大鼠脊髓損傷后形態(tài)學(xué)觀察和LIMK1表達(dá)的研究

李廣賢 王日光 姜洪豐 劉金榜 牛云峰

大鼠脊髓損傷后形態(tài)學(xué)觀察和LIMK1表達(dá)的研究

李廣賢 王日光 姜洪豐 劉金榜 牛云峰

目的通過監(jiān)測大鼠脊髓損傷后其形態(tài)學(xué)和LIMK1、GFAP蛋白表達(dá)水平的動態(tài)改變，對脊髓損傷后LIMKL1是否參與膠質(zhì)瘢痕的形成及調(diào)控進(jìn)行初步研究。方法Wistar成年大鼠54只，隨機(jī)分為3組：對照組、假傷組和SCI組，SCI組采用改良Allen's致傷裝置制作大鼠脊髓損傷模型，采用BBB運(yùn)動功能評分法觀察大鼠后肢功能恢復(fù)情況。分別于術(shù)后1、2、3、4周取材，通過HE染色、免疫組化、免疫熒光等方法，觀察傷后不同時(shí)期脊髓的病理變化及LIMK1、GFAP的表達(dá)情況。結(jié)果SCI組死亡率33%，BBB評分示SCI組術(shù)后2周后肢運(yùn)動功能有明顯恢復(fù)（P＜0.01）。LIMK1、GFAP的免疫組化和激光共聚焦顯微鏡分析結(jié)果基本一致，兩者蛋白水平表達(dá)均于傷后1周增高。GFAP表達(dá)于3周達(dá)峰值，4周時(shí)開始下降；LIMK1在傷后1周時(shí)出現(xiàn)峰值，2周開始波動下降，3周時(shí)達(dá)峰值，4周開始下降。結(jié)論大鼠脊髓損傷后，LIMK1和GFAP表達(dá)密切相關(guān)，結(jié)合LIMK1蛋白表達(dá)譜，提示LIMK1通路參與膠質(zhì)瘢痕的形成和調(diào)控。

脊髓損傷LIM結(jié)構(gòu)域激酶1膠質(zhì)纖維酸性蛋白

脊髓損傷（Spinal cord injury，SCI）的修復(fù)一直是臨床研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)[1]。本研究試圖尋求一種在分子水平可以調(diào)控膠質(zhì)瘢痕，并促進(jìn)神經(jīng)再生的作用靶點(diǎn)，為最大可能控制及恢復(fù)脊髓神經(jīng)細(xì)胞的功能提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

成年健康Wistar大鼠54只，體質(zhì)量200～220 g（佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心），隨機(jī)分成對照組、假傷組和SCI組（按損傷時(shí)間分1、2、3、4周4個(gè)亞組）。

1.2 主要試劑與儀器

兔抗大鼠單絲氨酸蛋白激酶1（LIMK1）多克隆抗體、兔抗大鼠膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）多克隆抗體、FITC標(biāo)記的熒光二抗（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；即用型SP-9001 HistostainTM-Plus Kits免疫組化檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

ECLIPSE E100光學(xué)顯微鏡（日本NIKON公司）；LS-3050A全自動生物組織脫水機(jī)（沈陽市龍首電子儀器有限公司）；激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.3 大鼠脊髓損傷模型制備

大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，觀察健康狀況及四肢活動無異常7 d后開始手術(shù)。對照組：不作特殊處理；假傷組：用10%水合氯醛（40 mg/Kg）腹腔注射麻醉后，俯臥位固定，背部剃毛，常規(guī)消毒鋪巾，以T10棘突為中心作長約2～3 cm的后正中切口，逐層切開皮膚及皮下組織，剝離椎旁肌肉并暴露棘突與椎板，咬除T9到T11的棘突與椎板，骨窗大小約為4 mm×8 mm，不損傷硬膜及脊髓；SCI組：在上述操作基礎(chǔ)上，模仿Allen's法[2]，用重10 g、直徑4 mm的重錘自7 cm處沿瞄準(zhǔn)器垂直落下，通過半徑3 mm的圓形墊片（與脊髓直徑大小相吻合）造成該段脊髓后正中部的沖擊傷，止血，局部使用適量青霉素，逐層關(guān)閉傷口。術(shù)后8 h內(nèi)使用保溫器維持模型大鼠體溫于37℃左右（可最大限度避免術(shù)后低體溫死亡）。每只大鼠術(shù)畢每日肌注青霉素鈉5萬U，觀察皮膚有無壓瘡或感染、下肢有無潰爛，必要時(shí)繼續(xù)注射青霉素。術(shù)后每天兩次定時(shí)人工膀胱排尿，直至建立反射性膀胱排空（約在術(shù)后1周）。

