食管癌干細胞在食管癌放療耐受中的作用與機制

白璐，程民 ，錢立庭

(1.安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院、安徽省立醫(yī)院放療科，合肥 230031；2.安徽省腫瘤醫(yī)院放療科)

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食管癌干細胞在食管癌放療耐受中的作用與機制

白璐1，程民1，錢立庭2

(1.安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院、安徽省立醫(yī)院放療科，合肥 230031；2.安徽省腫瘤醫(yī)院放療科)

最新全球腫瘤統(tǒng)計報告顯示[1]，食管癌的發(fā)病率居癌癥發(fā)病率的第八位，是第五大致死腫瘤。我國食管鱗癌(ESCC)在所有致死性腫瘤中居第四位，且絕大多數(shù)病患預后較差，總體生存率不到20%，局部腫瘤復發(fā)率為60%～80%[2]。多數(shù)病患在就診時已處于中晚期加之放射耐受現(xiàn)象的存在導致放療效果不佳。新近提出的腫瘤干細胞學說認為，腫瘤干細胞(CSCs)是腫瘤復發(fā)、轉移、耐藥及放療耐受的根源[3]。本文就食管癌干細胞(ECSCs)標志物及腫瘤干細胞在食管癌放療耐受中的作用與機制綜述如下。

1食管癌腫瘤標志物及其臨床應用

目前用于臨床診斷的食管癌腫瘤標志物主要有CEA、 CYFRA21-1、SCC-Ag、VEGF、p53-Ab、COX-2 、miR-21[4]等，而MMP、TK1、NY-ESO-1[5]、POSTN[6]等蛋白近期被報道在食管癌早期表達，且與食管癌的轉移、預后不良等因素密切相關，對食管癌的早期發(fā)現(xiàn)、分級及預后評估具有重要價值。但上述標志物的臨床結果反饋提示早期敏感性與特異性較低，故尋找更為合適的腫瘤標志物對于提高早期食管癌的檢出率、改善食管癌的預后情況具有重要意義。腫瘤干細胞學說認為，腫瘤干細胞是一群具有干細胞特性、表達干細胞標志物的細胞亞群，是腫瘤復發(fā)與轉移的根本原因[7]。在食管癌實體瘤中，腫瘤干細胞的存在及所占比例往往與腫瘤的增殖、侵襲、轉移、自我更新、放射線耐受等能力密切相關，并對預后產生重要影響。

2腫瘤干細胞及其分選方法

早期CSCs在白血病中發(fā)現(xiàn)并報道，后經證實廣泛存在于實體腫瘤中，如食管癌、乳腺癌、前列腺癌、膠質瘤、卵巢癌、直腸癌等。腫瘤干細胞學說[8]認為，大多數(shù)實體腫瘤中含有腫瘤干細胞亞群，該亞群具有自我更新、多向分化、化療耐藥、放射線耐受等性質，是腫瘤發(fā)生、增殖、復發(fā)、轉移、放化療耐受的根本原因，并維持著腫瘤細胞群的活性與特性。檢驗CSCs的“金標準”是CSCs可在機體內形成腫瘤，并表現(xiàn)出干細胞與腫瘤細胞的特性[9]。而目前實驗研究常使用的分選方法有：①側群細胞分選法：利用CSCs高效外排DNA熒光染料Hoechst33342這一特性，采用流式細胞儀將其分選出來。分選出的細胞亦稱為側群細胞(SP)。②表面標志分選法：使用CD44、CD24、CD90、CD133、CD166、CD271等表面標志物作為分選標志，采用流式細胞儀或免疫磁柱將CSCs分選出來。③使用無血清液體培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，具有干細胞特性的細胞形成懸浮克隆細胞群，進而篩選出具有干細胞特性的細胞[10]。 ④使用ACAM(attached-cell Aldefluor method)方法，特異性地從食管癌等實體腫瘤中分選出具有干細胞特性的CSCs[9]。

