可能與各自的地域起源關(guān)系不大，而是與各自中間宿主的性質(zhì)相關(guān)。

據(jù)Nobel報道，貝氏貝諾孢子蟲對牛的生殖器官有一定的趨向性，這可能是引起公牛不育、母牛不孕的原因。有人嘗試接種兔，發(fā)現(xiàn)貝諾孢子蟲對兔有高度致死性，但經(jīng)多次傳代后可減弱毒性。Pols曾使得貝諾孢子蟲在兔體內(nèi)成功傳了19代。證明在兔體內(nèi)傳代是可以實現(xiàn)的，兔可以作為實驗動物。還有學(xué)者將貝諾孢子蟲感染金黃地鼠、海豬、小白鼠和美利奴綿羊，同時進行系統(tǒng)觀察，最終在其體內(nèi)發(fā)現(xiàn)蟲體，并表現(xiàn)出比感染牛、羊等大型動物嚴重的急性癥狀，這可能與接種動物個體較小，蟲體密度大及小型動物耐受性低等因素有關(guān)。

1.2寄生部位及形態(tài)特征牛體內(nèi)寄生的為貝氏貝諾孢子蟲，寄生于中間宿主體內(nèi)的形式為包囊和速殖子，這點與弓形蟲相同。其包囊可寄生于病畜的皮膚及皮下疏松結(jié)締組織、鞏膜、筋膜、鼻腔黏膜、舌、咽、陰道及內(nèi)臟等許多部位。發(fā)熱期速殖子出現(xiàn)在血液中，并且可在肺、睪丸、淋巴結(jié)發(fā)現(xiàn)。

包囊為球形，色灰白，呈細砂粒樣，一般呈散在分布，肉眼則能識別。包囊直徑約為200～600 μm不等，其大小隨寄生部位的不同差異很大。包囊囊壁由宿主組織所形成，具有很厚的富有彈性的透明化均質(zhì)膠原纖維層外膜，目前認為外膜完全由宿主細胞的生理反應(yīng)形成的［4］；內(nèi)層膜較薄。由于這種雙層的囊壁，使貝諾孢子蟲明顯區(qū)別于頂復(fù)門其他寄生蟲。且包囊內(nèi)含有胞漿，胞漿內(nèi)含有大量緩殖子，通常一端稍尖，一端鈍圓，其大小為2～5×6～12 μm，呈香蕉形，新月形或梨形。在急性病牛的血涂片中有時可見速殖子，其形態(tài)與緩殖子相似，大小為6～7.5×2.5～3.9 μm。在光學(xué)顯微鏡下，貝諾孢子蟲的速殖子與新孢子蟲、弓形蟲的速殖子無法區(qū)分。有研究者用貝諾孢子蟲速殖子感染Vero細胞［5］，最終確定其復(fù)制的方式為孢內(nèi)生殖，且復(fù)制的速率取決于細胞系，目前報道的最好的復(fù)制速率來源于BHK21細胞（幼年敘利亞地鼠腎細胞）的每小時感染6～20個速殖子。

2　生活史及傳播方式

目前僅有個別蟲種貝諾孢子蟲的生活史較為清楚，但對如貝氏貝諾孢子蟲等流行性較高的蟲種，其生活史尚不清楚，有人認為其生活史與弓形蟲相似，帶有蟲體的組織被貓食入后，于腸上皮細胞固有層內(nèi)進行裂殖生殖和配子生殖，產(chǎn)生類似等胞球蟲的卵囊，隨后排出體外，被宿主吞食。進入宿主體內(nèi)破裂釋放速殖子，速殖子侵入血液，引起相應(yīng)癥狀并隨血液到達身體各處，最終于組織內(nèi)形成包囊并轉(zhuǎn)變?yōu)榫徶匙印?/p>

模仿接種弓形蟲的方法，從貓體內(nèi)分離的包囊通過口腔感染牛，到目前為止還未獲得成功的報道。然而現(xiàn)已證明貝諾孢子蟲可通過吸血昆蟲進行機械傳播。因此繞過了有性生殖和無性生殖，同時也解釋了為何呈季節(jié)性流行。通過機械傳播的方式使貝諾孢子蟲可以隨意感染各地的牛，使其流行于世界各地，這也解釋了為何貝諾孢子蟲的生活史至今未被確定。有研究者從牛的淚液中發(fā)現(xiàn)速殖子，這表明貝諾孢子蟲可以通過不吸血的蠅類或一些吸食眼淚的昆蟲傳播［6］。

