林燁，呂英軍，張曉輝，蘇亞楠，唐姝，孫嘉瑞，趙其嶺，栗建盛，劉愛(ài)玲，孟小賓，鮑恩東*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.瑞普(天津)生物技術(shù)股份有限公司，天津 300300)

替米考星腸溶顆粒對(duì)豬的安全性試驗(yàn)

林燁1，呂英軍1，張曉輝1，蘇亞楠1，唐姝1，孫嘉瑞1，趙其嶺1，栗建盛1，劉愛(ài)玲2，孟小賓2，鮑恩東1*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.瑞普(天津)生物技術(shù)股份有限公司，天津 300300)

為了客觀評(píng)價(jià)替米考星腸溶顆粒臨床應(yīng)用于豬的安全性，選取40頭25日齡健康三元雜交豬，隨機(jī)將其分成4組，每組10頭，分別以1倍、3倍、5倍推薦劑量的替米考星腸溶顆粒拌料給藥45 d，試驗(yàn)期內(nèi)對(duì)受試豬進(jìn)行血常規(guī)、血凝、血生化、尿常規(guī)、增重、料重比、臟器系數(shù)等指標(biāo)的測(cè)定及病理學(xué)檢查。結(jié)果顯示，替米考星腸溶顆粒對(duì)受試豬的血液學(xué)指標(biāo)、尿液指標(biāo)、主要生產(chǎn)性能等方面未造成明顯影響，說(shuō)明替米考星腸溶顆粒以5倍推薦劑量(2000 g/1000 kg)臨床應(yīng)用于豬是安全的。

替米考星；腸溶顆粒；安全性試驗(yàn)；豬

替米考星是大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，具有廣譜抗菌的特性，對(duì)豬的胸膜肺炎和乳腺炎具有良好的治療效果[1-3]，廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)中[4]。目前國(guó)內(nèi)、外上市應(yīng)用的替米考星劑型主要為注射劑和預(yù)混劑，但這兩種劑型在使用過(guò)程中均存在一些缺憾[5]。如替米考星注射液在水中溶解度低，注射使用時(shí)費(fèi)力且容易引起豬的應(yīng)激反應(yīng)；替米考星預(yù)混劑味苦且對(duì)酸不穩(wěn)定，口服后易被胃酸所破壞[4-6]。因此，替米考星注射液和預(yù)混劑在獸醫(yī)臨床應(yīng)用上均存在一定的局限性。為了彌補(bǔ)上述缺陷，研發(fā)了替米考星腸溶顆粒，該劑型具有有效防止替米考星在胃酸中被破壞，使藥物有足夠時(shí)間到達(dá)腸道被吸收，明顯提高生物利用度，同時(shí)也可改善適口性等特點(diǎn)[7]。為了評(píng)價(jià)替米考星腸溶顆粒臨床應(yīng)用于豬是否安全，試驗(yàn)依據(jù)農(nóng)業(yè)部《獸藥研究技術(shù)指導(dǎo)原則匯編》以及《VICH獸藥靶動(dòng)物安全性研究指導(dǎo)原則概述》[8]有關(guān)規(guī)定，通過(guò)不同劑量拌料給藥的方式開(kāi)展替米考星腸溶顆粒對(duì)豬的安全性試驗(yàn)，為其臨床用藥提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)藥品 替米考星腸溶顆粒(批號(hào)150901，含替米考星有效成分20%)由瑞普(天津)生物藥業(yè)有限公司提供，推薦劑量為200～400 g/1000 kg飼料(以替米考星計(jì))。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 25日齡的普通級(jí)健康三元雜交豬40頭，購(gòu)自江蘇省南京市某規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)。