3食管癌干細胞標志物

目前多數(shù)研究使用腫瘤干細胞表面標志物對CSCs進行定性與定量。如：乳腺癌干細胞表面標志物為ESA+CD44+CD24-/Low；前列腺癌干細胞表面標志物為CD44+CD133+；胰腺癌表面標志物為ESA+CD44+CD24+；直腸癌表面標志物為ESA+CD44+CD166+等[10]。ECSCs標志物目前沒有統(tǒng)一標準，研究較多且應用較為普遍的有以下幾種： CD44+[11]、CD44+/CD24-[12]、CD133+、CD90+、ABCG2 、Bmi-1[13]、CD271(p75NTR)+[14]ALDH1[9]及CTAs(Cancer-Testis Antigen)。

Smit等[12]使用CD44+/CD24-作為ECSCs表面標志物，從食管癌細胞系中分選出腫瘤干細胞亞群，并在細胞系和臨床樣本中證實該亞群具有放射線耐受性等腫瘤干細胞特性，認為CD44+/CD24-可作為分選與驗證食管癌干細胞的標志物。另有報道認為，食管鱗癌中CD90+細胞具有高致瘤性及轉移潛能，不僅增加腫瘤的發(fā)生率、自我更新與變異能力，其含量與腫瘤的耐藥性也密切相關[13]，具有腫瘤干細胞特性，故認為CD90可作為ECSCs的表面標志物。Sun等[14]使用p75NTR作為表面標志物將ECSCs從食管癌細胞系中分選出來，并鑒定其性質，認為表達p75NTR陽性的細胞具有更強的腫瘤形成能力。Yang等[15]通過使用ALDH1A1作為分選標準分選出ECSCs，與ALDH1A1low細胞相比，ALDH1A1high細胞具有較強的致瘤性、侵襲性與轉移性等腫瘤干細胞特性。在腫瘤細胞中表達CTAs等抗原可使細胞始終具有干細胞特性。Tabarestani認為，腫瘤細胞中存在表達CT基因的細胞群，可能是CSCs無性增殖的根本原因，故CTAs可能作為潛在的CSCs標志物[16]。目前ECSCs標志物沒有統(tǒng)一標準，尋找更為特效的ECSCs標志物，對ECSCs的研究極為重要。

4食管癌干細胞放射線耐受性

腫瘤干細胞學說認為CSCs相比于普通腫瘤細胞或正常細胞具有更強的放、化療耐受性，導致食管癌放療效果不佳。Diehn等[3]認為CSCs經過放射線照射后產生的DNA損傷更小甚至可以避免DNA損傷，因此是腫瘤放射治療失敗的根源。此外，Bao等[17]認為相對于其他細胞而言，CSCs具有更完善的DNA損傷修復能力，因此具有放射線耐受性。Brunner等[18]提出食管癌放療效果不佳與ECSCs的放射線耐受性、高侵襲性及轉移性相關。腫瘤經過放射線輻照后，由于CSCs對射線耐受，存活CSCs再增殖，最終導致腫瘤復發(fā)與遠處轉移。Smit等[12]在細胞系和臨床樣本中皆證實腫瘤干細胞亞群的放射線耐受性。大量研究結果顯示，ECSCs的放射線耐受性最終導致食管癌的放療耐受、復發(fā)與轉移，也解釋了食管癌治療效果及預后不佳的根本原因。

5食管癌干細胞放射線耐受機制

5.1相關蛋白及通路食管癌干細胞的放射線耐受性與其自身表達的蛋白及通路密切相關，包括ALDH1A1、Periostin、WNT10A、EMT、Wnt/β-catenin、Notch、OCT4、Bmi-1、SNAILl/SIUG和SHH等。

