劉書偉，王 燕，胡勁召

(1.瓊州學(xué)院 熱帶生物與農(nóng)學(xué)院，海南 三亞 572022； 2.瓊州學(xué)院 熱帶生態(tài)環(huán)境保護(hù)學(xué)院，海南 三亞 572022)

檳榔鮮果對(duì)小鼠體質(zhì)量、生精細(xì)胞凋亡及臟器系數(shù)的影響

劉書偉1，王 燕2*，胡勁召2

(1.瓊州學(xué)院 熱帶生物與農(nóng)學(xué)院，海南 三亞 572022； 2.瓊州學(xué)院 熱帶生態(tài)環(huán)境保護(hù)學(xué)院，海南 三亞 572022)

為探索檳榔鮮果的毒性作用，將檳榔鮮果果皮、果仁和全檳榔的水提液及生理鹽水(對(duì)照)對(duì)KM小鼠每天進(jìn)行1次灌胃處理，連續(xù)13 d，測(cè)定小鼠的體質(zhì)量、存活率、生精細(xì)胞凋亡指數(shù)、Bcl-2與Bax蛋白表達(dá)量及臟器系數(shù)。結(jié)果表明，果仁處理和全檳榔處理的小鼠體質(zhì)量隨著處理天數(shù)的增加呈下降趨勢(shì)，果皮處理無明顯影響；對(duì)照和果皮處理的小鼠存活率均為100%，全檳榔和果仁處理分別為55.56%和0；果仁和全檳榔處理的生精細(xì)胞凋亡指數(shù)分別為1.61%和0.96%，均極顯著高于果皮處理和對(duì)照；果仁處理的Bax蛋白的表達(dá)水平明顯增強(qiáng),Bcl-2蛋白的表達(dá)水平明顯下降?？梢姡瑱壚契r果水提液對(duì)小鼠所產(chǎn)生的毒性效應(yīng)主要來源于果仁，果皮對(duì)小鼠無明顯影響，全檳榔處理介于二者之間。

檳榔鮮果； 毒性； 小鼠； 細(xì)胞凋亡； 體質(zhì)量； 臟器系數(shù)

檳榔(ArecacatechuL.)是棕櫚科(Palmaceae)檳榔屬(Areca)的熱帶常綠喬木，也是一種藥食同源植物[1]，檳榔果實(shí)位居我國四大南藥(檳榔、砂仁、益智、巴戟)之首，《得配本草》中記載：檳榔可“治瀉痢，破滯氣，攻堅(jiān)積，止諸痛，消痰癖，殺三蟲，除水脹，療瘴瘧”[2]。檳榔除用于嚼食外，也是傳統(tǒng)驅(qū)蟲藥，臨床上可添加于飼料中治療犬、豬和牛絳蟲等[3-6]，犬、豬和雞蛔蟲等[4,7-8]，還可治療鉤蟲、蟯蟲、血吸蟲病等[9-10]。檳榔具有理氣消積之功，可治療牲畜的食積氣滯、腹痛脹滿便秘等[11-15]。此外，檳榔還有抑菌、抗抑郁、抗疲勞、抗氧化等多種功能。但2003年國際癌癥研究中心(IARC)正式認(rèn)定檳榔為一級(jí)致癌物[16]，檳榔使用的安全性受到質(zhì)疑，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)檳榔的藥理、毒副作用機(jī)制及新產(chǎn)品開發(fā)等方面進(jìn)行了一定研究，但研究大多集中在檳榔生物堿的藥理及毒性作用方面，對(duì)鮮果檳榔的原液提取物研究較少。為全面評(píng)價(jià)檳榔鮮果的毒性狀況，本研究通過分析檳榔鮮果不同部位的水提液對(duì)小鼠進(jìn)行經(jīng)口灌胃后其身體指標(biāo)的變化狀況，初步探討檳榔鮮果水提液對(duì)小鼠的毒性作用，為檳榔在獸藥學(xué)領(lǐng)域的進(jìn)一步開發(fā)、應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試動(dòng)物

供試動(dòng)物為SPF級(jí)KM小白鼠，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，小鼠生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(湘) 2013-0004。動(dòng)物引入后，置于三亞市功能檳榔研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房養(yǎng)殖，喂養(yǎng)SPF級(jí)小鼠專用維持飼料，自由飲水采食，適應(yīng)環(huán)境7 d，在小鼠適應(yīng)的過程中，觀察小鼠的綜合狀況，選取表現(xiàn)正常和大小均勻一致的小鼠待用，體質(zhì)量(40±1) g。室內(nèi)溫度為(22±3)℃，相對(duì)濕度為60%～70%，光照為12 h/d。