1.4 大鼠SCI組傷后神經(jīng)功能評估

采用BBB（Basso,Beattie,and Bresnahan Locomotor Rating Scale）運(yùn)動功能評分法[3]。0分：無可見的自發(fā)活動；0～7分：后肢有不同程度的關(guān)節(jié)活動；8～12分：后肢無負(fù)重或部分負(fù)重著地；13～16分：動物持續(xù)負(fù)重并能行走；17～20分：接近正常的活動，但遺留輕度功能缺陷；21分：運(yùn)動功能正常。

1.5 取材及標(biāo)本制作

分別于傷后1、2、3、4周取材。腹腔麻醉后，以損傷區(qū)為中心切開創(chuàng)口，從其頭尾兩端向致傷處咬開椎板，仔細(xì)剝離黏連組織，取出脊髓（長約1.5 cm），包含損傷區(qū)及上下段脊髓，置于中性甲醛中固定48 h。充分漂洗過夜，標(biāo)本在全自動生物組織脫水機(jī)內(nèi)脫水48 h，脫水、石蠟包埋后切片（以距離脊髓直接損傷邊緣處約1 mm部位開始切片，厚度5 μm），分別行HE染色、Nissl染色、SP免疫組化染色及免疫熒光檢測。HE染色后光鏡下觀察脊髓組織損傷情況；Nissl染色后光鏡下觀察脊髓損傷后神經(jīng)元細(xì)胞、尼氏小體的改變；SP免疫組化染色動態(tài)檢測LIMK1及GFAP表達(dá)情況；選取損傷中心切片，進(jìn)一步行免疫熒光染色，采用激光共聚焦顯微鏡（孔徑130 nm）對LIMK1及GFAP的表達(dá)進(jìn)行定量分析，每張切片隨機(jī)取6個(gè)完整而不重疊的高倍視野，用激光共聚焦顯微鏡自帶系統(tǒng)（Olmpus-FV1000）測量每個(gè)視野下的光密度，取6個(gè)視野的平均光密度值。

1.6 圖像數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

SP免疫組化染色后，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)平均取3張切片，每張切片隨機(jī)選取4個(gè)視野（100倍），計(jì)算每組平均陽性細(xì)胞數(shù)；通過激光共聚焦顯微鏡計(jì)算機(jī)自動分析系統(tǒng)，計(jì)量LIMK1和GFAP相對熒光密度值。應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)采用(x±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 脊髓損傷大鼠一般情況和運(yùn)動功能評價(jià)

SCI組大鼠死亡率為33%，原因可能是低體溫、腹脹、下肢褥瘡、自食肢體合并感染、呼吸或泌尿系統(tǒng)感染。正常組和假手術(shù)組未發(fā)現(xiàn)明顯特殊變化，亦未見死亡情況出現(xiàn)。

術(shù)后3 d時(shí)剔除5只對BBB評分偏離較大的模型大鼠。對照組和假傷組大鼠三項(xiàng)評分均為21分，SCI組傷后1 d大鼠的后肢BBB評分均為0分，傷后1周功能恢復(fù)較快，傷后2周功能恢復(fù)顯著，后期功能恢復(fù)較前兩周明顯減弱，呈緩慢恢復(fù)狀態(tài)。SCI組2周和3周、3周和4周之間的BBB評分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但2周和4周之間有差異明顯（P＜0.05）（表1）。

表1 各組BBB評分結(jié)果（n=6）Table 1BBB score in each group(n=6)