Yang等[15]認為CSCs通過高表達ALDH1A1使自身具有更強的侵襲、轉移性，從而導致預后不佳。高表達ALDH1A1的CSCs通過MMP蛋白和EMT(epithelial-mesenchymal transition)途徑使得食管鱗癌細胞具有更強的侵襲與轉移性，從而具有更強的放射線耐受性。Periostin在食管鱗癌中較癌旁組織過度表達，并與腫瘤的血管形成、轉移、放射線耐受、預后不良等因素密切相關。誘導Periostin低表達可降低食管癌的生長速度與侵襲能力，并導致ECSCs含量顯著降低。故ECSCs可能通過高表達Periostin使自身具有放射線耐受性[19]。過表達WNT10A可促進腫瘤的轉移侵襲及增值擴散能力，降低食管癌的存活率。Long等[20]通過流式細胞術檢測到，過表達WNT10A可導致CSCs含量顯著增加，提升腫瘤細胞的自我更新能力及放射線耐受性等干細胞特性。大多數(shù)放射線耐受的細胞高表達EMT，這可能與EMT可導致細胞低氧耐受、提高DNA修復能力，改變活化生長因子通路密切相關，CSCs高表達EMT，因此EMT在CSCs放射線耐受作用機制中發(fā)揮重要作用[21]。Zhang等[22]報道CSCs是一群放射線耐受的細胞，表現(xiàn)出較高的端粒酶活性，高表達β-catenin,OCT3/4 及β-integrin。ECSCs的放射線耐受性是由EMT通過激活Wnt/β-catenin通路獲得[23]，ECSCs高表達Wnt/β-catenin信號通路的多種蛋白，如Wnt1、 FZD1-4、 GSK3β、CTNNB1 及 Cyclin D1。此外，Wnt/β-catenin通路在DNA損傷應答時被激活，其下游信號轉導通路及DNA高效修復機制使得CSCs具有較強的放射線耐受性[24]，即便后期DNA損傷修復不成功，也可長時間耐受并存活。Wnt/β-catenin 途徑也可能參與CSCs周期時相的再分布，通過影響細胞周期時相，使細胞產生放射線耐受性，故Wnt/β-catenin通路在ECSCs的放療耐受性中起到重要作用。Notch信號通路在維持控制干細胞增殖、存活、變異與凋亡過程中亦發(fā)揮重要作用，HEY1與HEY2作為Notch信號通路的基本靶向基因，在食管癌的發(fā)展、轉移、放療耐受過程中起到重要作用[25]。但ECSCs放射線耐受性與Notch通路是否相關還需進一步研究。

5.2ROS水平食管癌干細胞放射線耐受性與其較低的ROS水平及較強的ROS清除能力相關。低水平ROS可誘導細胞在放射線造成的細胞凋亡和衰老前激活相關分子通路，減少放射線對細胞的損害。增加造血干細胞ROS的水平可降低細胞的自我更新能力[26]，較低水平的ROS對于維持CSCs特性及活性具有重要作用。Diehn等[3]報道，在人和小鼠的乳腺癌腫瘤干細胞中，ROS的含量水平顯著低于非致瘤細胞，且具有更強的放射線耐受性。

5.3DNA分子修復機制腫瘤干細胞擁有特殊的DNA損傷應答系統(tǒng)與修復通路。 DNA分子是放射線對細胞作用的關鍵靶點，而CSCs損傷后迅速修復，使得自身凋亡不能是放射線耐受的關鍵原因。當腫瘤干細胞的DNA分子受損時，p53表達受抑且G1檢查點激活促進DNA修復。Bao等[17]提出，CSCs具有較強的DNA損傷監(jiān)測系統(tǒng)與損傷修復能力，檢查點激酶Chk1/Chk2 在電離應激后激活，控制細胞周期，修復受損DNA雙鏈。此外，Bmi-1在電離輻射后通過染色質富集，在DNA雙鏈斷裂早期應答中促進DNA進行修復。與非腫瘤干細胞相比，CSCs經過放射線照射后所表現(xiàn)出的DNA修復能力大大增強。因此，DNA損傷修復是CSCs放射線耐受的重要因素。

