孫豐廷，史紅麗，高小聰，杜恩岐

(1．陜西諾威利華生物科技有限公司，陜西楊凌 712100；2．北京康寶利華生物科技有限公司，北京 100176；3．南通市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，江蘇南通 226000；4．西北農(nóng)林科技大學(xué)，陜西楊凌 712100)

一株豬流行性腹瀉病毒的分離鑒定和遺傳進(jìn)化分析

孫豐廷1，史紅麗2，高小聰3，杜恩岐4*

(1．陜西諾威利華生物科技有限公司，陜西楊凌 712100；2．北京康寶利華生物科技有限公司，北京 100176；3．南通市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，江蘇南通 226000；4．西北農(nóng)林科技大學(xué)，陜西楊凌 712100)

從陜西地區(qū)26個(gè)疑似豬流行性腹瀉病毒感染的豬場(chǎng)，采集發(fā)病仔豬的肛門拭子、糞便以及死亡仔豬的小腸，將其接種于Vero細(xì)胞，在添加胰酶的情況下，連續(xù)傳代培養(yǎng)并觀察，直至細(xì)胞出現(xiàn)典型的合胞體病變，經(jīng)RT-PCR檢測(cè)、測(cè)序、基因比對(duì)分析與動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)，最終確定分離到一株P(guān)EDV病毒強(qiáng)毒株。經(jīng)過(guò)測(cè)定毒株的S基因序列，進(jìn)行序列比對(duì)分析和遺傳進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)本次分離到的毒株與疫苗株CV777同源性較低，進(jìn)化分支位于目前流行的PEDV G2a亞群。

豬流行性腹瀉病毒；分離鑒定；S基因

1973年豬流行性腹瀉(Porcine Epidemic Diarrhea, PED)在中國(guó)上海首次發(fā)生，直到1984年才明確其病原體為豬流行性腹瀉病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus, PEDV)[1]。2010年末開(kāi)始我國(guó)東南沿海地區(qū)暴發(fā)PED并擴(kuò)散至全國(guó)各地，主要以高發(fā)病率和高死亡率為特征[2-4]。近年來(lái)由PEDV引起的豬流行性腹瀉(PED)對(duì)養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)造成了巨大損失，飼養(yǎng)管理不當(dāng)非常容易導(dǎo)致PEDV的暴發(fā)，由于其臨床癥狀與豬傳染性胃腸炎(Transmissible Gastroenteritis of Swine，TGE)等腸道疾病類似，臨床診斷比較困難。PEDV可感染各種年齡段的豬，以嘔吐、腹瀉及脫水為主要臨床特征，該病主要發(fā)生于冬季，夏秋季節(jié)也可發(fā)生，造成養(yǎng)豬業(yè)嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[5-6]。S基因易發(fā)生變異，因此常被用來(lái)研究不同年代和地點(diǎn)毒株之間的親緣關(guān)系，本研究對(duì)2013年9月12日從陜西26個(gè)豬場(chǎng)疑似PEDV樣品分離到一株病毒，經(jīng)鑒定確認(rèn)為PEDV，對(duì)毒株病毒的S基因進(jìn)行同源性與遺傳進(jìn)化分析，為疫苗研發(fā)提供了理論依據(jù)[7]。

1 材料與方法

1.1 病料與細(xì)胞 從陜西地區(qū)26個(gè)疑似豬流行性腹瀉病毒感染的豬場(chǎng)采集病料大約380份，包括仔豬的肛門拭子、糞便以及死亡仔豬的小腸等。Vero細(xì)胞(非洲綠猴腎細(xì)胞)購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 主要試劑 RNA提取試劑盒，購(gòu)自O(shè)MEGA公司；Oligo(dt)、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、Taq 酶等購(gòu)自TaKaRa公司；胎牛血清與DMEM培養(yǎng)基，購(gòu)自Hyclone公司；胰酶，購(gòu)自Sigma公司。國(guó)內(nèi)外建立了各種RT-PCR方法檢測(cè)PEDV，大部分針對(duì)保守的M基因[8],引物：檢測(cè)引物與S基因引物序列參考何振洋碩士論文[9]，P EDV檢測(cè)引物目的片段大小645～647 bp，豬輪狀病毒(Porcine Rotavirus PoRV)檢測(cè)引物目的片段大小309 bp，豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)檢測(cè)引物目的片段大小528 bp檢測(cè)引物，由上海Invitrogen公司合成。

1.3 病料處理 采集到的病料樣品按照1∶10的比例加入PBS緩沖液，進(jìn)行研磨處理，反復(fù)凍融三次后，使用3000 r/min離心15 min，取上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，濾液分裝，-80 ℃保存。

1.4 RT-PCR檢測(cè) 取病料處理后的上清液，使用RNA提取試劑盒提取病毒RNA，使用隨機(jī)引物和M-MLV酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA，擴(kuò)增條件為：42 ℃反應(yīng) 60 min，72 ℃ 15 min。以cDNA 為模板，檢測(cè)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，循環(huán)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性 3 min，94 ℃變性1 min，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸 10 min。PCR 產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)(表1)。