1.1.3 儀器設(shè)備 全自動(dòng)生化分析儀(日立7180)為日本日立公司產(chǎn)品；全自動(dòng)血凝分析儀(CA 1500)日本SYSMEX公司產(chǎn)品；血球分析儀(MEK-7222)為日本光電公司產(chǎn)品； 尿常規(guī)分析儀(COMBISCAN 500)為德國(guó)科寶公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)分組及處理 將40頭受試豬隨機(jī)分為4組，分別為替米考星腸溶顆粒1倍推薦劑量組(400 g/1000 kg飼料)、3倍推薦劑量組(1200 g/1000 kg飼料)、5倍推薦劑量組(2000 g/1000 kg飼料)和空白對(duì)照組，每組均為10頭。試驗(yàn)期間各藥物劑量組拌料給藥，空白對(duì)照組飼喂正常不含任何藥物的飼料，所有受試豬均自由采食和飲水，試驗(yàn)周期為45 d。

1.3 樣品的采集與處理 給藥前通過(guò)豬前腔靜脈采血的方式采集各組受試豬的血液(分為加EDTA抗凝的血液2 mL，加枸櫞酸鈉抗凝的血液2 mL和加促凝劑的血液5 mL)及尿液5 mL。采樣時(shí)，使豬仰臥保定，在豬的第一肋骨與胸骨柄結(jié)合處的前側(cè)方的明顯凹陷處，用75%的酒精棉球消毒后，取5mL注射器以與水平面呈約60°的角度平穩(wěn)緩慢進(jìn)針，慢慢拉動(dòng)活塞抽取血液，采血完畢后用消毒棉球按壓進(jìn)針處，迅速拔出注射器，壓迫片刻以防出血。樣品采集后，立即進(jìn)行檢測(cè)。給藥23 d和給藥45 d時(shí)再次按照上述方法對(duì)受試豬逐頭采樣。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)宰殺所有受試豬，肉眼觀察肝、脾、肺、腎等內(nèi)臟器官病變情況并稱重，然后取部分臟器組織于10%中性福爾馬林溶液中固定以備制作石蠟切片。試驗(yàn)期間，每天觀察受試豬的臨床癥狀，包括精神狀況、行為、呼吸和飲食等，每周測(cè)兩次體溫。給藥前、后分別稱量每頭豬的體重。

1.4 檢測(cè)項(xiàng)目

1.4.1 血液常規(guī)指標(biāo)分析 取EDTA抗凝全血，用光電MEK-7222血球分析儀測(cè)定血液常規(guī)指標(biāo)。

1.4.2 血凝指標(biāo)分析 取枸櫞酸鈉抗凝全血，用SYSMEX CA 1500全自動(dòng)血凝分析儀測(cè)定血凝指標(biāo)。

1.4.3 血清生化指標(biāo)分析 取促凝血離心所得血清，用日立7180全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清生化指標(biāo)。

1.4.4 尿液常規(guī)指標(biāo)分析 取新鮮尿液，用COMBISCAN 500尿常規(guī)分析儀測(cè)定尿液常規(guī)指標(biāo)。

1.4.5 增重及料重比 根據(jù)給藥前、后受試豬的體重，計(jì)算每組受試豬的平均增重。根據(jù)各組的平均增重和飼料消耗量，計(jì)算每組料重比。

1.4.6 臟器系數(shù)分析 剖檢受試豬后分別取肝臟、脾臟、肺臟、腎臟稱重并計(jì)算臟器系數(shù)。

臟器系數(shù)=臟器重量/體重×100%

1.4.7 病理組織學(xué)檢查 將用10%中性福爾馬林溶液固定的肝臟、脾臟、肺臟、腎臟進(jìn)行常規(guī)石蠟切片，HE染色，觀察組織病理學(xué)變化。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 利用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)用單因素ANOVA分析方法進(jìn)行顯著性差異分析，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)的形式表示，*和**分別表示各藥物試驗(yàn)組與空白對(duì)照組差異顯著(P<0.05)和差異極顯著(P<0.01)。

2 結(jié)果

2.1 受試豬的臨床表現(xiàn) 各試驗(yàn)組受試豬在用藥過(guò)程中無(wú)明顯的異常臨床表現(xiàn)，其行為、呼吸、飲食以及體溫等均正常。

