陸春波，王霞，張航俊，穆琳

(1.浙江省獸藥飼料監(jiān)察所，杭州310012；2.浙江國(guó)邦藥業(yè)有限公司，浙江紹興312500)

梯度洗脫HPLC法測(cè)定環(huán)丙氨嗪有關(guān)物質(zhì)

陸春波1，王霞2，張航俊1，穆琳1

(1.浙江省獸藥飼料監(jiān)察所，杭州310012；2.浙江國(guó)邦藥業(yè)有限公司，浙江紹興312500)

建立了梯度洗脫HPLC法測(cè)定環(huán)丙氨嗪有關(guān)物質(zhì)。采用Agilent Eclipse plus C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，流動(dòng)相A為0.02 mol/L醋酸銨溶液，流動(dòng)相B為甲醇，線(xiàn)性梯度洗脫，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為213 nm。試驗(yàn)結(jié)果顯示,環(huán)丙氨嗪與已知5種雜質(zhì)峰完全分離。本方法簡(jiǎn)單靈敏，可用于環(huán)丙氨嗪中有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)。

環(huán)丙氨嗪;有關(guān)物質(zhì);梯度洗脫HPLC

環(huán)丙氨嗪，化學(xué)名為2-環(huán)丙氨基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪，是FDA和EPA(美國(guó)環(huán)境保護(hù)協(xié)會(huì))于1974年正式批準(zhǔn)生產(chǎn)的新型殺蟲(chóng)劑，1975年在美國(guó)上市，商品名為Cyromazine，美國(guó)藥典[1]收載此產(chǎn)品。1999年9月我國(guó)批準(zhǔn)1%的環(huán)丙氨嗪預(yù)混劑在我國(guó)上市[2]，環(huán)丙氨嗪標(biāo)準(zhǔn)收載于《獸藥國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(化學(xué)藥品、中藥卷第一冊(cè))》[3]，采用2個(gè)薄層色譜的方法來(lái)控制有關(guān)物質(zhì)。本試驗(yàn)建立

了梯度洗脫HPLC法測(cè)定環(huán)丙氨嗪有關(guān)物質(zhì)，以期為修訂環(huán)丙氨嗪質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)做技術(shù)儲(chǔ)備。

1 材料

1.1 儀器 Waters 2695 高效液相色譜儀，配Waters 2996二極管陣列檢測(cè)器，美國(guó)Waters公司； XS-205電子天平(感量0.01 mg)，瑞士METTLER TOLEDO公司；KQ-500E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試劑與材料 甲醇為色譜純，Merck 公司，其余試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為milli-Q超純水。環(huán)丙氨嗪(批號(hào)為130729-1、131005-2、131006-1、131008-1)，由浙江甲公司生產(chǎn)；環(huán)丙氨嗪(批號(hào)為212025)，由上海乙公司生產(chǎn)；環(huán)丙氨嗪(批號(hào)為20130401)，由山東丙公司生產(chǎn)。環(huán)丙氨嗪對(duì)照品(批號(hào)H0501307，含量99.4%)，購(gòu)于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；2,4,6-三氨基三嗪(簡(jiǎn)稱(chēng)雜質(zhì)A)對(duì)照品，批號(hào)10907，含量99.5%，購(gòu)于Dr.E；2-氯-4,6-二氨基三嗪(簡(jiǎn)稱(chēng)雜質(zhì)B)對(duì)照品，批號(hào)H0530806，購(gòu)于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；6-氨基-2-氯-4-環(huán)丙氨基三嗪(簡(jiǎn)稱(chēng)雜質(zhì)C)對(duì)照品，批號(hào)H0550806，購(gòu)于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；2-氨基-4,6-雙環(huán)丙氨基三嗪(簡(jiǎn)稱(chēng)雜質(zhì)D)對(duì)照品，批號(hào)H0520806，購(gòu)于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；2,4,6-三環(huán)丙氨基三嗪(簡(jiǎn)稱(chēng)雜質(zhì)E)對(duì)照品，批號(hào)H0540806，購(gòu)于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

2 方法和結(jié)果

2.1 液相色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse plus C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以0.02 mol/L醋酸銨溶液為流動(dòng)相A，甲醇為流動(dòng)相B；檢測(cè)波長(zhǎng)213 nm；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min。梯度洗脫見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫表