2.2 SCI后組織病理學(xué)變化特點(diǎn)

HE染色觀察發(fā)現(xiàn)，對照組和假傷組脊髓組織細(xì)胞形態(tài)完整，神經(jīng)元數(shù)量較多，排列整齊，神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)正常；SCI組傷后l周，髓內(nèi)可見散在的尚未完全吸收的出血、水腫，損傷區(qū)神經(jīng)細(xì)胞壞死，神經(jīng)元數(shù)目減少；SCI組2周時(shí)，以損傷區(qū)為中心，神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，囊腔形成，周圍有炎細(xì)胞浸潤，但與周圍尚不完全清楚；SCI組3、4周時(shí)，神經(jīng)細(xì)胞明顯減少，部分神經(jīng)元結(jié)構(gòu)不清，變性壞死，囊腔周圍可見有致密的膠質(zhì)癱痕增生（圖1）。

圖1 脊髓組織HE染色Fig.1HE staining of spinal cord tissue

尼氏染色觀察發(fā)現(xiàn)，對照組和假傷組Nissl染色神經(jīng)元胞體內(nèi)尼氏小體豐富，無空泡，核膜完整。SCI組術(shù)后2周、4周時(shí)，可見神經(jīng)元數(shù)目減少、邊界模糊，尼氏小體減少，核周有深紫色團(tuán)塊狀染色質(zhì)，核膜破裂，胞漿嗜酸性改變并可見核膜完整的凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞（圖2）。

圖2 脊髓組織Nissl染色Fig.2Nissl staining of spinal cord tissue

2.3 LIMK1、GFAP免疫組織化學(xué)染色觀察

正常LIMK1主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中，SCI組1周時(shí)，陽性細(xì)胞表達(dá)明顯增強(qiáng)，達(dá)峰值；傷后2周表達(dá)下降，陽性細(xì)胞明顯減少，且低于正常值；3、4周時(shí)又開始升高，并且在傷后3周時(shí)形成一個(gè)峰值（表2）。

表2 免疫組化染色觀察各組LIMK1和GFAP表達(dá)（n=6）Table 2The expression of LIMK1 and GFAP in each group by immunohistochemical staining(n=6)

SCI組1周時(shí)，GFAP表達(dá)略有增強(qiáng)，其邊緣膠質(zhì)細(xì)胞胞體稍有肥大；傷后2周，損傷處GFAP在星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體和突起的表達(dá)增強(qiáng)，數(shù)量增多，囊腔開始形成，邊界不清；3、4周時(shí)，損傷區(qū)囊腔邊界清晰，周圍形成膠質(zhì)瘢痕，瘢痕內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體肥大，突起增多、增粗、變長，細(xì)胞排列緊密且陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多，以靠近囊腔處最為密集（圖3、4）。

圖3 LIMK1免疫組織化學(xué)染色觀察Fig.3Immunohistochemical staining of LIMK1

圖4 GFAP免疫組織化學(xué)染色觀察Fig.4Immunohistochemical staining of GFAP

2.4 激光共聚焦顯微鏡

免疫熒光標(biāo)記后，激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，SCI組1周時(shí)，LIMK1熒光強(qiáng)度明顯高于正常及假傷組，2周后下降，3周后再次上升并達(dá)峰值，4周時(shí)略有下降，但仍高于正常（表3）。GFAP免疫熒光標(biāo)記顯示，SCI組1周時(shí)熒光密度略有增強(qiáng)，于3周后達(dá)峰值，形態(tài)變化同IHC所述（圖5、6）。

表3 免疫熒光觀察各組LIMK1和GFAP表達(dá)（n=6）Table 3The expression of LIMK1 and GFAP in each groupby immunofluorescence assay(n=6)

圖5 LIMK1免疫熒光觀察（100×）Fig.5Immunofluorescence assay of LIMK1(100×)

圖6 GFAP免疫熒光觀察（100×）Fig.6Immunofluorescence assay of GFAP(100×)

3 討論

GFAP構(gòu)成星形膠質(zhì)細(xì)胞的主要細(xì)胞骨架，其表達(dá)的高低可反應(yīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能狀態(tài)與膠質(zhì)化程度[4]。脊髓創(chuàng)傷性損傷后，星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生明顯的迅速反應(yīng)，形成反應(yīng)性膠質(zhì)化增生或膠質(zhì)瘢痕。本實(shí)驗(yàn)觀察到在大鼠SCI組損傷1周時(shí)，細(xì)胞胞體肥大，突起增粗延長，即典型的反應(yīng)性膠質(zhì)化特征。