2.2 血液常規(guī)指標(biāo)分析 各組受試豬在用藥前1 d、用藥23 d和用藥45 d時(shí)血液常規(guī)指標(biāo)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 血液常規(guī)測(cè)定結(jié)果

續(xù)表1

從表1可以看出，用藥45 d時(shí)，3倍劑量組與5倍劑量組受試豬的中性粒細(xì)胞百分比與空白對(duì)照組相比有顯著的升高；用藥23 d時(shí)，1倍劑量組、3倍劑量組受試豬的單核細(xì)胞數(shù)與空白對(duì)照組受試豬相比有顯著增加，但5倍劑量組與空白對(duì)照組受試豬相比卻并無(wú)顯著性差異，說(shuō)明該差異并非口服替米考星腸溶顆粒所造成。用藥23 d和用藥45 d時(shí)，1倍劑量組受試豬的嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)與空白對(duì)照組相比有顯著增加，但3倍劑量組、5倍劑量組與空白對(duì)照組受試豬相比則沒(méi)有顯著性差異。需要強(qiáng)調(diào)的是，依據(jù)參考資料[9-10]可知，所有受試豬血液中盡管有個(gè)別數(shù)值偏高，但其檢測(cè)值均在正常數(shù)值范圍內(nèi)。說(shuō)明口服替米考星腸溶顆粒并不會(huì)造成受試豬血液常規(guī)數(shù)值的顯著改變。

2.3 血凝指標(biāo)分析 各組受試豬在用藥前1 d、用藥23 d和用藥45 d時(shí)的血凝指標(biāo)結(jié)果如表2所示。

表2 血凝指標(biāo)分析結(jié)果

由表2可知，替米考星腸溶顆粒用藥23 d時(shí)，1倍劑量組、3倍劑量組受試豬的凝血酶原時(shí)間與空白對(duì)照組相比出現(xiàn)顯著降低(P<0.05)，但用藥45 d時(shí)各用藥劑量組的各項(xiàng)指標(biāo)與空白對(duì)照組受試豬相比均不存在差異(P>0.05)，說(shuō)明受試豬出現(xiàn)的該差異并非口服替米考星腸溶顆粒所造成。

2.4 血清生化指標(biāo)分析 各組受試豬在用藥前1 d、用藥23 d和用藥45 d時(shí)的血清生化指標(biāo)結(jié)果如表3所示。

表3 血清生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

續(xù)表3

由表3可知，用藥23 d時(shí)，3倍劑量組受試豬的肌酸激酶含量與空白對(duì)照組相比顯著升高(P<0.05)，但1倍劑量組、5倍劑量組受試豬與空白對(duì)照組相比則無(wú)顯著性差異；用藥45 d時(shí)，1倍劑量組受試豬的肌酸激酶含量與空白對(duì)照組相比極顯著升高(P<0.01)，但3倍劑量組、5倍劑量組與空白對(duì)照組受試豬相比卻無(wú)顯著性差異，說(shuō)明肌酸激酶含量的差異并非口服替米考星腸溶顆粒所致。用藥23 d時(shí)，5倍劑量組受試豬的葡萄糖量與空白對(duì)照組相比極顯著增加，這可能與進(jìn)食的飼料有關(guān)。用藥23 d時(shí)，3倍劑量組、5倍劑量組受試豬的尿素含量與空白對(duì)照組相比顯著升高，用藥45 d時(shí)，3倍劑量組受試豬的尿素?cái)?shù)值與空白對(duì)照組相比顯著升高，但其5倍劑量組與空白對(duì)照組受試豬相比則不存在顯著性差異，說(shuō)明該差異性變化并非口服替米考星腸溶顆粒所致。根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的參考資料可知，雖然上述用藥組受試豬的某些指標(biāo)與空白對(duì)照組受試豬相比存在差異性改變，但所有檢測(cè)值均在文獻(xiàn)所提到的正常范圍內(nèi)[11]。