3　臨床癥狀

貝氏貝諾孢子蟲的感染臨床表現(xiàn)為急性期和慢性期，急性期發(fā)生于感染后的11～13 d，持續(xù)6～10 d。慢性期則持續(xù)整個急性期的恢復(fù)階段，并可以延續(xù)一生。

急性期發(fā)生速殖子的快速擴散，速殖子的擴散發(fā)生于血管內(nèi)的巨噬細胞、內(nèi)皮細胞和纖維母細胞，導(dǎo)致血管的相應(yīng)病癥，如血管阻塞及炎癥，常發(fā)生于毛細血管和小靜脈、皮下組織、筋膜、睪丸和上呼吸道黏膜。急性期臨床表現(xiàn)為高熱、呼吸障礙、心率加快、食欲不振、產(chǎn)奶量下降，常伴隨淺表淋巴結(jié)慢性細胞性淋巴結(jié)炎、皮膚水腫、公牛急性睪丸炎等，并且由于呼吸困難易導(dǎo)致上呼吸道黏膜炎。急性期不一定會導(dǎo)致動物死亡，但這個過程會導(dǎo)致動物身體狀況嚴重下降。

急性期持續(xù)1～2周后，水腫減弱，進入慢性期。慢性期包囊略有增大，同時緩殖子數(shù)量增多，有的緩殖子可以在包囊內(nèi)存活數(shù)年，并隨包囊一起寄生于皮膚、皮下組織、肌間筋膜。慢性期會導(dǎo)致動物間歇發(fā)熱，厭食，同時伴有皮膚病變，如不同程度的脫毛，皮膚顯著增厚、硬化、龜裂、出現(xiàn)褶皺，流出漿液性血樣液體，嚴重者呈象皮樣變性。皮膚病變主要發(fā)生于病畜的頸部、肩部。病變皮膚和脫毛將永久性伴隨患畜，表現(xiàn)為不可逆性。皮膚病變偶發(fā)于四肢，導(dǎo)致行動困難和疼痛。公牛陰囊腫大，睪丸實質(zhì)和輸精管被大量包囊阻塞，導(dǎo)致不育。也會導(dǎo)致懷孕母牛流產(chǎn)，嚴重感染的母?？赡苡谰眯圆辉?。除表現(xiàn)顯著特征的皮膚病變外，一些小的包囊肉眼可見于鞏膜和雌性外陰道，這一特征在臨床診斷方面有重要意義。

現(xiàn)如今，雖然牛貝諾孢子蟲的很多特性已被破解，但是在臨床方面用于確診的臨床特征難以確定，經(jīng)常會被誤診為牛瘟、疥瘡、真菌感染等。并且很多病畜呈不同程度的隱性感染，鞏膜等處無明顯包囊，給確診該病帶來困難。

4　診斷方法

患病動物皮膚，眼鞏膜或陰道出現(xiàn)包囊時，結(jié)合脫毛、皮膚增厚、結(jié)痂等癥狀可作出初步診斷，但易造成誤診，仍需實驗室診斷才能最終確診。

對于表現(xiàn)出明顯病理變化的患病動物可采取組織病理學(xué)方法，在病變皮膚處通過穿刺的方式取樣或直接采集鞏膜的結(jié)節(jié)做壓片或切片，通過TEM觀察到包囊及緩殖子均可確診。對于一些體表病變較輕的患病動物，應(yīng)采用PCR方法檢測貝諾孢子蟲DNA。盡管存在檢測隱性感染可能呈陰性的局限性，PCR在未發(fā)現(xiàn)貝諾孢子蟲抗體的情況下仍作為檢測病牛血液中速殖子的合適方法［7］。

由于多數(shù)患病動物呈隱性感染，為更準確地對貝諾孢子蟲進行診斷，血清學(xué)診斷方法取得了很大成果。檢測患病動物血清中是否存在抗體是很好的檢測方法。王祥生曾用病牛病變皮膚分離的蟲體包囊內(nèi)的緩殖子制備抗原，并成功接種于牛，血凝抗體于接種后10 d出現(xiàn)陽性反應(yīng)，比臨床癥狀早出現(xiàn)40～50 d，肯定了抗原在貝諾孢子蟲診斷中的可靠性。

