張元峰　孫瑞迅　董孟寧　孫保朝

(南陽市中心醫(yī)院神經(jīng)外科，河南　南陽　473000)

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人腦膠質(zhì)瘤組織中高遷移率族蛋白B1的表達(dá)及其與病理分級的關(guān)系

張元峰孫瑞迅董孟寧孫保朝1

(南陽市中心醫(yī)院神經(jīng)外科，河南南陽473000)

目的探討人腦膠質(zhì)瘤組織中高遷移率族蛋白(HMG)B1的表達(dá)及其與病理分級的關(guān)系。方法選取外科手術(shù)治療后經(jīng)病理證實(shí)的腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本80例為研究組，另外選擇同期25例行開顱減壓手術(shù)的腦外傷患者的正常腦組織為對照組。采用RT-PCR法和免疫組化法檢測人腦膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織中的HMGB1表達(dá)，分析表達(dá)差異性與病理級別的關(guān)系。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組HMGB1基因表達(dá)量(25.371±2.837)明顯高于對照組(6.074±3.309)(P<0.05)；HMGB1蛋白陽性表達(dá)率為75.00%，高于正常腦組織中的20.00%(P<0.05)；在病理分級中，實(shí)驗(yàn)組的Ⅲ～Ⅳ級膠質(zhì)瘤組HMGB1 mRNA表達(dá)量(29.835±3.942)顯著高于Ⅰ～Ⅱ級(21.332±2.253)(P<0.05)，Ⅲ～Ⅳ級膠質(zhì)瘤組HMGB1蛋白陽性表達(dá)率(76.92%)高于Ⅰ～Ⅱ級(70.73%)(P<0.05)。結(jié)論HMGB1在人腦膠質(zhì)瘤的臨床治療中具有重要指導(dǎo)意義。

膠質(zhì)瘤；高遷移率族蛋白(HMG)B1

膠質(zhì)瘤多發(fā)于成年男性，主要表現(xiàn)為腦神經(jīng)功能受損及顱內(nèi)壓升高，不同類型膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展規(guī)律不同，給臨床治療造成很大的障礙〔1，2〕。目前臨床上主要通過外科手術(shù)、放療及化療治療腦膠質(zhì)瘤，但是膠質(zhì)瘤發(fā)病急，病情進(jìn)展迅速，具有免疫逃避功能，與正常腦組織基本無異，即使經(jīng)過長時間的治療，復(fù)發(fā)率依然居高不下，患者的5年生存率不足20%〔3〕。高遷移率族蛋白(HMG)B1主要存在于真核生物細(xì)胞內(nèi)，是一種分布于腦、心、肝、脾及淋巴組織的非組蛋白染色體結(jié)合蛋白，參與包括基因轉(zhuǎn)錄、DNA修復(fù)等生物學(xué)過程〔4〕。有研究表明 HMGB1的表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移和血管生成等生物學(xué)行為聯(lián)系緊密〔5〕。本研究探索人腦膠質(zhì)瘤組織中HMGB1的表達(dá)及其與病理分級的關(guān)系。

1　對象與方法

1.1標(biāo)本來源選取2013年5月至2015年4月我院外科手術(shù)治療后經(jīng)病理證實(shí)的腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本80例作為研究組，所有病例均為首次發(fā)病且接受手術(shù)治療，術(shù)前未進(jìn)行化療、放療及其他治療，患者未患其他重大疾病，臨床資料完整。男45例，女35例；年齡42～71歲，平均(55.85±23.85)歲；病程2～8年，平均(4.87±3.13)年；根據(jù)WHO在2007年制定的神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的分類和分級標(biāo)準(zhǔn)〔6〕：低級別膠質(zhì)瘤(LGG)(Ⅰ、Ⅱ級)41例，其中室管膜瘤12例，毛細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤8例，少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤8例，彌漫型星形細(xì)胞瘤13例；高級別膠質(zhì)瘤(HGG)(Ⅲ、Ⅳ級)39例，其中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤9例，間變形室管膜瘤7例，間變形星形細(xì)胞瘤10例，髓母細(xì)胞瘤5例，惡性少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤8例。選擇同期25例我院神經(jīng)外科行開顱減壓手術(shù)的腦外傷患者的正常腦組織作為對照組，男15例，女10例；年齡37～75歲，平均(55.47±5.18)歲。兩組患者的性別及年齡無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，具有可比性。所有樣本取出后立即置入液氮罐保存，試驗(yàn)過程經(jīng)倫理委員會通過，所有患者均簽署知情同意書。