2.5 尿液常規(guī)指標(biāo)分析 各組受試豬在用藥前1 d、用藥23 d和用藥45 d時(shí)的尿液常規(guī)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果如表4所示。

表4 尿液常規(guī)測(cè)定結(jié)果

續(xù)表4

a/10表示每組10個(gè)試驗(yàn)動(dòng)物中，該指標(biāo)的陽(yáng)性檢出個(gè)體數(shù)為a。

由表4可知，替米考星腸溶顆粒使用前后，各劑量用藥組受試豬尿液中所檢測(cè)的各項(xiàng)指標(biāo)與空白對(duì)照組相比均無(wú)顯著差異(P>0.05)；各劑量用藥組受試豬的各項(xiàng)指標(biāo)中的陽(yáng)性個(gè)體檢出數(shù)所占比例與空白對(duì)照組相比也無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

2.6 增重及料重比分析 各組受試豬在用藥前和用藥45 d后的增重及料重比結(jié)果如表5所示。

表5 增重及料重比統(tǒng)計(jì)結(jié)果

由表5可知，各劑量用藥組受試豬的平均增重和料重比與空白對(duì)照組受試豬相比均無(wú)顯著差異,說(shuō)明替米考星腸溶顆粒的使用對(duì)豬的增重?zé)o不良影響。

2.7 臟器系數(shù)分析 替米考星腸溶顆粒給藥45 d后，剖殺所有受試豬，分別對(duì)各組的心、肝、脾、肺、腎進(jìn)行稱重并計(jì)算臟器系數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 臟器系數(shù)結(jié)果

由表6可知，各用藥組受試豬的臟器系數(shù)與空白對(duì)照組相比無(wú)顯著差異。說(shuō)明替米考星腸溶顆粒以推薦劑量(400 g/1000 kg)至5倍推薦劑量(2000 g/1000 kg)應(yīng)用于豬對(duì)其遺傳品質(zhì)無(wú)影響，使用安全。2.8 病理學(xué)檢查 試驗(yàn)結(jié)束后，剖殺所有受試豬，未見(jiàn)明顯的臟器肉眼異常和可疑病變。主要臟肝、脾、肺、腎也均未見(jiàn)明顯的病理組織學(xué)變化(圖1-圖4)。

A:空白對(duì)照組；B:1倍推薦劑量組；C:3倍推薦劑量組；D:5倍推薦劑量組圖1 使用替米考星腸溶顆粒后受試豬肝臟的組織病理學(xué)結(jié)果(HE染色, ×20)

A:空白對(duì)照組；B:1倍推薦劑量組；C:3倍推薦劑量組；D:5倍推薦劑量組圖2 使用替米考星腸溶顆粒后受試豬脾臟的組織病理學(xué)結(jié)果(HE染色, ×20)

A:空白對(duì)照組；B:1倍推薦劑量組；C:3倍推薦劑量組；D:5倍推薦劑量組圖3 使用替米考星腸溶顆粒后受試豬肺臟的組織病理學(xué)結(jié)果(HE染色, ×20)

A:空白對(duì)照組；B:1倍推薦劑量組；C:3倍推薦劑量組；D:5倍推薦劑量組圖4 使用替米考星腸溶顆粒后受試豬腎臟的組織病理學(xué)結(jié)果(HE染色, ×20)

3 討論

本試驗(yàn)從血常規(guī)指標(biāo)、血凝指標(biāo)、血清生化指標(biāo)、尿液常規(guī)指標(biāo)、增重及飼料報(bào)酬、臟器系數(shù)、組織病理學(xué)檢查等多方面對(duì)受試豬進(jìn)行了1倍、3倍、5倍推薦劑量替米考星腸溶顆粒的安全性比較試驗(yàn)和分析。結(jié)果顯示，替米考星腸溶顆粒從1倍推薦劑量(400 g/1000 kg)至5倍推薦劑量(2000 g/1000 kg)臨床應(yīng)用于豬后，對(duì)其生理生化指標(biāo)并未產(chǎn)生顯著影響，因此使用該藥物是安全可靠的。而且結(jié)果也顯示，喂服1倍、3倍、5倍推薦劑量的替米考星腸溶顆粒不會(huì)影響豬的增重，對(duì)豬的主要生產(chǎn)性能不產(chǎn)生影響。