表1 本研究用到的檢測(cè)引物與測(cè)序引物

1.5 病毒的分離 按常規(guī)方法傳代Vero 細(xì)胞，培養(yǎng) 48 h至單層，按10%接種檢測(cè)陽(yáng)性的病毒液，并添加胰酶至終濃度 10 μg/mL，37 ℃吸附1 h ，其間輕搖2次。待吸附結(jié)束后，加入含有終濃度 10 μg/mL胰酶的DMEM 溶液作為維持液，置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，72 h后收毒。將收毒后的病毒液反復(fù)凍融 3 次，按上述方法進(jìn)行盲傳下一代，直至出現(xiàn)細(xì)胞病變。

1.6 病毒的鑒定 細(xì)胞毒RT-PCR的鑒定：將細(xì)胞培養(yǎng)物在-80 ℃凍融3次，提取RNA進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，具體方法同1.4項(xiàng)。

細(xì)胞病變觀察：病毒接種細(xì)胞后盲傳幾代會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞病變，用倒置顯微鏡能觀察到明顯的細(xì)胞病變同時(shí)記錄病變情況。

動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)：用Vero F5代細(xì)胞毒灌胃接種5日齡抗原抗體陰性未吸初乳仔豬3只，1 mL每頭份，每日觀察臨床癥狀。

1.7 病毒基因組核酸序列分析 核酸提取與反轉(zhuǎn)錄：根據(jù)試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)?2 ℃1 h，70 ℃15 min，完成后-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?0 μL反轉(zhuǎn)錄體系：RNA 12 μL，5×Reaction Buffer 4 μL，10 mM dNTPs 1 μL，隨機(jī)引物(10 mmol/L)1 μL，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶1 μL，RNase Inhibitor 1 μL。

RT-PCR產(chǎn)物電泳檢：取10 μL擴(kuò)增的RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行觀察有無(wú)特異性條帶，陽(yáng)性條帶產(chǎn)物送大連寶生物公司進(jìn)行測(cè)序。50 μL RT-PCR反應(yīng)體系：cDNA 2 μL，10×Buffer 5 μL，10 mM dNTPs 2 μL，上、下游引物(10 mmol/L)各1μL，Taq酶1 μL，ddH2O 38 μL。

序列比對(duì)分析：使用MEGA5.5軟件分析S基因，對(duì)本次PEDV毒株進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEDV的分離及在Vero細(xì)胞中的傳代培養(yǎng) 將處理后病料上清接種Vero細(xì)胞后，F(xiàn)3代開(kāi)始出現(xiàn)細(xì)胞脫落等明顯細(xì)胞病變，連續(xù)傳至F10代病變出現(xiàn)時(shí)間穩(wěn)定(圖1)。

圖1 A為正常Vero細(xì)胞,B為PEDV感染后48 h的Vero細(xì)胞(200×)

2.2 PCR鑒別檢測(cè) 用PEDV的引物PEDV-F/R進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，糞便樣品均可以擴(kuò)增到一條645 bp左右的特異性條帶。TGEV 和PoRV 的引物均沒(méi)有擴(kuò)增出特異條帶(圖2)，PEDV S基因擴(kuò)增見(jiàn)圖3。

M: Marker DL2000;1.PEDV陰性對(duì)照；2.PEDV陽(yáng)性對(duì)照;3.PEDV樣品；4.TGEV陰性對(duì)照；5. TGEV陽(yáng)性對(duì)照；6.PoRV陰性對(duì)照；7.PoRV陽(yáng)性對(duì)照?qǐng)D2 鑒別檢測(cè)PCR結(jié)果的電泳圖

圖3 S基因測(cè)序引物擴(kuò)增結(jié)果的電泳圖(M: Marker DL2000；1．陰性對(duì)照；2～5分別為覆蓋S基因的四個(gè)片段(S1～S4))

2.3 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 接種動(dòng)物后24 h發(fā)病，出現(xiàn)嘔吐、腹瀉，48 h出現(xiàn)明顯消瘦(圖4)，48～72 h出現(xiàn)死亡，解剖觀察胃、小腸粘膜病變，胃內(nèi)有大量白色未消化食物，胃壁出現(xiàn)潰瘍、出血、壞死、小腸充血鼓氣，腸壁變薄，腸黏膜脫落見(jiàn)圖4，并于3～4 d全部死亡，表明通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)獲得的PEDV對(duì)乳豬有較強(qiáng)的感染性，病毒分離成功。2.4 序列比對(duì)分析 選取不同亞群代表性毒株的S基因，推導(dǎo)氨基酸序列，根據(jù)推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析，KB2013-4與2011-2014年中國(guó)分離毒株(JS-HZ2012、BJ-2011-1、CHZJCX-12012、CPGEN-20140427)、美國(guó)毒株USA-Colorado-2013、中國(guó)分離毒株GD-B同源性較高，分別為99.5%、99.4%、99.4%、99.1%、99.3%、99.1%，與比利時(shí)疫苗株CV777、韓國(guó)毒株(atternuated DR13、SM98)、中國(guó)分離株AH-M同源性較低，分別為9%、8.5%、10.7%、8.5%(表2)。