研究表明，SCI組損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)性膠質(zhì)化具有雙重作用，即幼稚期的誘導(dǎo)作用和成熟期的阻抑作用[5]。我們觀察到大鼠脊髓損傷后2周，在損傷區(qū)形成囊腔，4周后在囊腔周圍可見有胞體肥大增生的突起，并相互交織形成致密的膠質(zhì)瘢痕，而此時(shí)囊腔內(nèi)未見GFAP的表達(dá)，可見膠質(zhì)瘢痕在損傷區(qū)對于神經(jīng)軸突再生具有機(jī)械性阻抑作用。

此外，研究證實(shí)膠質(zhì)瘢痕還能分泌多種神經(jīng)生長抑制分子，后者在損傷區(qū)抑制軸突的生長，在神經(jīng)軸突再生過程中形成另一不可逾越的化學(xué)屏障[6]。

在損傷區(qū)膠質(zhì)瘢痕中分泌的抑制分子包括MAG、Tenascin-R、CSPGs[7]和多種蛋白多糖。體內(nèi)與體外實(shí)驗(yàn)充分證明，上述抑制分子中的髓磷脂相關(guān)抑制分子（CSPGs等）主要是通過Rho-ROCKⅡ信號途徑傳遞抑制信號，即均與受體Nogo-66receptor、NgR特異性結(jié)合后，形成P75NTR/NgR、P75NT/NgR/ Lingo-1復(fù)合物，傳遞胞外抑制信號至質(zhì)膜內(nèi)，作用于細(xì)胞內(nèi)小鳥苷三磷酸酶（GTP酶）-Rho，依次激活下游底物，產(chǎn)生級聯(lián)瀑布信號傳遞，使生長錐內(nèi)的肌球蛋白和肌動蛋白絲收縮，抑制actin結(jié)合蛋白的解聚能力，影響微管的動態(tài)平衡，使神經(jīng)軸突生長錐始終處以被抑制狀態(tài)，生長錐塌陷[8]。

LIMK1是ROCK下游底物，主要定位于胞漿內(nèi)。LIMK能夠被ROCK以及PAK4磷酸化而激活，LIMK1激活后磷酸化Cofilin使之失活，繼而抑制纖絲狀actin的解聚，參與actin細(xì)胞骨架的重組[9]。Arber等[10]報(bào)道，活化的小分子GTP酶Rac（RacV12）和LIMK-1產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，能促進(jìn)LIMK-1和Cofilin的磷酸化，使得共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中纖絲狀肌動蛋白纖維變粗。Nakayama等[11]通過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，細(xì)胞骨架與其收縮有關(guān)，細(xì)胞骨架中微絲的主要結(jié)構(gòu)成份是actin，與肌球蛋白、細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+及相關(guān)蛋白形成一個(gè)成纖維細(xì)胞內(nèi)收縮系統(tǒng)，當(dāng)病理性因素持久存在時(shí)，促進(jìn)actin的聚合，使收縮系統(tǒng)發(fā)生強(qiáng)烈而持久的收縮，最終導(dǎo)致膠質(zhì)瘢痕和瘢痕攣縮的發(fā)生。

我們通過免疫組化染色和免疫熒光的方法，動態(tài)觀察LIMK1和GFAP蛋白表達(dá)的變化，發(fā)現(xiàn)LIMK1在脊髓損傷后1周，蛋白表達(dá)明顯升高；2周時(shí)蛋白表達(dá)下降；但是到傷后3周又出現(xiàn)一峰值，相對熒光密度和陽性細(xì)胞數(shù)分別為（3547.16±484.26）和（29.91±9.92）；4周時(shí)蛋白表達(dá)開始下降。GFAP從傷后1周，其表達(dá)就開始逐漸升高，在3周時(shí)達(dá)峰值。我們發(fā)現(xiàn)，LIMK1和GFAP在脊髓損傷后3周均達(dá)峰值，提示LIMK1與膠質(zhì)瘢痕的形成存在相關(guān)性，即LIMK1可能參與膠質(zhì)瘢痕的形成。