通過(guò)對(duì)受試豬血液常規(guī)檢測(cè)的分析，盡管發(fā)現(xiàn)個(gè)別用藥劑量組受試豬血液中的中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)值發(fā)生了沒(méi)有規(guī)律性的改變，與空白對(duì)照組受試豬相比存在顯著的差異，但其變動(dòng)的數(shù)值仍然處在正常數(shù)值范圍內(nèi)[9-10]，顯然這些數(shù)值的改變與投服替米考星腸溶性顆粒無(wú)關(guān)，推測(cè)該變化可能是由于白細(xì)胞數(shù)量隨動(dòng)物生理狀況而出現(xiàn)的變化，亦或是由于劇烈運(yùn)動(dòng)、進(jìn)食和疼痛時(shí)出現(xiàn)增多的[12-13]。在受試豬的尿常規(guī)檢測(cè)相中，各劑量組受試豬中存在尿檢呈尿膽素原、膽紅素陽(yáng)性的個(gè)體，這可能是由于檢測(cè)結(jié)果只能定性而不能定量，而豬的尿液在正常情況下也會(huì)含有微量的尿膽素原及膽紅素的緣故[13]。另外，陽(yáng)性個(gè)體的存在也可能與采尿前的禁食時(shí)間短有關(guān)[14]。同時(shí)，我們?cè)诓±斫M織學(xué)檢測(cè)中并未觀察到受試豬的腎臟有明顯的病理組織學(xué)損傷，受試豬尿膽素原、膽紅素陽(yáng)性個(gè)體的這些改變應(yīng)該與藥物投服無(wú)關(guān)。

研究表明，替米考星腸溶顆粒毒性小，以1倍至5倍推薦劑量(2000 g/1000 kg)臨床應(yīng)用于豬是安全可靠的。另外，由于三元豬的正常生理生化指標(biāo)尚缺乏系統(tǒng)報(bào)道，本試驗(yàn)所測(cè)得的指標(biāo)可為今后研究三元豬的血液學(xué)、尿液學(xué)指標(biāo)提供參考依據(jù)。

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(編輯：陳希)

The Safety Test of Enteric-coated Tilmicosin Pellets in Swine

LIN Ye1，LV Ying-jun1，ZHANG Xiao-hui1，SU Ya-nan1，TANG Shu1，SUN Jia-rui1，ZHAO Qi-ling1，LI Jian-sheng1，LIU Ai-ling2，MENG Xiao-bing2，BAO En-dong1*

(1.NanjingAgriculturalUniversity，Nanjing210095，China; 2.RuiBiologicalTechnologyCo.,LTD，Tianjin300300，China)

To evaluate the safety of enteric-coated tilmicosin pellets in swine, forty 25-day old piglets were selected. They were separated into 4 groups randomly, 10 piglets each group. They were fed with one fold, three folds and five folds of recommended dose of enteric-coated tilmicosin pellets which were added into pig feed for 45 consecutive days, respectively. The complete blood count, blood coagulation test, blood biochemical test, urinalysis, gain in body weight, ratio of feed to body gain, ratio of organ weight to body weight and histopathological examinations were performed during the experiment. The results showed that no significant difference was found in all measured parameters between enteric-coated tilmicosin pellets-treated groups and control group, indicating that the enteric-coated tilmicosin pellets have low toxicity and are safe to be used in swine under the five folds of recommended dosage (2000 g/1000 kg)．

tilmicosin; enteric-coated pellets; safety test; swine

林燁，碩士研究生，從事獸醫(yī)病理學(xué)方面研究。E-mail：2015807120@njau.edu.cn

2016-08-29

A

1002-1280 (2016) 10-0022-10

S859.79