2.2 溶液配制

2.2.1 供試品溶液 精密稱(chēng)取環(huán)丙氨嗪供試品20 mg，置50 mL容量瓶中，加0.02 mol/L醋酸銨溶液-甲醇(80∶20)適量，超聲10 min，冷卻，加0.02 mol/L醋酸銨溶液-甲醇(80∶20)稀釋至刻度，作為供試品溶液。2.2.2 對(duì)照溶液配制 精密量取上述供試品溶液1 mL，置200 mL容量瓶中，加0.02 mol/L醋酸銨溶液-甲醇(80∶20)稀釋至刻度，作為對(duì)照溶液。2.2.3 混合對(duì)照品溶液 分別精密稱(chēng)取雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E和環(huán)丙氨嗪的對(duì)照品各10 mg，分別置100 mL容量瓶中，加0.02 mol/L醋酸銨溶液-甲醇(40∶60)溶解并稀釋至刻度；精密量取上述溶液各2 mL，置同一50 mL容量瓶中，加0.02 mol/L醋酸銨溶液-甲醇(80∶20)稀釋至刻度，作為混合對(duì)照品溶液。

2.3 專(zhuān)屬性 量取空白溶液和混合對(duì)照品溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，考察環(huán)丙氨嗪與5種雜質(zhì)的分離度，結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，在上述色譜條件下，空白溶液對(duì)雜質(zhì)沒(méi)有干擾，環(huán)丙氨嗪峰和相鄰雜質(zhì)峰(雜質(zhì)B)的分離度為18.6，同時(shí)供試品溶液中雜質(zhì)峰的保留時(shí)間與混合對(duì)照品溶液中雜質(zhì)峰的保留時(shí)間一致。出峰順序依次為雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、環(huán)丙氨嗪、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D和雜質(zhì)E。

2.4 檢測(cè)限和定量限 按照信噪比S/N≥3的判斷指標(biāo)，雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E的檢測(cè)限分別為0.2、0.2、0.1、0.1、0.1 μg/mL。按照信噪比S/N≥10的判斷指標(biāo)，雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E的定量限為0.6、0.6、0.3、0.3、0.3 μg/mL。雜質(zhì)對(duì)照品A標(biāo)有含量，其他雜質(zhì)對(duì)照品沒(méi)有標(biāo)示含量，檢測(cè)限和定量限的測(cè)定時(shí)雜質(zhì)對(duì)照品的含量均以100%計(jì)。2.5 樣品的測(cè)定 精密量取供試品溶液、對(duì)照溶液、混合對(duì)照品溶液各10 μL分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。按此方法對(duì)3家企業(yè)6批次的環(huán)丙氨嗪樣品進(jìn)行了檢測(cè)，經(jīng)與有關(guān)物質(zhì)混合對(duì)照品溶液的保留時(shí)間對(duì)照，確定浙江甲公司檢出雜質(zhì)C和雜質(zhì)D，上海乙公司檢出雜質(zhì)A 和雜質(zhì)D，山東丙公司檢出雜質(zhì)B和雜質(zhì)D。供試品溶液中雜質(zhì)A、雜質(zhì)B和雜質(zhì)D 的峰面積均不大于對(duì)照溶液主峰峰面積的4倍(2.0%)，供試品溶液中雜質(zhì)C和雜質(zhì)E的峰面積均不大于對(duì)照溶液主峰峰面積的0.5倍(0.25%)，結(jié)果見(jiàn)表2。

A.雜質(zhì)A；B.雜質(zhì)B；C.雜質(zhì)C；D.雜質(zhì)D；E.雜質(zhì)E；HBAQ.環(huán)丙氨嗪圖1 空白溶劑色譜圖(1)、混合對(duì)照品溶液色譜圖(2)、供試品溶液(0.4 mg/mL)色譜圖(3)和對(duì)照溶液(2.0 μg/mL)色譜圖(4)

有關(guān)物質(zhì)130729-1131005-2131006-1131008-120202520130401-1雜質(zhì)A未檢出未檢出未檢出未檢出17932未檢出雜質(zhì)B未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出7560雜質(zhì)C14771280481898731100未檢出未檢出雜質(zhì)D5812933623376184336226657941952雜質(zhì)E未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出1/200主峰8908390076843269017285120834571/200主峰0．5倍4454245038421634508642560417281/200主峰4倍356332360304337304360688340480333828