但是實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LIMK1在傷后2周時(shí)表達(dá)明顯下降，甚至低于正常值。我們推測，可能與該時(shí)間段SSH負(fù)反饋于LIMK1，去磷酸化恢復(fù)Cofilin解聚肌動蛋白的活性有關(guān)[12]。

綜上所述，脊髓損傷后膠質(zhì)瘢痕成為神經(jīng)再生的機(jī)械和化學(xué)屏障，肌動蛋白細(xì)胞骨架的動力機(jī)制在瘢痕形成中的作用已得到肯定，因而LIMK-1作為肌動蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)控子，在瘢痕防治中的意義值得探討，這將為脊髓損傷后抑制膠質(zhì)瘢痕，促進(jìn)神經(jīng)再生的分子治療，提供一個(gè)潛在的作用靶點(diǎn)。

4 存在的問題和展望

目前，對脊髓損傷的研究多集中在如何促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞及軸突再生方面，而對膠質(zhì)瘢痕形成及其調(diào)控方面的研究甚少。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LIMK1通路參與膠質(zhì)瘢痕的形成，可作為調(diào)控膠質(zhì)瘢痕的一個(gè)作用靶點(diǎn)，但是，脊髓損傷后LIMK1和Slingshot在信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中是如何相互制約的？LIMK1的活性表達(dá)是如何在時(shí)間和空間上被精準(zhǔn)控制的？這些都是本研究領(lǐng)域中需要進(jìn)一步解決的問題。

對脊髓損傷后調(diào)控膠質(zhì)瘢痕，促進(jìn)軸突再生的研究，尚期待新的突破，全面而系統(tǒng)地對LIMK1通路中各因子變化進(jìn)行研究，將為有效抑制膠質(zhì)瘢痕形成并徹底治療脊髓損傷指明方向。

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Research on Histological Changes and Expression of LIMK1 after Spinal Cord Injury in Rats

LI Guangxian1,WANG Riguang2,JIANG Hongfeng3,LIU Jinbang1,NIU Yunfeng1．1 Anyang Area Hospital,Anyang 455000,China;2 First Hospital Affiliated to Jiamusi University,Jiamusi 154000,China;3 Tianjin Hospital,Tianjin 300000,China.

ObjectiveTo observe the expression of LIMK1,GFAP and the histological changes after SCI,and to explore whether LIMK1 participate in the formation and control of pathological glial scar.MethodsFifty-four adult Wistar rats were randomly divided into 3 groups:one group was made as control group,one group only accepted the pseudo-operation, the others were made as spinal cord injury(SCI)model by the modified Allen's impact device.Locomotor capacity was assessed according to the 21-point Basso,Beanie and Bresnahan score;The lesions were observed with light microscopy and confocal laser scanning microscope at 1,2,3 and 4 weeks after SCI.The LIMK1 and GFAP were also observed by immunohistochemistry(IHC)and immunofluorescence assay.ResultsThe mortality rate of SCI group was 33%.BBB scale of hind limb movements showed significant recovery of motor function after SCI in rats(P＜0.01).There is a high degree of concordance between IHC and laser scanning confocal analysis for LIMK1 and GFAP.Both of the protein expression level increased at 1 week after SCI.The expression of GFAP reached the peak at 3 weeks after injury,and began to fail at 4 weeks.The peak of LIMK1 showed immediately at 1 week,then dropped at 2 weeks.But another peak was formed at 3 weeks and began to fail at 4 weeks.ConclusionAfter spinal cord injury,the expression of LIMK1 and GFAP are closely related.The expression profile of LIMK1 suggests that LIMK1 may play an important role in the glial scar development.

Spinal cord injury;LIM domain kinase 1;Glial fibrillry acidic protein

R744

A

1673－0364（2016）06－0353－05

10.3969/j.issn.1673-0364.2016.06.006

2016年8月13日；

2016年10月21日）

455000河南省安陽市河南省安陽地區(qū)醫(yī)院（李廣賢，劉金榜，牛云峰）；154000黑龍江省佳木斯市佳木斯大學(xué)第一附屬醫(yī)院（王日光）；300000天津市天津醫(yī)院（姜洪豐）。