1.2 檳榔材料及制備

檳榔果采摘于海南省三亞市吉陽區(qū)農(nóng)民的檳榔種植園，莖部帶宿萼，剖開檳榔有未成熟瘦長(zhǎng)形種子，其外形橢圓、勻稱，橫向直徑3～4 cm，光澤較好、顏色純正，縱向直徑5～6 cm。采摘后用保鮮膜包裹，及時(shí)運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室冷藏待用。

挑選均勻一致的檳榔鮮果清洗干凈后晾干，取部分檳榔沿中軸縱向切開，將果皮和果仁分開待用，并留適量完整檳榔做全檳榔處理，將果仁、果皮和全檳榔分別稱質(zhì)量。將檳榔果皮切小塊并加等質(zhì)量的蒸餾水，用研磨機(jī)粉碎研磨5 min，靜置水提待用，全檳榔采用同樣方法處理；檳榔果仁機(jī)械壓碎(不可用粉碎機(jī)粉碎，粉碎后呈糊狀，不易過濾)，然后加入等質(zhì)量的蒸餾水靜置。全部水提4 h后用雙層紗布過濾，將濾液分別置于經(jīng)消毒后的離心管中，以5 000 r/min離心10 min，然后采用0.22 μm除菌過濾膜過濾，濾液即為供試水提液，3種水提液分別為：全檳榔水提液、果仁水提液和果皮水提液。水提液現(xiàn)用現(xiàn)制，2 h內(nèi)處理完畢。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

按照食品毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)范(GB 15193—2014)進(jìn)行試驗(yàn)，選取36只健康小白鼠，隨機(jī)分為4個(gè)處理，即全檳榔處理、果仁處理、果皮處理和生理鹽水處理(對(duì)照，CK)。小鼠禁食8 h后稱其體質(zhì)量，按體質(zhì)量大小灌胃給藥，灌胃劑量為15 mL/kg，給藥后禁食1 h，自由采食和飲水，連續(xù)灌胃13 d。為防止小鼠相互傷害，小鼠均為單籠飼養(yǎng)。

1.4 測(cè)定指標(biāo)

1.4.1 體質(zhì)量 試驗(yàn)期間，每天測(cè)量小鼠灌胃前體質(zhì)量，觀察記錄存活狀況。

1.4.2 生精細(xì)胞凋亡檢測(cè) 試驗(yàn)期滿，麻醉脫頸椎處死小鼠，迅速摘取雄性雙側(cè)睪丸，采用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)。在熒光顯微鏡下觀察小鼠睪丸組織切片，細(xì)胞核中有棕黃色顆粒且背景清晰者為陽性細(xì)胞，每張切片選取20個(gè)視野計(jì)數(shù)總的生精細(xì)胞凋亡數(shù)，并計(jì)算生精細(xì)胞凋亡指數(shù)。

1.4.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)睪丸組織Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá) 檢測(cè)參照姜卓等[17]的方法。采用10%的中性甲醛固定小鼠睪丸組織，鉻明礬處理切片，石蠟包埋、切片、展片、烘片、脫蠟等處理后分別用武漢博士德生物工程有限公司的Bax、Bcl-2蛋白檢測(cè)試劑盒進(jìn)行一系列操作，采用JD-801形態(tài)學(xué)顯微圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.4.4 臟器系數(shù) 測(cè)定小鼠肺臟、肝臟、脾臟、睪丸、心臟和腎臟的質(zhì)量以及體質(zhì)量，各臟器與體質(zhì)量的比值即為各臟器的臟器系數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行差異性統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)小鼠體質(zhì)量和存活率的影響

從表1可看出，4個(gè)處理供試小鼠初始體質(zhì)量差異不顯著；隨著灌胃天數(shù)的持續(xù)，全檳榔處理和果仁處理小鼠的體質(zhì)量均呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，從第3天開始全檳榔處理與果仁處理達(dá)到顯著差異水平，與CK和果皮處理也均達(dá)到顯著差異水平；果皮處理和CK體質(zhì)量均呈增加的趨勢(shì)，且兩者差異不顯著。不同處理小鼠存活狀況不同，果仁處理小鼠死亡情況最為嚴(yán)重，在灌胃的第2天、第3天、第4天，小鼠分別死亡2只、4只、2只，第5天灌胃后2 h該處理小鼠全部死亡，其存活率為0；全檳榔處理在灌胃的第9天小鼠開始出現(xiàn)死亡，至試驗(yàn)期滿死亡4只，存活率為55.56%；CK和果皮處理小鼠沒有出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，即存活率均為100%?？梢?，果仁處理會(huì)急劇降低小鼠的體質(zhì)量并可將其全部致死，全檳榔處理會(huì)導(dǎo)致小鼠體質(zhì)量逐漸降低且出現(xiàn)部分死亡現(xiàn)象，果皮處理對(duì)小鼠體質(zhì)量無不良影響且無小鼠死亡。