1.2試劑及儀器

1.2.1RT-PCR采用總RNA快速抽提試劑盒提取總RNA，購自天根生化科技有限公司；cDNA合成采用cDNA合成試劑盒，購自MBI Ferments；應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測HMGB1的表達(dá)，試劑盒購自Shino-Test Corporation；Taq DNA聚合酶、d-NTP、10倍緩沖液、25 mmol/L MgCl2購自天根生化科技有限公司；HMGB1和GAPDH引物及Taq Man探針序列由天根生化科技有限公司設(shè)計；德國SPECTRO公司的紫外分光光度計，澳大利亞Kyratec公司的熒光定量PCR及美國Beckman公司的高速離心機(jī)。

1.2.2免疫組化HMGB1單克隆抗體購自美國sigma公司，二抗試劑盒及DAB顯色試劑盒購自上海拜沃生物科技有限公司，熒光顯微鏡由日本Nikon公司提供。

1.3方法

1.3.1RT-PCR(1)提取總RNA和反轉(zhuǎn)錄合成cDNA：嚴(yán)格按照說明書的要求進(jìn)行操作，使用紫外分光光度計檢測RNA 濃度。(2)實(shí)時定量 PCR 檢測：采用天根生化科技有限公司設(shè)計的HMGB1和GAPDH引物及Taq Man 探針序列。第一階段95℃預(yù)變性5 min；第二階段95℃變性5 s，60℃退火延伸15 s，循環(huán)30次；最后40℃終止30 s。每一份標(biāo)本的HMGB1基因表達(dá)量=HMGB1拷貝數(shù)/GAPDH拷貝數(shù)。

1.3.2免疫組化(1)將標(biāo)本進(jìn)行預(yù)處理后置于載玻片上，加入單克隆抗體后4℃過夜，使用PBS清洗2次，加入二抗，室溫孵育30 min。滴加過氧化物酶標(biāo)記，室溫孵育15 min。(2)使用DAB進(jìn)行顯色，使用清水沖洗兩次，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。陰性對照使用空白PBS液體。(3)在視野范圍內(nèi)觀察切片免疫反應(yīng)強(qiáng)的區(qū)域，在高倍鏡(400倍)下觀察5個不重復(fù)視野，統(tǒng)計HMGB1陽性細(xì)胞數(shù)目，取平均值。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：染色結(jié)果細(xì)胞核呈藍(lán)色，陽性表達(dá)為黃色或黃棕色。陰性：無陽性細(xì)胞或陽性細(xì)胞數(shù)≤5%；陽性：陽性細(xì)胞數(shù)<5%。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS16.0軟件行t或χ2檢驗(yàn)。

2　結(jié)　果

2.1HMGB1基因的表達(dá)比較實(shí)驗(yàn)組HMGB1基因表達(dá)量(25.371±2.837)明顯高于對照組(6.074±3.309)(P<0.05)；Ⅲ～Ⅳ級膠質(zhì)瘤組織HMGB1 mRNA表達(dá)量(29.835±3.942)明顯高于Ⅰ～Ⅱ級膠質(zhì)瘤組織(21.332±2.253)(P<0.05)。

2.2HMGB1蛋白免疫組化結(jié)果比較膠質(zhì)瘤組織中的HMGB1陽性表達(dá)率為75.00%(60/80)，明顯高于正常組織中的20.00%(5/25)(P<0.01)；在病理分級中，Ⅲ～Ⅳ級膠質(zhì)瘤組織陽性表達(dá)率〔76.92%(31/39)〕顯著高于Ⅰ～Ⅱ級的70.73%(29/41)(P<0.05)。