A: 乳豬接種KB2013-4毒株后第2天，出現(xiàn)明顯消瘦；B: 乳豬接毒后第3天死亡，剖檢可見(jiàn)小腸壁明顯變薄，胃內(nèi)容物為乳糜樣圖4 仔豬接種PEDV KB2013-4株后臨床剖解圖片

表2 各群代表毒株之間S蛋白氨基酸序列比較

比較G2a亞群中毒株氨基酸變化發(fā)現(xiàn)，KB2013-4毒株沒(méi)有插入或缺失氨基酸，但存在四個(gè)氨基酸突變，分別為389位 A→S，503位 T→A，1009位N→S，1109位Q→R。

2.5 遺傳進(jìn)化分析 基于PEDV S基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，可以看出，PEDV的亞型眾多，主要可分為G1亞型與G2亞型，而G1與G2又可細(xì)分為G1a、G1b、G2a、G2b與G2c，此外還存在一些特殊變異的毒株亞型，比如重組的毒株與存在插入和缺失突變的毒株(INDEL, insertion and deletion)。從圖5可以看出KB2013-4 株屬于G2a亞型，與AH2012株屬于同一亞型。

3 討論與小結(jié)

豬流行性腹瀉病毒是豬場(chǎng)發(fā)生流行性腹瀉疾病的主要病原之一，對(duì)規(guī)?；B(yǎng)殖帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失，此外免疫系統(tǒng)抑制病病毒如PCV2、PRRSV也是導(dǎo)致PED控制難度增加的重要因素。目前，PED的防控主要靠PED-TGE二聯(lián)苗免疫。但是，隨著病毒的變異和進(jìn)化，現(xiàn)有疫苗免疫保護(hù)力呈下降趨勢(shì)。為防控豬流行性腹瀉疫病，研究安全、有效的疫苗刻不容緩。

細(xì)胞培養(yǎng)PEDV難度高，本實(shí)驗(yàn)在Vero細(xì)胞培養(yǎng)液中加入終濃度10 μg/mL的胰酶，從豬腹瀉糞便中分離出一株P(guān)EDV。并通過(guò)PT-PCR、細(xì)胞培養(yǎng)、動(dòng)物回歸試驗(yàn)等多種方法對(duì)該分離病毒進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，此分離株為豬流行性腹瀉病毒。通過(guò)對(duì)測(cè)序結(jié)果的遺傳進(jìn)化分析， 發(fā)現(xiàn)M基因比較保守，是研究PEDV遺傳演化的優(yōu)先選擇基因。有研究表明PEDV的變異主要集中在S 基因上[10]，該區(qū)核酸序列變異而引起氨基酸突變可能是病毒變異的主要原因。因此，比較不同病毒株P(guān)EDV S基因的親緣關(guān)系，對(duì)疫苗的研制及使用具有重要的意義。

紅色字體KB-4為本研究的分離株，藍(lán)色字體毒株為各亞型的代表毒株圖5 基于PEDV-S基因核苷酸序列的遺傳進(jìn)化分析

本研究分離的PEDV同時(shí)經(jīng)過(guò)核酸序列分析及遺傳進(jìn)化樹分析，發(fā)現(xiàn)分離毒株的S蛋白與疫苗株CV777同源性僅為9%，存在較大差異。而與JS-HZ2012毒株S基因同源性最高為99.5%，在遺傳進(jìn)化上屬于當(dāng)前流行毒株G2a亞群分支。因此，將其作為候選疫苗株，對(duì)于豬流行性腹瀉防控具有重要的實(shí)踐意義。

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(編輯：侯向輝)

Isolation and Identification of One Porcine Epidemic Diarrhea Virus Strains and Genetic Evolution Analysis

SUN Feng-ting1，SHI Hong-li2，GAO Xiao-cong3，DU En-qi4*

(1．ShaanxiNovaleverBiologicalTechnologyCoLtd，Yangling，Shaanxi712100，China；2．BeijingCanboleverBiologicalTechnologyCoLtd，Beijing100176，China；3．NantongAnimalDiseasePreventionandControlCenter，Nantong，Jiangsu226000，China；4．NorthwestA&FUniversity，Yangling，Shaanxi712100，China)

The anal swab and feces for the onset of piglets, and dead piglets intestine were gathered from 26 pig farms which were suspected porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) infection in Shaanxi area. Then the samples were subcultured by vero cell line in the case of adding the pancreatic enzyme, until the syncytial cells showed typical pathological changes. By methods of RT-PCR detection, sequence analysis, gene comparison and animal regression experiment, one PEDV virulent strain was confirmed. After sequence alignment analysis and genetic evolution analysis of S gene, results showed that there was low homology between the isolated strain and vaccine strains CV777, and evolutionary branch was located in the current popular PEDV G2a subgroup.

porcine epidemic diarrhea virus；isolation and identification；S gene

孫豐延，碩士，從事獸用生物制品研究。

2016-08-12

A

1002-1280 (2016) 10-0010-05

S852.65