表1 不同處理對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

注：同列數(shù)據(jù)不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。表中空白表示該處理小鼠已全部死亡。

2.2 不同處理對(duì)小鼠睪丸曲細(xì)精管中生精細(xì)胞凋亡的影響

圖1顯示，與對(duì)照組相比，3個(gè)檳榔處理的小鼠生精細(xì)胞陽性表達(dá)細(xì)胞增多，其中果仁處理生精細(xì)胞凋亡指數(shù)最高且極顯著高于其他處理，是CK凋亡指數(shù)的12.38倍；全檳榔處理凋亡指數(shù)為0.96%，極顯著高于果皮處理和CK，是CK的7.38倍；果皮處理與CK差異不顯著，其凋亡指數(shù)僅高于CK 0.02個(gè)百分點(diǎn)。說明果仁和全檳榔處理特別是果仁處理對(duì)小鼠生殖器官損傷較大，為維持小鼠內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，生精細(xì)胞凋亡較多，這可能會(huì)使小鼠體內(nèi)缺少精子；果皮處理對(duì)小鼠生殖器官損傷較小。

不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著，不同大寫字母表示在0.01水平差異顯著圖1 不同處理對(duì)小鼠睪丸生精細(xì)胞凋亡指數(shù)的影響

2.3 不同處理對(duì)小鼠睪丸生精細(xì)胞Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

研究表明，Bax蛋白和Bcl-2蛋白均參與了生精細(xì)胞凋亡的過程[18-19]。Bax蛋白和Bcl-2蛋白在功能上相互對(duì)立，Bax蛋白促凋亡，Bcl-2蛋白抗凋亡， Bcl-2/Bax是決定細(xì)胞是否發(fā)生凋亡的重要指標(biāo)。

由表2可看出，Bax蛋白和Bcl-2蛋白在各處理小鼠睪丸組織中均有不同程度的表達(dá)。果仁處理Bax蛋白表達(dá)陽性率最大且顯著高于全檳榔處理、極顯著高于果皮處理和CK；全檳榔處理Bax蛋白表達(dá)陽性率極顯著高于果皮處理和CK；果皮處理Bax蛋白表達(dá)陽性率略高于CK，二者差異不顯著。4個(gè)處理的Bcl-2蛋白表達(dá)陽性率也不同，其趨勢(shì)與Bax蛋白相反。果仁處理Bcl-2/Bax最小，顯著低于全檳榔處理，極顯著低于果皮處理和CK，全檳榔、果皮處理和CK的值分別是果仁處理1.76倍、2.49倍和2.78倍。綜上，在誘導(dǎo)小鼠睪丸細(xì)胞凋亡方面，果仁處理能顯著增強(qiáng)凋亡蛋白Bax的表達(dá)，極顯著地降低抗凋亡蛋白的表達(dá)，說明果仁處理具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用，全檳榔處理次之，果皮處理誘導(dǎo)作用不明顯。

表2 不同處理對(duì)小鼠睪丸組織Bax蛋白和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

注：同列數(shù)據(jù)不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著，不同大寫字母表示在0.01水平差異顯著。

2.4 不同處理對(duì)小鼠臟器系數(shù)的影響

臟器系數(shù)又稱臟體比，正常動(dòng)物各臟器與體質(zhì)量的比值比較恒定，染毒后受損臟器的臟器系數(shù)發(fā)生變化，臟器系數(shù)增大說明臟器充血、水腫或增生肥大，臟器系數(shù)減小說明臟器萎縮或退行性改變。由表3可以看出，3個(gè)檳榔處理對(duì)小鼠肝臟、脾臟、睪丸和心臟影響不明顯，臟器系數(shù)與CK差異均不顯著；果皮處理對(duì)小鼠臟器系數(shù)影響最小，所有臟器系數(shù)與CK相比差異均不顯著；全檳榔處理和果仁處理對(duì)小鼠肺臟和腎臟影響較大，其臟器系數(shù)與CK和果皮處理差異均顯著，其中，果仁處理的臟器系數(shù)增加或減小的幅度最大。