3 討論

《獸藥國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(化學(xué)藥品、中藥卷第一冊(cè))》(農(nóng)業(yè)部1960號(hào)公告)收載有2個(gè)環(huán)丙氨嗪質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，有關(guān)物質(zhì)檢查均采用薄層色譜法，第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)采用5種雜質(zhì)對(duì)照品的對(duì)照法，第二個(gè)標(biāo)準(zhǔn)采用自身對(duì)照法。查詢(xún)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，這2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)定結(jié)果基本一致，可以用自身對(duì)照替代對(duì)照品對(duì)照的方法[4]。本試驗(yàn)只對(duì)已知雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D和雜質(zhì)E進(jìn)行了考察，限度參照《獸藥國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(化學(xué)藥品、中藥卷第一冊(cè))》收載的第二個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，雜質(zhì)A、雜質(zhì)B和雜質(zhì)D的斑點(diǎn)顏色不得過(guò)對(duì)照溶液的主斑點(diǎn)(2%)；雜質(zhì)C和雜質(zhì)E的斑點(diǎn)顏色不得過(guò)對(duì)照溶液的主斑點(diǎn)(0.25%)。本試驗(yàn)采用液相色譜的自身對(duì)照法，因?qū)φ杖芤簼舛葹楣┰嚻啡芤簼舛鹊?/200，故限度設(shè)為“供試品溶液中如有雜質(zhì)峰，雜質(zhì)A、雜質(zhì)B和雜質(zhì)D 的峰面積均不得大于對(duì)照溶液主峰面積的4倍(2.0%)，供試品溶液中雜質(zhì)C和雜質(zhì)E的峰面積均不得大于對(duì)照溶液主峰面積的0.5倍(0.25%)?！?/p>

采用DAD在200～400 nm進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，考察雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E各雜質(zhì)的混合溶液在200～400 nm的紫外吸收情況，最大吸收波長(zhǎng)分別為205.0、208.5、214.4、213.2、220.3 nm。均在205～220 nm之間，最后確定測(cè)定波長(zhǎng)為214 nm。

由于5種雜質(zhì)極性差別很大，采用等度洗脫0.02 mol/L醋酸銨溶液-甲醇(80∶20)，雜質(zhì)E出峰時(shí)間超過(guò)60 min；采用等度洗脫0.02 mol/L醋酸銨溶液-甲醇(50∶50)，雜質(zhì)A、雜質(zhì)B與環(huán)丙氨嗪不能完全分離；采用本文的梯度洗脫方法，使得環(huán)丙氨嗪與相鄰雜質(zhì)B完全分離，各雜質(zhì)的出峰時(shí)間相對(duì)較慢，各雜質(zhì)峰間的分離更好。

由于環(huán)丙氨嗪的生產(chǎn)工藝不同，各企業(yè)在合成環(huán)丙氨嗪的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生不同的有關(guān)物質(zhì)，本試驗(yàn)所檢測(cè)的3家企業(yè)檢出的雜質(zhì)種類(lèi)不同。建議企業(yè)可根據(jù)合成工藝確定雜質(zhì)種類(lèi)，制定內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)。

[1] The United States PharmacopeialConventipon. U. S. Pharmacopeia 36th Revision[S].

[2] 寧章勇. 新型獸藥-環(huán)丙氨嗪[J]. 獸藥與飼料添加劑, 2001, 6(4): 18-19.

[3] 中國(guó)獸藥典委員會(huì).獸藥國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(化學(xué)藥品、中藥卷第一冊(cè))[S].

[4] 趙富華. 薄層色譜法檢測(cè)環(huán)丙氨嗪中5種有關(guān)物質(zhì)[J]. 中國(guó)獸藥雜志, 2004, 38 (12):13-15.

(編輯：侯向輝)

Gradient HPLC Determination of Related Substances in Cyromazine

LU Chun-bo1, WANG Xia2, ZHANG Hang-jun1, MU Lin1

(1.ZhejiangProvinceInstituteofVeterinaryDrugandFeedstuff,Hangzhou310012,China；2.ZhejiangGuobangPharmaceuticalCoLtd,Shaoxing，Zhejiang312500,China)

To develop a gradient HPLC method for the determination of related substance in cyromazine，the chromatographic column was Agilent Eclipse plus C18(250 mm ×4.6 mm, 5 μm) was used, the mobile phase consisted of 0.02 mol/L ammonium acetate (A) and methanol (B)with gradient program. The flow rate was 1.0 mL/min. The detection wavelength was at 213 nm. The results showed good separation of cyromazine from five impurities. The method is simple and sensitive for the impurity detection of cyromazine.

cyromazine; related substances; gradient HPLC

陸春波，高級(jí)獸醫(yī)師，從事獸藥檢驗(yàn)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。E-mail: 2586064747@qq.com

2016-04-07

A

1002-1280 (2016) 06-0048-04

S859.83