3　討　論

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見且發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤，臨床治療效果不顯著，預(yù)后差。主要是由于膠質(zhì)瘤生長迅速，快速侵入周圍組織間隙、淋巴管及血管，破壞周圍正常組織，與鄰近正常組織無明顯界限，通過手術(shù)難以徹底切除，易復(fù)發(fā)〔7，8〕。HMGB1具有較小的分子質(zhì)量(<30 kD)和很高的電泳遷移率。人HMGB1基因在染色體13q12區(qū)域，可以編碼219個氨基酸，主要分為三個功能區(qū)：A區(qū)和B區(qū)主要為賴氨酸，其N-末端富含帶正電荷；C區(qū)主要為天冬氨酸和谷氨酸，其C-末端富含帶負(fù)電荷〔9〕。HMGB1可以通過影響起始復(fù)合物的形成增強(qiáng)基因的表達(dá)，同時可以通過影響增強(qiáng)體的形成調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄過程；另外，HMGB1可造成啟動子和增強(qiáng)子的增強(qiáng)體的結(jié)合位點(diǎn)上DNA序列發(fā)生變化，促進(jìn)其他轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合〔4〕。本研究中，膠質(zhì)瘤組織中HMGB1基因和蛋白表達(dá)明顯升高，說明其在膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，外國學(xué)者研究證實(shí)HMGB1在腫瘤晚期的表達(dá)率為80%，高于其在腫瘤早期的表達(dá)率〔10〕，這與我們發(fā)現(xiàn)的病理分級對表達(dá)的影響也有相同的地方。HMGB1參與腫瘤發(fā)生的機(jī)制目前還不是很明確，眾多研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)其可能是通過調(diào)節(jié)基因的表達(dá)從而發(fā)生腫瘤表型〔11〕，或者HMGB1可以使腫瘤表型的細(xì)胞躲避凋亡，激活JAK/STAT途徑，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞過度增殖〔12〕。Bassi等〔13〕發(fā)現(xiàn)HMGB1可以激活RAGE，表明膠質(zhì)瘤中存在HMGB1/RAGE信號通路，HMGB1可以通過與RAGE結(jié)合，上調(diào)RAGE的表達(dá)，從而導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)降解，使腫瘤出現(xiàn)浸潤和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。此外，HMGB1還可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)小血管再生，促進(jìn)腫瘤不斷增大〔14〕。

1姜方帥.HMGB1、NF-κB及TNF-α在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及臨床意義〔D〕.長沙：中南大學(xué)，2014.

2Gass D，Dewire M，Chow L，etal.Pediatric tectal plate gliomas：a review of clinical outcomes，endocrinopathies，and neuropsychological sequelae〔J〕.J Eurooncol，2015；122 (1)：169-77.

3郭兆剛.siRNA法下調(diào)PRL-3對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞SHG-44生長周期的影響〔D〕.沈陽：中國醫(yī)科大學(xué)，2014.

4Ito H，F(xiàn)ujita K，Tagawa K，etal.HMGB1 facilitates repair of mitochondrial DNA damage and extends the lifespan of mutant ataxin-1 knock-in mice〔J〕.EMBO Mol Med，2014；7(1)：78-101.

5張志軍，彭傳會，周琳，等.高遷移率族蛋白B-1的腫瘤生物學(xué)效應(yīng)研究進(jìn)展〔J〕.中華外科雜志，2012；50(3)：274-7.

6陸新宇，陸培松，李巧玉，等.人腦膠質(zhì)瘤中神經(jīng)生長因子表達(dá)與組織病理分級及預(yù)后的關(guān)系〔J〕.中華實(shí)用診斷與治療雜志，2012；26(10)：958-60.

7楊李軒，張弩，夏之柏，等.影響惡性膠質(zhì)瘤生存預(yù)后的臨床因素分析〔J〕.中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2012；11(8)：784-7.

8Joel M，Mughal AA，Grieg Z，etal.Targeting PBK/TOPK decreases growth and survival of glioma initiating cells in vitro and attenuates tumor growth in vivo〔J〕.Mol Cancer，2015；14：121.

9Kim B，Song JH，Lee M.Combination of TAT-HMGB1A and R3V6 amphiphilic peptide for plasmid DNA delivery with anti-inflammatory effect〔J〕.J Drug Target，2014，22(8)：739-47.

10Sharma A，Ray R，Rajeswari M.Over expression of high mobility group (HMG) B1 and B2 proteins directly correlates with the progression of squamous cell carcinoma in skin〔J〕.Cancer Invest，2008；26(8)：843-51.

11Meng Q，Zhao J，Liu H，etal.HMGB1 promotes cellular proliferation and invasion，suppresses cellular apoptosis in osteosarcoma〔J〕.Tumour Biol，2014；35(12)：12265-74.

12Limana F，Esposito G，F(xiàn)asanaro P，etal.Transcriptional profiling of hmgb1-induced myocardial repair identifies a key role for nootch signaling〔J〕.Mol Ther，2013；21(10)：1841-51.

13Bassi R，Giussani P，Anelli V，etal.HMGB1 as an autocrine stimulusin human T98G glioblastoma cells：role in cell growth and migration〔J〕.J Neurooncol，2008；87(1)：23-33.

14Kang R，Tang D，Schapiro N，etal.The HMGB1/RAGE inflammatory pathway promotes pancreatic tumor growth by regulating mitochondrial bioenergetics〔J〕.Oncogene，2014；33(5)：567-77.

〔2015-10-27修回〕

(編輯郭菁)

河南省科技廳科技攻關(guān)項目(112102310173)

張元峰(1973-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事腦瘤研究。

R739.41

A

1005-9202(2016)18-4500-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.18.047

1南陽市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科