IHA和CFT是診斷貝諾孢子蟲有效的血清學(xué)方法，具有陽性符合率較高的特點，并且方法簡便易行，可現(xiàn)場應(yīng)用。尤其IHA，更適用于患畜的早期診斷。國內(nèi)研究者王祥生、胡力生等多次采用IHA檢測貝諾孢子蟲，均起到很好的檢測效果。IFAT被認為是血清學(xué)檢測的黃金標準，在對隱性感染的檢測時能取得良好效果，但應(yīng)注意避免交叉反應(yīng)。Western Blot也可以用于其檢測，目前應(yīng)用Western Blot進行檢測時常與牛新孢子蟲等原蟲病發(fā)生交叉反應(yīng)，但Western Blot已被確立為其他方法的驗證試驗方法［8］。姜言輔曾應(yīng)用ELISA進行檢測，陽性檢出率明顯高于鞏膜檢查結(jié)果。據(jù)報道，現(xiàn)已有用于檢測貝諾孢子蟲的ELISA試劑盒。也有研究稱，血清學(xué)檢測對于隱性感染的靈敏性不高，這可能與檢測季節(jié)昆蟲的活躍度有關(guān)，昆蟲較少或無昆蟲的季節(jié)，各種檢測方法的結(jié)果均偏低。

5　治療與預(yù)防

貝諾孢子蟲和弓形蟲同屬球蟲目內(nèi)雙芽球蟲亞目，形態(tài)結(jié)構(gòu)比較相似。然而，在治療方面，對弓形蟲病有效的藥物還沒有一種能對貝諾孢子蟲起作用。最早有人采用靜脈注射30 mL濃度為1%福爾馬林進行治療，但由于伴隨明顯的不良反應(yīng)而被棄用。Pols早在1960年就曾在接種貝諾孢子蟲的兔身上嘗試過噴他脒、金霉素、福爾馬林、等藥物，均未能成功達到良好的抑制或治療效果。柳春華等曾驗證丙硫咪唑和氯苯胍口服對急性病牛治愈率很高；吡喹酮和甲醛液對慢性病牛有一定的治療作用，但不能根治。劉學(xué)敏等也曾進行過藥物治療試驗，同樣證明吡喹酮能殺死患牛體內(nèi)大部分蟲體，但以四肢為代表的遠端筋膜、跟腱處仍有蟲體殘留。韓國應(yīng)用1%銻制劑對人工接種牛源貝諾孢子蟲的山羊進行治療，結(jié)果取得滿意效果。也有學(xué)者表示，氫化可的松和那嘎寧均可對貝諾孢子蟲病起到一定治療或緩解作用，由于實驗動物較少，其準確性有待確定。

近年來，有研究者先后利用Vero細胞應(yīng)用一些藥物及其衍生物，能夠?qū)崿F(xiàn)對貝諾孢子蟲速殖子增殖的抑制作用，有的藥物甚至能引起嚴重的超微結(jié)構(gòu)改變，并獲得相比于有毒的硝基化合物更安全的效果，但是相應(yīng)的研究尚未在動物身上進行。

Niagi［9］通過速殖子免疫的小鼠制備單克隆抗體，能夠在貝諾孢子蟲速殖子侵入單層細胞時表現(xiàn)明顯的抑制作用，而后續(xù)研究尚未報道。最新的研究表示能夠在貝諾孢子蟲速殖子、緩殖子分別表達的抗原已被確定，這對后續(xù)的研究具有重大作用。目前可用于貝諾孢子蟲分子水平的研究成果不多，并且缺少好的實驗動物模型，所以貝諾孢子蟲基因組及轉(zhuǎn)錄組的測序是在分子水平上進行系統(tǒng)分析研究的必然基礎(chǔ)。

目前，本病的治療尚處于探索階段，因此，預(yù)防工作倍顯重要。在一些貝諾孢子蟲呈地方性流行的農(nóng)場，病死的牛經(jīng)焚燒、深埋等方式小心處理，從而消除傳染源。可全年對牛群進行臨床檢查，以便及早發(fā)現(xiàn)處理病畜。同時，由于吸血昆蟲和貓與本病傳播有關(guān)，應(yīng)采用合理的方法進行控制，可采用1%氯仿控制吸血昆蟲。

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S852.72+3

A

0529-6005（2016）09-0066-03

2015-07-14

畢磊（1991-）、，男，碩士，從事貝諾孢子蟲流行病學(xué)研究，E-mail：821165034@qq.com

路義鑫，E-mail：Luyixin@neau.edu.cn