表3 不同處理對(duì)小鼠臟器系數(shù)的影響

注：同列數(shù)據(jù)不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明：(1)果仁和全檳榔處理特別是果仁處理對(duì)小鼠的體質(zhì)量和存活率影響較大，果仁和全檳榔處理組小鼠體質(zhì)量隨處理天數(shù)增加均呈降低的趨勢(shì)；在灌胃的第5天，果仁處理小鼠全部死亡，全檳榔處理在灌胃的第9天小鼠開始死亡，至試驗(yàn)期滿死亡4只；而果皮處理和CK小鼠的體質(zhì)量均呈增加的趨勢(shì)，且兩者差異不顯著，小鼠無死亡現(xiàn)象。說明較高劑量的果仁提取液毒性較大，導(dǎo)致小鼠死亡。(2)檳榔鮮果水提液可誘導(dǎo)小鼠生精細(xì)胞凋亡，其中檳榔果仁處理的小鼠睪丸曲細(xì)精管中的生精細(xì)胞凋亡指數(shù)最高，全檳榔處理次之，并與其他處理達(dá)到極顯著差異水平；果皮處理與CK差異不顯著。說明檳榔特別是檳榔果仁誘導(dǎo)小鼠生精細(xì)胞凋亡指數(shù)增高，使生精過程發(fā)生障礙，從而影響其生殖功能，其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。(3)果仁和全檳榔處理對(duì)小鼠肺臟和腎臟影響較大，均使小鼠肺臟的臟器系數(shù)增加，使腎臟的臟器系數(shù)減小，與CK差異均顯著，其中果仁處理增加或減小的幅度更大，說明這2個(gè)處理使小鼠肺部充血或水腫，使小鼠腎臟發(fā)生萎縮或退行性改變。提示檳榔果仁和全檳榔可能對(duì)免疫器官和呼吸器官有一定影響。綜上所述，檳榔鮮果不同部位的水提液對(duì)小鼠毒害作用最嚴(yán)重的是檳榔果仁，其次為全檳榔(由果仁和果皮組成)，而果皮處理對(duì)小鼠的影響非常小?？梢?，檳榔毒性主要來源于果仁，果皮的毒性極微。

目前，普遍認(rèn)為檳榔產(chǎn)生毒性作用的成分是檳榔生物堿，研究表明，生物堿大部分存在于檳榔種子中[20]，這與本研究結(jié)果一致。但其毒副作用機(jī)制并不清楚，因?yàn)闄壚坪卸喾N生物堿，其生物學(xué)作用也較復(fù)雜。同時(shí)檳榔對(duì)雄性小鼠生精細(xì)胞、肺臟及腎臟的毒性作用應(yīng)引起人們的注意，在臨床的應(yīng)用中，若使用檳榔制品添加于飼料中，應(yīng)進(jìn)一步研究其效果、最佳有效劑量及毒性等。本次試驗(yàn)研究得到的結(jié)果，僅提示在本試驗(yàn)條件下檳榔提取液對(duì)受試動(dòng)物有一定的影響，至于其劑量-反應(yīng)關(guān)系、作用機(jī)制均有待進(jìn)一步探討。

[1] 聞慶，龐玉新，楊全，等．海南島藥食同源植物資源及其開發(fā)利用現(xiàn)狀[J]．廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2015，31(1)：126-131．

[2] 嚴(yán)潔,施雯,洪煒．得配本草[M]．上海：上海衛(wèi)生出版社，1957．

[3] 肖嘯，肖焰，沈?qū)W文，等．檳榔驅(qū)除犬絳蟲試驗(yàn)效果觀察[J]．中國畜牧獸醫(yī)，2009(2)：135-137．

[4] 王連平，盧少達(dá)，張啟祥，等．左旋咪唑與檳榔粉合用驅(qū)除犬弓首蛔蟲和泡狀帶絳蟲效果觀察[J]．中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2005(3)：58-59．

[5] 田喜鳳，戴建軍，董路，等．檳榔南瓜子合劑對(duì)豬帶絳蟲作用的超微結(jié)構(gòu)觀察[J]．中國寄生蟲病防治雜志，2002，15(6)：47-48,84．

[6] 楊全孝．檳榔加南瓜籽驅(qū)除犢牛絳蟲[J]．中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，1988(1)：52．

[7] 李獻(xiàn)軍．中藥對(duì)離體豬蛔蟲的療效研究[J]．現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2011(11)：328,330．