5.4細胞周期時相 成熟的腫瘤干細胞大多處于靜止期，這一現(xiàn)象是導致其對放射線耐受的另一個重要因素。與非腫瘤干細胞相比，CSCs在G1時相早期產生的Cyclin D1表達增強，而在G1時相末產生并使細胞從G1時相過渡為S時相的Cyclin E的表達減弱。在S時相與G2M時相高表達的Cyclin A與Cyclin B在CSCs中表達較正常細胞減弱。普通細胞經過放射線照射后，會停滯在G2期時相，而ECSCs經過放射線照射后，細胞周期時相不會發(fā)生較明顯改變[27]。此外，與非腫瘤干細胞相比，CSCs中EGFR、Ser705表達降低，c-Myc與p27表達顯著升高，EGFR/Stat3/c-Myc/p27通路對于維持CSCs長時間處于靜止期起到重要作用。經過放射線輻照后，ECSCs由于長時間處于靜止期，避免了放射線造成的DNA損傷。故ECSCs長時間處于靜止期是其具有放射線耐受性的重要原因[28]。

5.5放射線耐受的相關基因食管癌腫瘤干細胞具有放射線耐受性，與其特有的基因或基因的特殊表達密切相關。Huang等[11]在食管鱗癌中發(fā)現(xiàn)，Oct-4、Sox-2、Bmi-1 等“干細胞基因”在SP 細胞中的表達比非SP 細胞更高。

放射線耐受的ECSCs中Bmi-1表達水平顯著升高，誘導Bmi-1表達降低后，細胞通過誘導凋亡、升高ROS水平等途徑，增加自身放射線敏感性[29]。由miR-203調節(jié)Bmi-1在ECSCs的增殖與自我更新的過程中發(fā)揮重要作用。與非腫瘤干細胞相比，CSCs的miR-203表達水平減低，Bmi-1表達上調。而miR-203被證實可引起上皮干細胞向鱗狀細胞轉化。因此，Bmi-1在食管癌干細胞放射線耐受機制中起到重要作用。Oct-4是CSCs的重要基因，Oct-4蛋白作為干細胞的存活因子在維持細胞干細胞性質、能力方面起到重要作用，并在體細胞中誘導細胞多能性的表達。在食管鱗癌中，與非腫瘤干細胞相比，ECSCs過表達Oct-4[11]。故Oct-4在維持腫瘤干細胞的自我更新、放化療耐受方面起到決定性作用。Nishii等[30]檢測到腫瘤干細胞Sox-2 mRNA水平較非腫瘤干細胞明顯升高，且表達Sox-2基因與其自我更新能力及腫瘤發(fā)生密切相關。高表達Sox-2的CSCs具有較強的放、化療耐受性。腫瘤干細胞的特殊性質與基因密切相關，從基因角度入手，相信可以探究出更多關于腫瘤干細胞的特性及其發(fā)揮作用的機制。

6展望

腫瘤干細胞與食管癌的放射耐受性相關，直接影響食管癌的放射治療效果。當然，由于腫瘤干細胞在腫瘤細胞中只占極小部分，選擇更高效的鑒定和分選方法分選出更為特異的食管癌干細胞，是亟需解決的技術問題。此外，腫瘤干細胞基因在放療耐受過程中的作用及機制仍需進一步探索。

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基金項目：安徽省自然科學基金資助項目(1508085SMH233)

作者簡介：白璐，碩士在讀，Email:1403898896@qq.com通信作者：錢立庭，主任醫(yī)師，教授，碩士生導師，Email:money2004@sina.com

中圖分類號:R735.1

文獻標識碼:A

DOI:10.3969/J.issn.1672-6790.2016.02.003

(收稿日期：2015-11-02)

·腫瘤：基礎與臨床·