[8] 肖成山．檳榔汁加SDM治療雞蛔蟲病效果好[J]．湖北畜牧獸醫(yī)，1989(3)：50．

[9] 許正敏，李智山，溫茂興，等．檳榔對(duì)犬鉤蚴體外作用的實(shí)驗(yàn)觀察[J]．中國病原生物學(xué)雜志，2010(10)：767-768,805．

[10] 鄒艷，丘繼哲，曾慶仁，等．黃芪復(fù)合劑抗血吸蟲作用的實(shí)驗(yàn)研究[J]．熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2010(6)：654-656,690．

[11] 王明興．檳榔散治療馬屬動(dòng)物不完全阻塞性腸便秘[J]．中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2000(1)：31．[12] 陳發(fā)庭．檳榔在治療馬胃腸病中的應(yīng)用[J]．獸醫(yī)科技資料，1979(3)：43．

[13] 鄒百倉，魏蘭福，魏睦新．檳榔對(duì)功能性消化不良模型大鼠胃運(yùn)動(dòng)的影響[J]．中國中西醫(yī)結(jié)合消化雜志，2003，11(1)：6-8．

[14] 王平．檳榔的促胃動(dòng)力作用及其有效組分的探索[D]．南京：南京醫(yī)科大學(xué)，2012．

[15] 楊建省，王秋菊．砂仁、檳榔、山楂等6味中草藥促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)作用的研究[J]．飼料博覽，2013(2)：5-10．

[16] Gilani A H,Ghayur M N,Saify Z S,etal.Presence of cholinomimetic and acetylcholinesterase inhibitory constituents in betel nut[J].Life Sciences,2004,75(20):2377-2389.

[17] 姜卓，羅光彬，尹榮煥，等.喹乙醇對(duì)小鼠生精細(xì)胞Bax基因表達(dá)的影響[J]．河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，37(3)：112-114.

[18] Saikumar P,Dong Z,Weinberg J M,etal.Mechanisms of cell death in hypoxia/reoxygenation injury[J].Oncogene,1998,17(25):3341-3349.

[19] Yang J,Liu X,Bhalla K,etal.Prevention of apoptosis by Bcl-2:Release of cytochrome c from mitochondria blocked[J].Science,1997,275(533):1129-1132.

[20] 周大鵬，王金梅，尹震花，等．HS-SPME-GC-MS分析檳榔果皮和種子的揮發(fā)性成分[J]．天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2012，24(12)：1782-1786．

Effects of Fresh Betelnut on Spermatogenic Cell Apoptosis,Viscera Coefficients and Body Weight of Mice

LIU Shuwei1,WANG Yan2*,HU Jinzhao2

(1.College of Tropical Biology and Agronomy,Qiongzhou University,Sanya 572022,China;2.College of Tropical Ecological Environmental Protection,Qiongzhou University,Sanya 572022,China)

To research the toxic effects of fresh betelnut,the mice were intragastricly administered with water extract solution from betelnut,peels and seeds of fresh betelnut once a day and observed for 13 d.Body weight,survival rate,spermatogenic cell index,Bcl-2,Bax and viscera coefficients of mice were measured.The results showed that the mice’s body weight of betelnut and seeds treatments decreased with the increase of days,and the treatment of peels had no bad effect on the mice.The survival rate of control(saline water) and peels treatments were 100%,betelnut and seeds treatments were 55.56% and 0.Spermatogenic cell apoptosis index of betelnut and seeds treatments were 0.96% and 1.61%,and had very significant difference with other treatments.The expression level of Bax protein of the seeds treatment was up regulated,but Bcl-2 protein was down regulated significantly.Therefore,toxic effects in mice mainly came from betelnut’seeds while peels almost had no effects,and the toxic effect of betelnut was between peels and betelnut’s seeds.

fresh betelnut; toxicity; mice; cell apoptosis; body weight; viscera coefficients

2015-07-01

海南省中藥現(xiàn)代化專項(xiàng)項(xiàng)目(ZY201417)；三亞市功能檳榔研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(L1411)；三亞市農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新項(xiàng)目(2014NK28)；三亞市院地科技合作項(xiàng)目(2014YD16,2015YD29)

劉書偉(1978-)，男，河南平輿人，副教授，碩士，主要從事南藥毒理、農(nóng)產(chǎn)品加工研究及教學(xué)工作。 E-mail:hnlsw@163.com

*通訊作者：王 燕(1979-)，女，河南太康人，副教授，碩士，主要從事檳榔加工研究及相關(guān)教學(xué)工作。 E-mail:wysw119@163.com

時(shí)間：2016-02-02 17:36:14

S859.3

A

1004-3268(2016)02-0142-05

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/41.1092.S.20160202.1736.001.html